一种新的抗肿瘤抗生素——云南霉素

摘要

本发明是从云南链霉菌菌株2321的发酵液中，经离子交换树脂提取，层析分离纯化，浓盐酸水解，再经离子交换树脂提取，层析制备等方法，分离到胞嘧啶核苷二肽新抗生素——云南霉素，体外对肿瘤细胞有杀伤作用，体内对小鼠肉瘤180(实体型)有显著疗效，使用可耐受剂量对肿瘤生长抑制率达87％，比等毒性剂量的5-氟脲嘧啶的抑瘤作用强，而对骨髓毒性较轻，使用治疗剂量对造血系统有轻度抑制作用，病理组织学检查，治疗动物的各种主要器官均未见毒性病变。

说明书

本发明属于一个新的具有抗肿瘤作用的胞嘧啶核苷二肽抗生素。

迄今已发现的来源于微生物的抗生素已近万余种之多，其中许多已作为医药，农药等得到了广泛应用，但疗效好、毒性低的抗肿瘤抗生素仍为数甚少。因此进一步寻找理想的抗肿瘤作用的新品种仍日趋迫切。

本发明是在从云南放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中，由链霉菌菌株2321的培养液中分离到具有抗肿瘤及抗菌作用的活性物质，从该物质的酸水解产物中分离得到了具有抗肿瘤作用的新抗生素2321C，定名为云南霉素(Yunnanmycin)。(该云南霉素的产生菌已保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，北京中关村。100050，保藏日期1995年，7月26日，编号0234)。

经光谱及质谱数据分析，确定云南霉素具有如式(1)R＝H所示结构式，该结构式可将云南霉素与迄今已知的胞嘧啶核苷二肽结构的所有医用和农用抗生素如谷氏菌素(Gougerotin)、庆丰霉素(Qingfengmycin)及宁南霉素(Ningnanmycin)等相区别，故确认云南霉素为一个新的抗生素。式中：R＝H(云南霉素)，

R可以是K，Na，NH₄及CH₃，C₂H₅等本发明的内容与要点如下：一.云南霉素的产生菌，发酵，抗菌活性及制造方法1.产生菌来源：云南关坪自然保护区土壤形态特征：孢子丝螺旋形。孢子呈多型性：椭圆形、园形、瓜子形，孢子

                    表面有刺。

培养特征：见表1

表1

培养基        生长  产生菌丝   基内菌丝      可溶性色素Isp.1号培养基      好    白色       无色            微黄Isp.2号培养基      好    白至褐灰   无色             无Isp.3号培养基     适度   白至褐灰   无色至微灰       无Isp.4号培养基      好    白至褐灰   无色至微灰       无Isp.5号培养基      好    白至褐灰   无色至乳脂       微黄Isp.6号培养基      好    白色       无色             无H2SIsp.7号培养基      好    浅灰       软皮色           污黄葡萄糖天门冬素琼脂 适度  浅灰       无色             无蔗糖查氏琼脂       差    褐灰       无色             无葡萄糖查氏琼脂     好    褐         浅黄灰斑         浅黄甘油查氏琼脂       好    白至浅灰   浅黄褐           污黄高氏1号琼脂       适度   灰白至灰   无色或乳脂       无或淡黄

不形成黑色素，不产生H₂S。

2.发酵

孢子传代培养：Isp.5号培养基，28℃10天培养。

种子培养：

培养基成分：葡萄糖1％，淀粉1.5％，肉膏0.5％，胨(鱼)0.5％，NaCl0.3％，黄豆粉1％，无盐水，PH7.0.28℃振荡培养48小时。

发酵培养：

培养基成分：葡萄糖2％，淀粉1％，肉膏0.5％，酵母粉0.5％，胨(鱼)0.5％，NaCl0.3％，黄豆粉1％，无盐水，PH7.028℃振荡培养96小时。活性检定：检定菌：大肠杆菌B培养基：肉膏0.3％，胨1％，琼脂1.6％，无盐水，PH7.0-7.2。检定方法：纸碟法。3.抗菌活性云南霉素只对大肠杆菌B有较弱的活性。纸碟法检测结果见表2

表2

        试验菌                最低抑制浓度(ug/ml)Bacillus subtilis6633               ＞500Staphylococcus aureus  229p         ＞500Sarcina    lutea                    ＞500Escherichia  coia      B              500Escherichia   coli     0111         ＞500Proteus  vulgaris      ox19         ＞500Pseueomonas  aeruginosa11           ＞500Klebsiella  pneumoniae              ＞500Candida  albicans                   ＞500Penecillium  avallaneum   5404      ＞500

4.制造方法

链霉菌菌株2321的发酵培养液的滤液，用2％(克/毫升)活性炭装柱吸附，50％丙酮洗脱，减压浓缩除去丙酮后的水溶液，调PH3，通过强酸阳离子树脂(NH₄⁺型)，进行交换，用1N氨水洗脱，洗脱液对大肠杆菌显示活性部分除去氨，冷冻干燥，冷干品用中性氧化铝柱吸附层析，75％甲醇洗脱，去甲醇后水溶液冷冻干燥，干燥后再用葡聚糖凝胶G-10柱层析，活性部分冷冻干燥，冷干品加适量浓盐酸，于室温下水解60小时，去除过量的盐酸气，水溶液通过强酸阳离子树脂(NH₄⁺型).进行交换，0.1N氨水洗脱，冷冻干燥，干燥品用葡聚糖凝胶G-10柱层析分离，水扩展，活性部分再冷冻干燥，干燥品用硅胶薄板层析分离制备(自制硅胶GF₂₅₄板，20×20cm)，60％甲醇展开，分离出活性部分的冷干品纯度达95％以上，称云南霉素。二.云南霉素的结构及理化数据：

云南霉素具有如式(1)所示结构，其UV，IR，FAB-MS，分子式，¹HNMR，¹³CNMR及¹³C-DEPT数据如下，(1)式是根据这些数据及¹H-¹H相关谱(COSY)及反相检测远程¹H-¹³C异核多键相关谱(HMBC)的分析确定的。

UV：                         258nmλ_mnax^0.1N NaOH                    258nmλ_max^0.1NHCl                      275nm(见附图1)IR(KBr)：3200-3400，      1640-1660，1485，    1275， 1060-1080，940，      840， 780cm^-1(见附图2)

FAB-MS(m/z)：445(M+H)^-

             443(M-H)^-    (见附图3)

分子式：C₁₆H₂₄K₅O₉

    ¹H-NMR(400MHz in D₂O，30℃)，见表3及附图4

表3

   ¹H-NMR(400 MHz in D₂O，30℃)

   ppm       multi       assignment

   7.83      1H，d，8Hz    H-6

   5.12      1H，d，8Hz    H-5

   5.70      1H，m         H-1′

   4.56      1H，t，5Hz    Ser-α

   4.05      1H，m         H-4′

   4.02      1H，d，11Hz   H-5′

   3.98      1H，d，16Hz   Gly-α

   3.93      1H，d，16Hz   Gly-α

   3.87      2H，m         Ser-β

   3.81      2H，m         H-2′,3′

   2.77      3H，s         NCH₃¹³C-NMR(100MHz in D₂O，30℃)，见附图5。¹³C-DEPT (100MHz in D₂O，30℃)，见附图6。¹H-¹H COSY    见附图7。¹H-¹³C-HMBC   见表4及附图8。

   表4       ¹³C-NMR  (100MHz in D₂O，30℃)ppm  muiti Correlations  observed  in  HMBC(δH)    assignment176.83    s    4.02(H-5′)                                C-6′174.13    s    4.56(Ser-α)  3.87(Ser-β)                 Ser-CO169.88    s    4.56(Ser-α)  3.98(Gly-α) 3.93(Ser-α)    Gly-CO168.89    s    7.83(H-6)     6.12(H-s)                     C-4160.69    s    7.83(H-6)     5.70(H-1′)                   C-2144.78    d    6.12(H-s)     5.70(H-1′)                   C-699.92     d    7.83(H-6)                                   C-585.92     d    7.83(H-6)     3.81(H-2′or3′)              C-1′80.83     d    4，05(H-4′)                                C-5′76.65     d    5.70(H-1′)   4.05(H-4′) 3.81(H-2′or3′) C-2′or3′74.66     d    5.70(H-1′)   3.81(H-2′or3′)             C-2′or3′64.15     t    4.56(Ser-α)                                Ser-β58.47     d    3.87(Ser-β)                                Ser-α56.35     d    4.02(H-s′)   3.81(H-2′or3′)              C-4′52.63     t    2.77(NCH)                                   Gly-α35.84     g    3.98(Gly-α)  3.93(Gly-α)                  NNH₃

三.云南霉素的抗肿瘤作用及毒性

1.云南霉素的抗肿瘤作用

(1).体外抗肿瘤活性：实验使用KB细胞系(来源于人的口腔鳞癌)，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液在含5％CO₂的37℃温箱中培养采用克隆生成测定(Clonogenic assay)判断药物对肿瘤细胞的杀伤作用。取对数生长期的KB细胞加入96^#培养板内，每^#50个细胞/0.2ml，培养24小时后加入药物，6天后在倒置显微镜下计数细胞集落(含30个细胞以上者)，计算集落抑制率，结果证明，云南霉素对KB细胞有杀伤作用，其作用强度呈浓度依赖性；云南霉素对KB细胞的IC₅₀(半数集落抑制浓度)为3μg/ml(见附图9)。

(2).体内的试验对肿瘤的疗效：实验使用18-20g体重的昆明种小鼠，取小鼠肉瘤180腹水加生理盐水(1∶3)稀释，接种于小鼠腋部皮下，每鼠0.2ml。接种中瘤24小时后口服(po)给药，2次(分别在1、6天给药)或3次(分别在1、4、7天给药)，首次给药10天后处死动物，取肿瘤称重量，计算肿瘤抑制率。结果表明，云南霉素对小鼠肉瘤180(实体型)有显著疗效，使用可耐受剂量(135mg/kg，po，x2)，对肿瘤生长抑制率达87％(P＜0.01)。见表5

表5.云南霉素对小鼠肉瘤180生长的抑制作用实验        剂量    给药    动物数    体重    瘤重(g)       抑瘤率批号  组别 (mg/kg)  次数  开始/结束  改变(g)  均数±SD       (％)1对照                       10/10    +10.1    3.80±1.08云南霉素    60        3     10/10    +5.7     2.03±0.48     47^**

        90        3     10/10    +4.5     1.74±0.31     54^**

       120        3     9/10     +4.3     0.84±0.24     78^**II对照                      10/10    +7.3     2.94±0.83云南霉素   105        2     10/10    +2.0     0.71±0.16     76^**

       120        2     10/10    -0.3     0.55±0.24     81^**

       135        2     10/10    +1.8     0.38±0.11     87^**

小鼠腋部皮下接种肿瘤，口服(po)给药。

**P＜0.01

(3).云南霉素与5-氟脲嘧啶的抗肿瘤作用及毒性比较：采用等毒性剂量(1/3LD₅₀)进行比较。同二.1.(2)体内试验方法，在小鼠腋部皮下接种肉瘤180腹水0.2ml，24小时后开始口服给药(po)，共2次(分别在1，6天给药)。首次给药10天后处死动物，取肿瘤称重量，计算肿瘤抑制率；同时取出一侧股骨，检查骨髓有核细胞数，计算骨髓细胞抑制率。实验结果，云南霉素的抑瘤作用比5-氟脲嘧啶强，而骨髓毒性较轻，使用相当于1/3LD₅₀的剂量，云南霉素(120mg/kg)和5-氟脲嘧啶(80mg/kg)的抑制率分别为81％(P＜0.01)和66％(P＜0.01)，两者比较，P＜0.01；云南霉素和5-氟脲嘧啶对骨髓有核细胞的抑制率分别为22％(P＜0.05)和83％(P＜0.01)，两者比较，P＜0.01，见表6

表6云南霉素和5-氟脲嘧啶对小鼠肉瘤180的抑制作用以及对骨髓的毒性比较

         剂量    动物数    肿瘤重量(g)     骨髓有核细胞数(10⁷/股骨)

        (mg/kg) 开始/结束 X±SD      抑制率(％)    X±SD    抑制率(％)对照                 10/10     2.94±0.83            1.41±0.27云南霉素      120    10/10     0.55±0.24  81^**     1.10±0.29     22^*5-氟脲嘧啶    80     10/10     0.99±0.33  66^**     0.24±0.18     83^**小鼠腋部皮下接种肿瘤，灌胃(po)给药；使用相当于1/3LD₅₀的剂量，共2次。

*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。

上述结果表明，使用等毒性剂量(1/3LD₅₀，po)进行比较，云南霉素对小鼠肉瘤180(实体型)的抑制作用比5-氟脲嘧啶强，而对骨髓毒性较轻。

2.云南霉素的毒性

(1)小鼠急性毒性：口服给药(po)的LD₅₀为360mg/kg。

                 腹腔给药(1p)的LD₅₀为65mg/kg。

(2)使用治疗剂量(120mg，po，×2，抑制率81％)，对造血系统有轻度抑制作用，(骨髓细胞抑制率22％)；病理组织学检查，治疗动物的各种器官包括心、肺、气管、肝、食官、胃、小肠、脾、肾、肾上腺等均未见毒性病变。

四.制造方法实施例：

取发酵液10立升，加硅藻土过滤，弃去菌丝，滤液通过200克活性炭柱(水湿装柱，柱5.5×55cm)，进行吸附，50％丙酮洗脱，每250毫升收集一份，1-4份活性部分合并，除去丙酮，水溶液约500毫升，调PH3.0，通过装有50毫升001×7铵型阳离子交换树脂柱，少量水冲洗后，用1N氨水洗脱，每100毫升收集一份，1-5份活性部分合并，去除氨气，水溶液冷冻干燥，全部冷干品通过中性氧化铝100毫升柱脱色(甲醇湿装)，75％甲醇展层，每100毫升收一份，1-10份活性部分合并，除去甲醇后，冷冻干燥，得2.3克干燥品，取一克干燥品经过葡聚糖凝胶G-10柱层析分离，(柱：1.2×100cm)，水洗，每5ml毫升收集一份，7-15份活性部分合并冷冻干燥得冷干品0.56克，纯度95％(HPLC检测，C₁₈ Waters柱4.6×250mm，流动相为75％甲醇，流速1毫升/分钟，检测UV268nm，保留时间8.3分钟)。取该95％纯度的冷干品1克，加浓盐酸40毫升，室温水解60小时后，去掉盐酸气后的残渣，加水200毫升，通过强酸阳离子树脂Dowex×50w×4(NH₄⁺型)10毫升，进行交换，水洗后，用0.1N氨水洗脱，每3毫升收集一份，11-20份活性部分合并，去氨气后冷冻干燥得到550毫克冷干品，取150毫克该冷干品通过葡聚糖凝胶G-10柱(1.2×100cm)，水洗，括性部分冷冻干燥，冷干品用硅胶薄板层析分离(自制硅胶GF₂₅₄板，20×20cm)，60％甲醇展层，分离得到活性部分的冷干品60毫克，纯度96％(HPLC检测，C₁₆Waters柱4.6×250mm，流动相为75％甲醇，流速1毫升/分钟，检测UV268nm，保留时间2.9分钟)，称云南霉素。

附图说明：

图1是云南霉素的UV；

图2是云南霉素的IR；

图3是云南霉素的FAB-MS；

图4是云南霉素的¹H-NMR；

图5是云南霉素的¹³C-NMR；

图6是云南霉素的¹³C-DEPT；

图7是云南霉素的¹H-¹HCOSY；

图8是云南霉素的¹H-¹³CHMBC

图9是云南霉素对KB胞的杀伤作用，克隆生成测定，药物作用时间6天。