用于分光光度法测定分析物的染料偶合对

摘要

一种染料偶合的化合物用于一种检验仪器中，该仪器包含一个试剂体系，可测定样品中分析物的存在或含量。试剂体系包括一种或多种酶，酶与分析物一起产生一种氧化剂，其量可作为样品中分析物含量的指示。入选的化合物是间-(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)-N-磺酰基苯磺酸-钠盐。

说明书

                     技术领域

本发明是关于一种检验仪器和方法，它应用于比色法测定水流体，如全血中的化学和生物化学组分(分析物)，并且，特别是关于用于该仪器和方法中的染料偶合对。

                    技术背景

有色水流体，尤其是有色生物流体，例如全血、尿和生物流体衍生物，如血清和血浆中的化学和生物化学组分的定量分析的重要性正在与日俱增。它主要应用于医疗诊断和治疗，以及药物、毒物和有害化合物的剂量的定量分析和类似工作。在某些实例中，被测定的物质的量是如此之小，如毫克/分升量级或更小或是难于精密地测定，因此要使用复杂的仪器和熟练的实验员才能胜任此项工作。在此种情况下，测定结果一般是取样以后几个小时或几天才能得到。在另外一些实例中，一般强调非专业操作人员在实验室外有能力随时、迅速和重现地进行测定，并快速、及时地出示信息。

血糖水平的测定是糖尿病患者的一种常规的医疗检验。现代的学说劝告糖尿病人每天测定2-7次血糖水平，测定次数根据患者的具体病情而定。依据从血糖水平检验结果所观察的病情，病人和医生一起商定饮食、锻炼和胰岛素的输入量，以便更有利于治病。显然，对于这种病人，信息应能及时知道。

在技术上，许多血糖检验方法和制品已众所周知，这些方法都有种种局限性。很多改进已被公开和申请专利权，其中Phillips等人的美国专利4,935,344、5,049,487、5,059,394和5,179,005，并已转让给本专利申请的同一受让人。

公开的和这些专利申报的方法包括，当被分析的流体被加入到用试剂浸过的惰性多孔基体的一边，并迁移到读数的一边，在那里分析物与试剂相互作用并产生一种吸光的反应产物，光反射比从这一边可以读到。试剂包括葡萄糖氧化酶，一种消耗样品中的葡萄糖而产生过氧化氢的酶；在另一种辣根过氧化物酶存在的条件下，过氧化氢氧化染料偶合对，即3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氢氯化物(MBTH)和3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)，产生蓝色染料。然后，分别用两束不同波长的入射光测量其光反射比。根据用LED-分光光度计测定的染料颜色的强度，血液中葡萄糖的浓度可以被确定。在我的共同待审的、共同转让的美国专利U.S.S.N、245,940，其提交日期为1994年5月19日，(LFS，30)，公开了一种染料偶合对，它们包括3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙的游离型或酸型(MBTH)和8-苯胺基-1-萘磺酸或其盐(ANS)，此染料偶合对用于代替上述的MBTH-DMAB染料偶合对。在氧化作用时，MBTH-ANS染料偶合对是微溶的，并因此提供更稳定的终点，它与氧化的MBTH-DMAB染料对相比，染料退色很少。

虽然在生产用于测定葡萄糖的存在或含量的检验仪器中，上述体系已被有效地应用，但已发现其一些缺点。含染料偶合对的检验仪器被设计适合于家用和专业应用，并被制造商和批发商出售，预期用户的存货持续一段时间，当然，在这段保存时间内，仪器必须保持有效。一个合适货架寿命的要求，使得在使用MBTH作为染料偶合对的组分进行产品配方时产生了困难。

首先，人们已经发现，MBTH的稳定性随着温度和碱度的升高而降低。MBTH的无酸型是易于升华的。为了克服这一点，优选的形式是MBTH的酸水化物，如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氢氯化物。很遗憾，这种酸水化物本身随着湿度的升高而变得不稳定，并且加热时很容易分解为MBTH的无酸型和HCl。再则，在高pH值时，它的稳定性低，MBTH与其配偶体进行氧化反应的效率也随着碱度的升高而降低，以至在高pH值时，该染料偶合对产生的颜色很淡或无色。

从这些相关性出发，在实施中，MBTH的加入量要很大，pH值要低，以减少其不稳定性和无效性。为了使该化合物降低升华，提高效率，pH值应选择在低于2.0。令人遗憾的是，对于这里讨论的体系，如此理想的低pH值不能被应用。如上所述，所用的试剂体系取决于与分析物作用并产生一定量的氧化剂的酶，该氧化剂量指示出被测定样品中的分析物含量。对MBTH试剂是理想的pH值，却完全不适合于酶，例如葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶。在此低pH值条件下，许多商品酶只有很低活性或无活性。因此，从技术方面不得不选择适中的pH值，如4，和过量试剂，以保证检验仪器在所要求的货架期内的有效性。

                     发明概述

按照本发明的教导，含酶的检验仪器中应加入一种高稳定性的组分作为染料偶合对之一员。与上述的那些检验仪器中的组分相反，在适合于高酶效率的pH值，这种组分能与各种偶合对有效地氧化。具体地讲，本发明的染料偶合对化合物是被用于一种含试剂体系的检验仪器中，该仪器用来分析样品中分析物的存在或含量，其中试剂体系包括一种或多种酶，在分析物存在时，体系产生定量的氧化剂，以指示样品中分析物的含量。按照上述说明，试剂体系还包括染料偶合对，它们能被产生的上述氧化剂所氧化，生成一种显色物质；染料偶合对包括化合物：结构式中，R选自烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基，杂环基、季胺基或有机酸部分；Y选自NO₂，SO₃-，H，卤素离子、烷基或SiZ₃，Z可以任选烷基或芳香基。优选的Y是H。在优选的实施例中，R是：其中，R₁、R₂和R₃分别选自下列基团：H、烷基、芳香基、甲硅烷基、卤离子、羟基、烃硫基、烷氧基、硫代烷氧基、胺基、磺酸根或羧酸根；X选自下列基团：胺基、磺酸根或羧酸根。在具体实施例中，检验仪被用于测定分析物的存在或含量，例如葡萄糖、胆固醇、醇、脲酸、甲醛或甘油-3-磷酸酯和常规检验中血样的分析物。在此情况下，酶体系将包含选自这样一组酶，其中包括葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、醇类氧化酶、脲酸酶、醛类氧化酶和甘油磷酸酯氧化酶；还有过氧化物酶或具有类似过氧化物酶活性的无机复合物，例如正高铁血红素、氯化血红素和〔磺基苯基〕卟啉锰。

选用的过氧化物酶是辣根过氧化物酶。

                    附图简述

图1是检验仪器实施例的透视图，其中包含一个反应基体，被分析的液体样品就加到基体上；和

图2是与图1相同仪器的另一个实施例的透视图。

                 发明详细讨论

如上所述，本发明包含改进的染料偶合对化合物，该化合物用在检验仪器之中，可以测定液体样品中分析物的存在或含量。参见图1，在本发明的一个优选实施例中，检验仪器包括一个多孔的基体(10)，其中掺入化学反应试剂体系，与支撑体(12)粘接。有一个穿过支撑体的圆孔(16)，借此可将液体样品施于基体(10)的样品接收面(17)。化学体系可与液体样品中的分析物相互作用，使基体的检验表面(19)显示光反射性质，指示出液体样品中的分析物含量。检验表面(19)可用裸眼读，但最好还是用光检验器来读。这种仪器的元件如图1所示，其中包括一个光源(18)，如发光二极管，以便将优选单一波长的光入射到检验表面(19)。另外还附有光检测器(20)，以便测定从表面(19)反射的光，并产生一个信号(22)，作为被检测光的量的指示，这种信号可用安装在读数装置中的微处理器处理，计算出样品中分析物的含量。

现在如上所述的体系已为本领域的技术人员所熟悉，并已被美国专利很好地阐述，这些美国专利号是4,935,346；5,049,487；5,059,394和5,179,005。这些体系企图把检验仪器与读数计连接，而后，样品如血液被加到样品接收表面(17)。图2表示另一种方式，先把血液加到样品表面(17)并接着测定表面(19)，显示在读数计上。在所有其他方面，图2中标号码的元件是与图1中的元件等同的。

检验表面的光反射性质随着分析物的量而改变，这种变化是由于液体样品中的分析物与多孔基体中的化学试剂发生一系列化学反应的结果。在特定情况下，基体包含有一种或多种酶，该酶与分析替代物一起产生过氧化氢或其他强氧化剂。基体之中含有染料偶合对，即可被氧化而生成能吸收一定波长的光的显色物质的两种化合物，吸光度与显色剂的量成正比。酶催化反应产生氧化剂，再与染料样品反应生成显色剂。

酶产生的氧化剂的选择和染料偶合对的选择在本领域内广泛地变化，并在很大程度上取决于具体要测定的分析物。例如，在测定血液样品中的胆固醇时，要加入一种氧化酶，如胆固醇氧化酶。同样，甲醇或乙醇的测定可加入醇类氧化酶；甲醛的测定可加入醛类氧化酶；或甘油醇-3-磷酸酯的测定可加入甘油磷酸酯氧化酶。这些酶催化反应的产物过氧化氢可能被随后的酶催化反应改性，产生活性氧化剂，该氧化剂再与染料偶合对反应产生显色剂。因此，例如产生活性氧化剂的过氧化氢的反应可能被辣根过氧化物酶催化。

因而，虽然人们可以理解，本发明公开的内容具有广泛的应用，但为了以下的讨论，把全血液体样品中的葡萄糖作为分析物的一个实例。优选的化学体系则以葡萄糖氧化酶为例，它和葡萄糖底物作用，产生过氧化氢。然后，过氧化氢被另一种酶，辣根过氧化物酶催化反应变为活性氧化剂。

如上所述，至今，被广泛地应用于有关葡萄糖的诊断检验中的染料对是3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氯化氢水合物(MBTH氯化氢水合物)(结构式I)和二甲基苯胺(结构式II)结合物：[O]＝过氧化氢/辣根过氧化物酶

如上所述，这种体系存在一些缺点。在加热和碱性条件下，MBTH甚至MBTH的氯化氢水合物是相当不稳定的。况且，在高酸度条件下，例如pH2或更低，以上反应是最有效的。遗憾的是，在这样的条件下，在检验仪器中应用的酶，例如葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶只有很低活性或无活性。因此，商业实践已指明，为了获得相对稳定的体系，最优的应用pH值是大约4，同时加入大量的酶和染料偶合对，以便弥补偶合反应中酶活性和氧化效率的降低问题。

按照本发明，已经发现MBTH的改性型可用以克服遇到的稳定性问题，并更进一步，它在更有利于检验仪器中所用的酶的活性的条件下，例如pH值范围大约4-7，能有效地反应。一些优选的衍生物已被发现，它们与要求的配偶如芳香胺，有高的反应性。本发明的衍生物具有结构通式(IV)：式中R选自烷基、取代烷基、芳香基，取代芳香基、杂环基、季胺基或有机酸根；Y选自NO₂，SO₃-，H，卤素离子，烷基或SiZ₃，Z是烷基或芳香基。优选的Y基团是H。在优选的实施例中，R是：式中的R₁、R₂和R₃分别选自H、烷基、芳香基、甲硅烷基、卤素离子、氢氧基、烃硫基、烷氧基、硫代烷氧基、胺基、磺酸根或羧酸根；X选自胺基、磺酸根或羧酸根。

本发明的MBTH衍生物能与广泛的染料配偶发生氧化反应，例如芳香胺、苯酚和取代苯酚。此外，在室温及pH范围4-11条件下，这一反应可以有效地进行。对于本发明优选的衍生物，氧化反应的最佳pH值范围为4-7，因此，反应对诊断化学中感兴趣的胺染料配偶特别有用，例如3-二甲基胺基苯甲酸和8-苯胺基-1-萘磺酸盐。

不象MBTH无酸型或MBTH酸水合物，这些衍生物是相当稳定的，甚至耐在100℃加热16小时。此外，在氧化反应条件下，过氧化物催化酶，如辣根过氧化物酶，对于氧化偶合反应是特别有效的。

例1-MBTH衍生物的合成

间-[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]-N-磺酰基苯磺酸-钠盐，[2]

合成路线：

                     材料

3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氢氯化物(MBTH·HCl)，NaI，四丁基氢氧化铵，二氯甲烷，和N-甲基-2-吡咯烷酮购自Aldrich公司(Milwankee，Wisconsin)并且使用时未经纯化。三乙胺是从BakerChemicals得到的，并批发自Baxter公司(Phillipsburg,New Jersey)。1，3-二氯亚砜基苯购自Fluka Chemicals(Ronkonkoma，New York)或Lancaster Chemicals(Windhan,New Hampshire)。

化合物(1)的合成

把4克MBTH·HCl加到150mlErlenmeyer烧瓶中，将搅拌磁子置入烧瓶，再加入50ml的N-甲基-2-吡咯烷酮和5ml三乙胺。烧瓶加上橡皮塞后，放在磁搅拌加热板上，剧烈搅拌，在60-70℃加热半小时，有黄色浆液生成。把烧瓶放在冰浴中冷却。

5克1，3-二氯亚砜苯加入到一个250ml的Erlenmeyer烧瓶中并放入一个磁搅拌条。把烧瓶浸在冰浴之中，再向烧瓶中加入20ml的N-甲基-2-吡咯烷酮，搅拌至所有固体溶解。(大约15分钟)。把前面获得的游离碱MBTH浆液倒入该溶液，所得浅黄色混合物在冰浴温度反应1个半小时。然后，加入10ml 2N HCl抑制反应，再在室温搅拌30分钟。向溶液中加入50毫克12目Norti(活性碳粒)，搅拌10分钟之后，呈淡黄色溶液。溶液经过细密玻璃砂漏斗抽滤。得到的滤液为黄至淡棕色均匀的溶液。向黄色溶液中加入300ml 2N HCl并搅拌，有浅白色粉状的沉淀生成。固体用真空过滤收集并用25ml去离子水洗涤三次。固体经过110℃真空干燥2小时，可得到5.6克浅白色的产物。产物经过¹H NMR和HPLC分析，其纯度为97％。

化合物〔1〕不容易溶于绝大多数常见有机溶剂和水。但是，它溶于碱性溶液和某些极性溶剂，例如DMSO，NMP和DMF。

化合物〔2〕的合成

把2.0克的化合物〔1〕粗样品加入到50ml的二氯甲烷中。向不断搅拌的悬浊液中用2分钟缓慢地加入4ml 1M四丁基氢氧化铵，悬浊液变为淡黄色溶液。溶液用10ml去离子水洗涤，再用无水硫酸钠干燥。硫酸钠用重力过滤除去，所得混合物用旋转蒸馏器蒸发至干。收集到的产物是一种深黄色油。用125ml丙酮将油从蒸馏器中提取出来，再向油溶液中滴加10ml 20％NaI丙酮溶液，在5分钟内加完。有白色沉淀出现。混合物再反应20分钟，然后，沉淀经过玻璃砂漏斗真空过滤收集。所得浅白色固体用20ml丙酮洗涤3次。在110℃干燥45分钟，得到所要的产物1.3克(65％)。

化合物〔2〕非常容易溶于水和水与乙醇混合溶剂。固体在空气和光照射条件下很稳定，但当溶液在长时间的光照射条件下，会缓慢分解成为浅黄色混浊的混合物。

例2-检验仪器的制造

一条高分子膜带(反应基体)被浸入如表1所组成的水溶液中，直至饱和为止。将高分子膜带从溶液中取出并用一根玻璃棒将过多的试剂刮去。将带悬置在空气循环干燥器中，在56℃条件下干燥大约5-10分钟，然后将带取出并浸入如表1中组成的有机溶液，直至饱和为止。再重复上述的干燥操作。将所得的带加工成检验所需要的形状。

                   表1-试剂配方

水溶液(用NaOH调节pH至4.25)有机溶液水20ml水  3ml柠檬酸420mg工业酒精  7ml乙二胺四乙酸(EDTA)16.7mg间(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)N-磺酰基苯磺酸-钠盐〔2〕  10-  60mgGantrez S95(从GAF，NewYork，New York可得到)90mgANS  10-  100mgCrotein SPA(从Croda Co.，New York，New York可得到)250mg葡萄糖氧化酶20,500单位辣根过氧化物酶16,200单位例3-葡萄糖的测定把含葡萄糖的血液样品加到吸满试剂的带的表面。样品立即被吸入基体并有蓝色出现。颜色的强度随时间增强并正比于分析物的浓度。依据颜色的强度，通过与标准校正曲线比较测定葡萄糖浓度。

同样，过氧化氢水溶液(有机过氧化物、三价铁和苯醌)也能与吸满试剂的带反应产生所要的蓝色。分析物的浓度用上述方法被测定。

现在，本发明已得到充分的阐述，显而易见，对本领域技术人员来说，不离开本发明的精神和范围，任何一种改进和变化都是可能做到的。