利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白

摘要

本发明在证明透明颤菌血红蛋白基因(vgb)启动子在链霉菌中无作用后,构建了一个能在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白(VHb)的质粒pFW201,将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)启动子去掉后插入链霉菌质粒pIJ702上ORF438启动子下游,去掉ORF438启动子和透明颤菌血红蛋白基因之间含ATG的DNA片段,再将这一嵌合基因克隆至pIJ699,得到能有效表达透明颤菌血红蛋白,并能经胰蛋白胨诱导的质粒pFW201。

说明书

本发明涉及一类能在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla haemoglobin，VHb)的质粒，属于生物工程领域。

链霉菌及相近的菌用来生产许多种抗生素，如四环素、红霉素等。高密度链霉菌发酵物的高粘度特性使抗生素生产过程中的供氧成为一个主要问题。作为次生代谢物，抗生素的合成通常对氧气的供给又十分敏感。以前主要通过反应器的优化、通富氧空气和添加某些氧气助溶剂来满足微生物的氧耗。

1988年，由原核的透明颤菌(Vitreoscilla spp.)克隆到透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla haemoglobin gene，vgb)，并在大肠杆菌中进行了表达，研究了其低氧诱导的特性。在大肠杆菌和真菌系统中证明导入vgb基因可在细胞水平改善供氧和提高产生ATP的效率。Magnolo等在天蓝链霉菌及变青链霉菌中表达了VHb，结果表明将vgb引入好氧的工业微生物中能起到更有效地利用氧，降低能耗，促进生长，增加产品产量的有益作用。但是Magnolo等构建的表达质粒pWLD5和pWLD10不能确切地说明vgb表达的关键问题：vgb基因启动子在链霉菌中能否起作用，VHb的表达不能通过诱导达到更高的水平，质粒上含过多的非必要异源基因片段也降低了其实用性。本发明中以质粒pIJ4083-pro(本发明构建)证明了vgb天然的启动子在变青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24中不起作用。

本发明旨在提供一种能够在链霉菌中高水平表达血红蛋白的基因工程质粒。本发明的目的是这样实现的：将vgb基因(D.A.Webster博士惠赠)的天然启动子去掉，插入异源启动子下游后得到能有效表达VHb的质粒。具体地说是将去掉天然启动子的vgb基因克隆到质粒pIJ702(焦瑞身先生惠赠)上ORF438(开放阅读框架438)内的Sph I-Bg1II位点，与ORF438同向，得到pIJ702-vgb′。Sph I位点内的ATG正好是ORF438的翻译启始密码，进一步去掉ORF438启动子与vgb ORF(血红蛋白基因开放阅读框架)之间含ATG的DNA片段，将二者连成嵌合基因，得到质粒pFW2。再将此嵌合基因克隆至链霉菌质粒pIJ699(焦瑞身先生惠赠)得到质粒pFW201。本发明构建的质粒pFW201上，pIJ699所带的终止子消除了质粒上其他基因片段对ORF438启动子表达的影响。此启动子可用胰蛋白胨诱导，pFW201应可在需要时达到更高的VHb表达水平。这几个VHb表达质粒均不含除vgb之外的非链霉菌DNA片段，同时去掉了vgb 5′和3′端的多余片段，从而降低了被宿主菌限制的可能性。将该质粒引入用于抗生素生产的链霉菌，能较大幅度提高抗生素产量，降低能耗。

在以下实施例中对发明作进一步的详细描述：

图1是质粒pIJ4083-pro的构建示意图。

图2是质粒pOK12-vgb′的构建示意图。

图3是质粒pFW201的构建示意图。

图4是变青链霉菌TK24中表达VHb活力图。其中a.TK24/pIJ702作为阴性对照，b.TK24/pFW201

图中：Amp为氨苄青霉素抗性基因，tsr为硫链丝菌素抗性基因，xylE为邻苯二酚2，3-双加氧酶基因，Km为卡那霉素抗性基因，mel为酪氨酸酶基因，P_ORF438为开放阅读框架438启动子，ter为终止子，Aat II、Afl II、BamH I、Bcl I、Bgl II、EcoR I、EcoR V、Hind III、Sph I等为限制性内切酶，OD为光密度，nm为纳米。

实施例1，质粒pIJ4083-pro的构建。

参见图1。pUC21-vgb(本实验室保存)上含vgb基因的透明颤菌DNA片段长约1.4kb，方向为Hind III到BamH I，Hind III与Afl II之间为启动子，Afl II与Aat II之间为ORF。将pUC21-vgb上1.4kb的Hind III-BamH I片段切下，与同样酶切的起动子探针质粒pIJ4083(邓子新先生惠赠)用T4 DNA连接酶连接，转化变青链霉菌TK24(朱宝泉先生惠赠)后得到pIJ4083-vgb，BamH I和Afl II双酶切pIJ4083-vgb，Klenow酶补平，冻融法回收大片段，T4 DNA连接酶连接后转化TK24得到pIJ4083-pro。

实施例2，vgb启动子在TK24中无功能。

向TK24/pIJ4083-pro在R₂YE平板上长出的菌落滴加0.2mol/L邻苯二酚不显黄色，即无xylE基因编码的邻苯二酚2，3-双加氧酶活力；培养TK24/pIJ4083-pro至对数中期后以保鲜膜封口实现低氧诱导，12小时后真空抽滤收集菌体，悬浮于100mmol/L、pH7.5的磷酸缓冲液中，于4℃超声破碎，10,000转/分离心10分钟后取上清。收集菌体制成无细胞抽提液。取3ml无细胞抽提液，加入5μl 0.2mol/L邻苯二酚溶液，避光于30℃保温10分钟，测定375nm处的光吸收，未能测到邻苯二酚2，3-双加氧酶酶活，表明vgb启动子在TK24中不能带动xylE基因的转录，即无功能。

实施例3，质粒pOK12-vgb′的构建。

参见图2。以Afl II酶切pUC21-vgb，Klenow酶补平，再以BamH I酶切，冻融回收1.3kb的vgb′(去掉天然起动子的vgb基因称为vgb′)，与经BamH I和EcoR V双酶切的pWSK129(本实验室保存)以T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α(本实验室保存)后得到pWSK129-vgb′。Hind III和Aat II双酶切pWSK129-vgb′，冻融回收800bp的vgb′，与经Hind III和Aat II双酶切的pOK12(本实验室保存)以T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α后得到pOK12-vgb′。

实施例4，质粒pFW201的构建。

参见图3。Sph I和BamH I双酶切pOK12-vgb′，冻融回收800bp的vgb′片段并与SphI和Bgl II双酶切的pIJ702以T4 DNA连接酶连接，转化TK24后得到pIJ702-vgb′，HindIII和Sph I双酶切pIJ702-vgb′，T4 DNA多聚酶切平与补平大片段两端，T4 DNA连接酶连接后转化TK24得到pFW2，Bcl I酶切pFW2，冻融回收2.19kb的含ORF438启动子和vgb′的片段，EcoR I和Bgl II双酶切pIJ699，冻融回收5kb的Bgl II-Bgl II片断，将二者以T4 DNA连接酶连接，转化TK24后得到pFW201。(S.lividans TK24/pFW201，存放标记为CCTCC M 96007中国·武汉·武汉大学校内·中国典型培养物保藏中心)。

实施例5，含血红蛋白表达质粒的TK24中VHb活力的测定。

参见图4。同前制无细胞抽提液，以差分光谱法测定菌体中VHb的活力，经光谱扫描在420nm处有特征吸收峰者为有VHb表达。可见TK24/pFW201在420nm附近有吸收峰，即能检测到VHb活力，对照TK24/pIJ702没有。