发酵法生产甘油的二步发酵生产工艺

摘要

本发明公开了一种发酵法生产甘油的二步发酵生产工艺，其特征在于第一阶段供氧发酵，当菌体开始消耗甘油时停气进行第二阶段厌氧发酵，必要时还可以接入另外一种耗糖酵母一起混合发酵，使残糖被消耗完全，并转化为酒精，而甘油不被消耗，从而使得后续甘油蒸馏容易进行，甘油回收率约为95％。

说明书

本发明涉及发酵法生产甘油尤其是二步发酵生产工艺。

目前，甘油发酵常规工艺大规模工业化的关键困难是产品后提取，如G.Martin所著的《The Manufacture of Glycerol》一书中(Sec.III.PT)就明确记载有″从发酵法生产甘油的发酵液中提取甘油是相当困难的″. P.Kishore等人在″Concentrationof Glycerol inFermentation BathsbyReverse Osmosis″(J.Microbio，Biotech-nol.1987，2(1)，22-27)一文中亦认为：“从甘油发酵液中提取甘油是发酵法生产甘油的瓶颈问题”，并提出采用反渗透法解决该问题的可能性。

具体的说，发酵甘油的提取困难在于：发酵培养基的起始葡萄糖浓度在25％左右，发酵后期当糖浓度降到1～4％，甘油浓度达到8～12％时，菌体由于葡萄糖效应而不再消耗残留糖生产甘油，却反过来将细胞外的甘油作为二次代谢碳源消耗，发酵过程被迫就此停止，而转入后提取，即过滤、浓缩和甘油蒸馏工序。甘油的沸点很高，蒸馏时残糖焦化十分严重，导致甘油蒸馏十分困难甚至无法进行。为解决这一难题，已提出了多种技术方案。诸如溶析提取法、转化分离法、载体蒸馏法。容易发现，它们的出发点是共同的，即承认发酵后期残糖不能被菌体消耗完全的现实，进而采取措施分离残糖与甘油，最终提取甘油，因此这些现有技术是“治标”的工艺方案。

本发明的目的在于提出一个从根本上解决上述难题的方案，即通过全新的二步发酵工艺，使菌体在发酵后期能将残糖消耗完全，并尽可能少或不消耗甘油，将问题解决在提取工序之前的发酵工序。

本发明的技术解决方案是：第一阶段按常规工艺通气供氧发酵，当残糖浓度降至1-4％甘油浓度升到8-12％时，菌体开始消耗甘油，停止通气进行第二阶段厌氧发酵，直至残糖浓度降至0.2％以下时结束，发酵转入后提取。

厌氧开始时可适当添加0.02-0.2％含氮、磷及其它微量元素的营养成分，加快降糖。

可将残糖包括单糖和低聚糖转变为酒精和少量甘油。

必要时可接入另一种耗糖酵母一起混合厌氧发酵。

二步发酵可与一步发酵在同一设备中完成。厌氧条件下，菌体将不会消耗甘油却继续消耗残糖，并生产酒精。

甘油合成代谢途径由葡萄糖酵解反应的中间物磷酸二羟丙酮引出，磷酸二羟丙酮在α-磷酸甘油脱氢酶(E1)的作用下，被还原为α-磷酸甘油再由甘油磷酸化酶(E2)作用脱去磷酸生成甘油；而甘油的分解代谢则从甘油激酶(E3)催化磷酸化生成L-α-磷酸甘油开始，此时L-α-磷酸甘油面临三个可能的代谢途径，一是经甘油磷酸化酶(E2)作用或甘油激酶(E3)的逆反应重新分解为磷酸和甘油；二是通过α-磷酸甘油脱氢酶(E1)的逆反应生成磷酸二羟丙酮，再进入糖酵解途径；其三则为被转运入线粒体内在线粒体磷酸甘油氧化酶(E4)作用下与氧反应，被氧化为磷酸二羟丙酮，然后再转运出线粒体参与糖酵解反应。后两种代谢会导致甘油的消耗。

甘油合成途径中的3-磷酸甘油脱氢酶(E1)活力极高，在该酶作用下从磷酸二羟丙酮L-α-磷酸甘油的反应是几乎不可逆的，因此，当甘油转入细胞内被菌体消耗时，必须先经甘油激酶(E3)作用生成L-α-磷酸甘油，再转入线粒体内在3-磷酸甘油氧化酶(E4)催化下与O₂反应生成磷酸二羟丙酮，最后转入胞质内进入糖酵解途径。在葡萄糖浓度较高时，甘油激酶(E3)的活力受糖代谢中间产物的强烈抑制，菌体不会消耗甘油，只有当糖浓度低至一定值后，对E3的抑制才被解除，菌体开始消耗甘油。若此时停气使细胞缺氧，一方面厌氧导致酵母菌本来就不发达的线粒体萎缩，线粒体酶(E4)的活性受到强烈抑制，另一方面厌氧使线粒体内从L-α-磷酸甘油到磷酸二羟丙酮的反应因缺乏底物氧而无法进行。因此，后期采用厌氧发酵可以保证菌体不将甘油作为代谢碳源消耗掉。相反，从代谢途径可知，厌氧发酵时，还可能使部分残糖继续转变为甘油。

此外，厌氧条件下，酵母菌可通过糖酵解途径将残糖转变为有用产物酒精，即两步发酵工艺可以副产酒精。

具体操作办法是：在发酵过程监测甘油和葡萄糖浓度，当甘油浓度开始下降时，即停止第一阶段供氧发酵而转入第二阶段厌氧发酵，直至残糖浓度被降至0.2％以下结束发酵转入后提取。第二阶段发酵的温度与第一阶段发酵温度相同，PH值即为第一阶段结束时的自然PH值(3.2-5.0)，其他条件与第一阶段发酵一致。厌氧开始时，可适当添加0.02-0.2％含氮、磷的营养成分加快降糖。若发酵在实验室摇瓶上进行，则在供氧发酵结束时将三角瓶口用封口膜封上，隔断空气，适当调低度振荡速率，进行厌氧发酵。若发酵在发酵罐中进行，则在供氧发酵结束时停止通空气，采用适当方式进行搅拌发酵。

必要时还可以接入另一种耗糖。酵母一起混合发酵，使残糖被消耗完全，并转化为酒精，而甘油不被消耗，从而使得后续甘油蒸馏容易进行。

本发明与现有发酵法生产甘油的技术相比，其优点如下：

1.现有技术立于酵结束以后再设法分离残糖与甘油，本发明则通过采用第二阶段厌氧发酵将残糖完全消耗。

2.现有技术为分离残糖和甘油加复杂反应步骤(如残糖氧化)或操作设备(如溶析法、树脂吸附)，使生产成本增加，本发明两步发酵可在同一设备中完成，成本增加极少。

3.现有技术将残糖简单去除，本发明则将残糖(包括单糖和低聚糖)转变为有用产品酒精和少量甘油，提高原料利用率。

以下结合工艺流程图做进一步说明：将发酵原料注入发酵罐，灭菌冷却后接入油菌种并通气供氧：进行第一次发酵，时间为60-101小时，当残糖浓度降至1-4％，甘油浓度升至8-12％时，停止通气转第二阶段厌氧发酵，即本发明的二步工艺。二次发酵与一次发酵可在同一设备中完成。厌氧发酵开始时可另加或不加耗糖菌种：亦可适当添加0.02-0.2％含氮、磷及其它微量元素的营养成分，以便加快降糖。在厌氧条件下菌体将不会消耗甘油。却继续消耗残糖，9-35小时后停止厌氧发酵。经过滤器过后，进入离子交换器进行交换，同时将产生的酒精进行回收。最后通过浓缩蒸馏等工艺生产出甘油，甘油回收率约为95％。

实施例

本发明经过了多次实验验证。下表是其中的一些实验结果。其中第1、2、4、5号实验是在摇床上500ml三角瓶中进行的，第3、6号实验则是在7升机械搅拌罐中进行的。摇床供氧发酵和厌氧发酵的振荡频率分别是140rpm和80rpm，搅拌罐供氧和厌氧氧发酵的转速分别是1200rpm和300rpm。

例号  初  糖  (％)一次发酵时间(hr)         厌氧开始时(％) 二次发 酵时间    (hr)发酵终了时(％)是否加耗糖菌甘油酒精  糖甘油酒精  糖  1  22.42    72  9.60    0  2. 32    9  8.20  0.780.04是  2  22.41    72  9.60    0  2.32    9  8.70  0.920是  3  21.32    72  7.65    0  2.85    18  7.43  1.830.25是  4  19.05    78  9.70    0  2.74    40  9.42  1.240否  5  20.56    78  9.92    0  1.42    40  11.2  0.650.18否  6  26.74    101  8.41    0  5.69    35  9.06  2.550.48否