一种双特异性抗体CD20×CD3的构建及应用

摘要

本发明提供了一种双特异性抗体，本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单价单元对肿瘤细胞表面抗原CD20具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(ScFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法，以及双抗体功能和性质检测方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecificantibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。以下是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展的一些背景技术介绍。

1.CD3

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9k Da、23.1kDa、20.5k Da、18.7k Da，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(majorhisto-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scrhomology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

2.CD20

CD20是B淋巴细胞表面的特异性的标志性分子，表达于95％以上的正常或恶性B淋巴细胞表面，在造血干细胞、祖细胞和其他正常组织中无CD20抗原的表达。它由297个氨基酸组成，分子量为33kD，34～36kD属于非糖基化磷蛋白，其抗原表位为第三、四跨膜区间的由43个氨基酸组成的环区。CD20与相应抗体结合后不发生明显的内化现象，也不发生明显的细胞表面脱落现象，是治疗B淋巴细胞相关疾病的理想靶点。研究表明，CD20具有钙离子通道的功能，通过调节细胞内钙离子的浓度，影响细胞周期，调节细胞增殖与分化，甚至导致细胞凋亡的发生。目前有两种针对CD20靶点的单克隆抗体药物美罗华和奥法木，其作用机制主要有补体依赖性细胞毒性反应、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用以及提高细胞对细胞毒作用的敏感性，此外免疫接种作用等也均导致B细胞的凋亡。由于原始的正常B细胞不受抗CD20单抗的作用，即使在抗CD20单抗杀伤了所有表达CD20分子的淋巴瘤细胞及正常B细胞后，仍能够重建B细胞群，因此抗CD20单克隆抗体也越来越多被应用到B细胞相关疾病的治疗中。

3.双特异性抗体技术发展

双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位的抗体。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中肿瘤的治疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫系统来杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。

用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

4.双特异性抗体制备

双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交—杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备出了双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体概念。杂交—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化双特异性抗体的多种构建模式，并主要分为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。

5.肿瘤的过继免疫治疗

肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活的T淋巴细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可以结合培养好的免疫细胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细胞的表面抗原；这样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过这种方法可有效解决肿瘤细胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。

发明内容

术语和缩略语

BiAb:双特异性抗体(bispecific antibody)

TA:肿瘤抗原(tumor antigen)

VH:重链可变区(heavy chain variable region)。

VL:轻链可变区(light chain variable region)。

CL：轻链恒定区(constant region of light chain)。

CDR：是英文Complementarity determining regions(CDRs)的缩写，是指抗体的抗原互补决定区。

ScFv：单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment)，又称为单链抗体。

CLD:细胞系开发(cell line development)

FACS：荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting)，也称为流式细胞分选术。

本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和凋亡能力来杀伤肿瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫系统杀伤肿瘤细胞的功效。

具体地，本发明提供了以下的技术方案：

在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细胞表面抗原是CD20、EPCAM和CD30，更优选地该肿瘤细胞表面抗原是CD20；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细胞；优选地，该融合肽对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。

在一种实施方式中，所述双特异性抗体的单链单元的CH2结构域位于ScFv片段和CH3结构域之间；所述单链单元不包含CH1结构域。

在一种实施方式中，双特异性抗体的单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结构域组成，它们都靶向于抗原表位CD3。

在一种实施方式中，在单价单元中，所述轻链的轻链恒定区结构域和轻链可变区结构域都靶向于肿瘤抗原表位CD20；所述重链的重链恒定结构域CH1和重链可变结构域也靶向于肿瘤抗原表位CD20；轻链通过二硫键与重链结合；重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。

在一种实施方式中，单链单元包括针对CD3的抗体抗-CD3，单价单元包括针对CD20的抗体抗-CD20。

在一种实施方式中，抗体抗-CD20的重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗体抗-CD20的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3 ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-CD20重链在224位点上的半胱氨酸与抗-CD20的轻链213位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述抗-CD20重链在230和233位点上的半胱氨酸与抗-CD3 ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述抗-CD20重链在396和413位点上与抗-CD3 ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-CD20重链在370位点上与抗-CD3 ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。

在一种实施方式中，单价单元中的重链包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段；所述融合肽的Fc片段包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。

在一种实施方式中，所述单价单元的人IgG Fc段和所述单链单元的IgG Fc通过盐桥和隆突-入穴结构连接。

在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体的制备方法，所述方法包括：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S细胞；或者优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

在一种实施方式中，第一表达载体是pCHO1.0；第二表达载体是是pCHO1.0-潮霉素。

在一种实施方式中，所述单价单元为抗-CD20抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoR V)F、MK-前导序列(EcoRV)F、Rituxan-VL F1和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-前导序列(AvrII)F、Rituxan-VH F1和hIgG1(sbfI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrI I与BstZl7I引入重链；扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-CD20轻链的表达载体；然后用AvrI I与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-CD20的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-抗-CD20-HL-LDY；

所述单链单元为抗-CD3 ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-前导序列(AvrI I)F、L2K-VH(MK)F1和hIgG1(sbfI)R，通过重叠PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3 ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-KKW。

在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗CD20特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达CD20细胞。

在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在表达CD20肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达CD20特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物，或者评价用于治疗表达CD20特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物的药效。

本发明还提供了以下的技术方案：

本发明提供了一种新方法制备双特异性抗体MSBODY(ScFv and monomerbispecific antibody)(如图2所示)，该双特异性抗体包括两组重轻链组合，其中一组特异结合一种抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组特异结合另一种抗原，同样在其重链Fc区进行另外一些改造，也不易自身形成二聚体，而这两组重轻链之间很容易形成杂合二聚体。并且其中一组的抗体结构为单聚体Ab，另一组为ScFv-Fc，这样就避免了各自轻链与对方重链错配的可能性，从而形成125KD的双特异性抗体蛋白分子。Fc改造后，单聚体Ab的重链和单链自然异二聚化，同时CL和CH1间自然二聚化，最后形成MSBODY，MSBODY各结构域排列顺序及结构示意图见图2。

本发明中利用以上制备双特异性抗体的方法，制备双特异性抗体。其中是以CD20和CD3为靶点的双特异性抗体，被命名为CD20×CD3，如图2，抗-CD20这边为IgG形式，包括抗-CD20重链与轻链，抗-CD3这边为ScFv-Fc形式，包括抗-CD3 VH、VL、Fc结构域。以上双特异性抗体通过抗体基因工程方法进行构建，双特异性抗体MSBODY的单聚体Ab重链和单聚体Ab轻链二元表达载体，以及ScFv-Fc表达载体。根据LC，HC，ScFv，Fc基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。其中LC，HC，ScFv和Fc分别进行PCR扩增，通过PCR或重叠延伸PCR法获得基因片段，然后通过同源重组法进行克隆。酶切pCHO1.0或pCHO1.0-潮霉素载体，然后纯化回收PCR产物和酶切后的载体，分二步分别将LC片段，HC片段同源重组克隆到pCHO1.0载体上，ScFv-Fc片段同源重组克隆到pCHO1.0-潮霉素载体上，并测序。重组蛋白质MSBODY在哺乳动物细胞中的表达、检测，使用转染试剂将分别表达单聚体Ab重链、单聚体Ab轻链和单链(Single chain)的两种质粒共转染至哺乳动物细胞中，再收集上清进行SDS－PAGE和蛋白质印迹检测MSBODY的表达情况。将转染表达后的培养液上清离心，过滤，用结合缓冲液稀释，过亲和层析柱，洗脱缓冲液洗脱，SDS－PAGE检测纯化蛋白质。

本发明的技术方案的有益的技术效果有：

1.本发明公开了一种新型双特异性抗体MSBODY介导的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的动物模型的建立及其应用。本发明包括双特异性抗体药物研究过程中所介导的免疫细胞杀伤、双特异性抗体的制备、用表达人CD20蛋白的肿瘤细胞系建立药效模型以及双特异性抗体药效的检测。双特异性抗体MSBODY包括一组重轻链组合，另一组则为ScFv连接Fc组合，其中一组特异结合一种人的肿瘤细胞抗原，包括CD20等一系列肿瘤细胞膜表面抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组特异结合另一种人的T细胞抗原CD3，同样在其重链Fc区进行另外一些改造，也不易自身形成二聚体，而这两组重轻链之间很容易形成杂合二聚体。与此同时，双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

2.本申请提供了一种异二聚体抗体，该抗体包含两个不同的抗原结合多肽单元。该异二聚体与其对应的同二聚体分子量大小不同，可利用分子量的大小来区别异二聚体和同二聚体，从而较方便的确定双特异性抗体的纯度。这两个抗原结合多肽单元之一包含类似于野生型抗体的轻链-重链对，在整个本申请中，该单元也称为“单价单元”。另一抗原结合多肽单元包含单链可变片段(ScFv)。这样的ScFv可融合至抗体的恒定片段(Fc)。在本申请全文中此融合肽也被称为“单链单元”。

令人惊奇的是，本申请证明这种非对称的抗体是稳定的并具有高的抗原结合效率。这是令人感到意外的，因为已经证实在生理条件下即使是单链抗体的同二聚体都是不稳定的。例如，Ahmad等的“ScFv Antibody:Principles and ClinicalApplication,”Clinical and Developmental Immunology,2012:980250(2012),显示基于ScFv的IgG类抗体不稳定，并且需要进一步改造以减少聚集并提高稳定性。

另外，因为具有非对称性，异二聚体具有与由其中任一抗原结合多肽单元组成的同二聚体所不同的等电点。基于异二聚体和同二聚体之间的等电点差异，可以容易地将需要的异二聚体与同二聚体分离，大大减少了双特异性抗体普遍存在的下游工艺开发存在的困难。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1.CD3分子结构示意图。

图2.CD20×CD3双特异性抗体分子示意图。

图3.电泳检测PCR产物图，M：DL10000核酸分子标记；1.抗CD20抗体重链；2.抗CD20抗体轻链。

图4.电泳检测PCR产物图，M：DL2000核酸分子标记；1.抗CD3抗体ScFv-Fc。

图5.纯化的双抗体电泳及纯度检测图，(A)CD20×CD3双抗体SDS-PAGE电泳，M：蛋白分子量标记；1：非还原SDS-PAGE电泳检测；2：还原SDS-PAGE电泳检测；(B)CD20×CD3的HPLC-SEC纯度峰形图。

图6.基于流式细胞分析方法测定的CD20×CD3双抗体与Raji细胞的亲和力图；(●)Rituxan对照单克隆抗体，(■)CD20×CD3双特异性抗体。

图7.基于流式细胞分析方法测定的CD20×CD3双抗体与Jurkat细胞的亲和力图；(●)L2K对照单克隆抗体，(■)CD20×CD3双特异性抗体。

图8.流式检测CD20×CD3双抗体同时结合Raji和Jurkat细胞，并促进2种细胞共结合；(▲)M903：CD20×CD3双抗体。

图9.差示扫描热量计扫描测量CD20×CD3双抗体的Tm值结果图。

图10.CD20×CD3双抗体经过热处理后与Raji细胞表面CD20结合活性检测结果图，(●)CD20×CD3双抗体；(■)Rituxan单克隆抗体。

图11.CD20×CD3双抗体经过热处理后与Jurkat细胞表面CD3结合活性检测图，(▲)CD20×CD3双抗体；(▼)Anti-CD3单克隆抗体L2K。

图12.CIK表型检测结果图，右上角的CD3，CD56双阳性的NK类细胞。

图13.流式检测不同浓度抗体存在条件下，效应细胞CIK对靶细胞Raji的杀伤作用结果图；(■)M903：CD20×CD3(所有格式应保持一致)双抗体，(▲)Mco101：对照4420 X×CD3双抗体，(▼)Rituxan：CD20单抗，(●)hIgG：人IgG。

图14.流式检测不同浓度抗体存在条件下，效应细胞PBMC对靶细胞Raji的杀伤作用结果图；(■)M903：CD20×CD3双抗体，(▲)Rituxan：CD20单抗，(▼)Mco101：对照4420 X×CD3双抗体，(●)hIgG：人IgG。

图15.双抗体体内药效实验结果图，(A)表示接种肿瘤细胞后，仅仅尾静脉给培养基，(B)尾静脉给T细胞,(C)尾静脉注射包被CD20x×CD3双抗体的T细胞。

具体实施方式

实施例1：双特异性抗体的表达载体构建(CD20×CD3,M903)

1.双特异性抗体序列设计

以CD20和CD3为靶点的双特异性抗体被命名为M903，如图2，抗CD20这边为IgG形式，包括抗-CD20重链与轻链，含有Fab和Fc结构域；抗CD3这边为ScFv-Fc形式，包括抗CD3VH、VL、Fc结构域。其中IgG形式一边Fc进行LDY改造，ScFv-Fc一边Fc进行KKW改造，具体Fc改造过程参见PCT/CN2012/084982，使其各自不易形成同源二聚体，而易于形成杂合二聚体，即CD20×CD3双特异性抗体。同时，为了双抗体能在CHO细胞中表达，并能分泌到培养基中，选择了鼠kappa链的前导肽序列作为分泌信号肽。各个结构域及信号肽的氨基酸序列和核酸序列见如下SEQ ID NO:1-8。

抗-CD20重链氨基酸序列(序列号1)

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗-CD20重链核酸序列(序列号2)

caggtacaactgcagcagcctggggctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaaacagacacctggtcggggcctggaatggattggagctatttatcccggaaatggtgatacttcctacaatcagaagttcaaaggcaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcgacttactacggcggtgactggtacttcaatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctctgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgccgggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacggctccttcttcctcgccagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

抗-CD20轻链氨基酸序列(序列号3)

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗-CD20轻链核酸序列(序列号4)

caaattgttctctcccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatccactggttccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggacttcttactctctcacaatcagcagagtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggactagtaacccacccacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

抗CD3 ScFv-Fc氨基酸序列(序列号5)

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGAAAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CD3 ScFv-Fc核酸序列(序列号6)

gatatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcaggaggcggcggttcaggcggaggtggaagtggtggaggaggttctgacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagagccagttcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaagtggcttctggagtcccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcatactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaacagtggagtagtaacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaaggtgcggccgcagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgataccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcgatctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列(序列号7)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG

鼠kappa链的前导肽序列核酸序列(序列号8)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt

2.双特异性抗体基因克隆

选择pCHO1.0作为表达载体去克隆和表达抗CD20的重链和轻链基因，pCHO1.0-潮霉素表达载体是通过用潮霉素抗性基因替换pCHO1.0载体中的嘌呤霉素基因改造而来，被选择用来克隆和表达抗CD3的ScFv-Fc融合基因。表1中的引物根据克隆方案设计好后，发送到苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。以表1中的引物进行PCR扩增，模板为早期实验中基因合成或亚克隆到pCDNA3.1或pUC57上的基因质粒，PCT/CN2012/084982专利有详细描述，然后分别将抗-CD20重、轻链分别构建到pCHO1.0的表达载体上，将抗CD3 ScFv-Fc构建到pCHO1.0-潮霉素的表达载体上。

表1双特异性抗体基因克隆中使用的引物

初始PCR扩增模板DNA：35ng的模板DNA，如，目标抗体的轻链和重链；1μl的10μM正向引物和反向引物；2.5μl的10x PCR Buffer缓冲液；1μl的10mM dNTP；1μl的2.5单位/μl Pyrobest DNA聚合酶(Takara，R005A)；和蒸馏水到25μl总体积在microfuge管中轻柔混合，并在微量离心机中快速旋转以收集反应混合物到管底。使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应：95℃，5分钟；以下的25个循环：95℃，每次30秒；56℃，30秒；和72℃，1分钟。

通过几轮重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链(图3)；以及相应的引物将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链(见图3)。先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-CD20轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-CD20的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-抗-CD20-HL-LDY。

通过重叠PCR扩增抗CD3 ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段(见图4)与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3 ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-KKW。

实施例2：双特异性抗体表达与纯化

1.双特异性抗体的表达

利用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。CHO-S细胞培养根据厂商提供的说明书在CD CHO培养基(Gibco，10743-029)中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养，准备好细胞后，根据制造商的说明书(Maxcyte)，使用Maxcyte STX电转仪将质粒pCHO1.0-抗-CD20-HL-LDY与pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-KKW一起共转染到CHO-S细胞中，设计共转染这两种质粒以表达对CD20×CD3的双特异性抗体M903。

在转染后第2天，培养温度下调到32℃，并每天补加3.5％FeedA，培养14天后，800*g离心收获表达上清。

2.双特异性抗体的纯化

表达上清用0.22uM滤膜过滤，利用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司，18-1153-45,17-5438-01)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，用平衡缓冲液(9.5mM NaH₂PO₄+40.5mM Na₂HPO₄，pH7.0)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸+100mM精氨酸，pH3.2)洗脱。通过SP阳离子交换层析，实现目标双特异性抗体与副产物的分离，阳离子交换柱购自GE公司(18-1153-44,17-1087-01)，用平衡缓冲液A(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄，pH6.0)平衡层析柱后，样品用双纯水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄+1M NaCl，pH6.0)20个柱体积线性洗脱；最后浓缩置换Buffer PBS。纯化后的双特异性抗体进行SDS-PAGE、SEC检测，纯度在95％以上，见图5。

实施例3：双特异性抗体与细胞的结合活性测定(FACS)

本发明的双特异性抗体与相应细胞上的靶抗原结合。本发明以Raji(购自ATCC，CCL-86)作为CD20阳性的细胞，Jurkat(Jurkat，TIB-152)作为CD3阳性的细胞，并以本发明制备的双抗体测定其细胞结合活性。

1.利用流式分析法检测双特异性抗体与Raji细胞的结合活性

培养足够的Raji细胞，离心收集细胞。同时稀释双特异性抗体，浓度从1000nmol开始，3倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+1％FBS洗两遍，再加PBS+1％FBS重悬细胞至4×10⁶个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔50ul(2×10⁵个细胞)，加入50ul稀释好的双特异性抗体，室温孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗人IgG FC抗体(Biolegend，409304)重悬细胞，室温避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism5.0进行分析计算双抗体与Raji的结合亲和力KD值。结果显示CD20×CD3双抗体与CD20阳性的Raji细胞具有良好的结合活性，见图6，其KD值为274.5nM。

2.流式分析法检测双特异性抗体与Jurkat细胞的结合活性

培养足够的Jurkat悬浮细胞，离心收集细胞。接下来的实验过程与上述实施例相同，将100ul PBS重悬的细胞，上机检测，以平均荧光强度，通过用软件GraphPad Prism5.0进行分析计算双抗体与Jurkat细胞的结合亲和力KD值。结果显示CD20×CD3双抗体与CD3阳性的Jurkat细胞具有良好的结合活性，见图7，其KD值为571.3nM。

3.双抗体介导的共结合活性检测

将培养好的Raji和Jurkat细胞，离心收集并用PBS洗2遍，分别用CFSE和PKH-26染色。同时稀释双特异性抗体，浓度从10ug/ml开始，10倍梯度稀释，得到12个浓度梯度，备用。将染色好的Raji和Jurkat细胞离心去上清，用PBS+1％FBS洗两遍，再加PBS+1％FBS重悬细胞至4×10⁶个细胞/ml，按1:1混合均匀，将细胞铺板于96孔板中，每孔50ul(2×10⁵个细胞)，加入50ul稀释好的双特异性抗体，室温孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，最后用100ulPBS重悬，上机检测，分析双阳性细胞的比率，通过用软件GraphPad Prism5.0进行分析计算。结果显示CD20×CD3双抗体能同时结合CD20阳性的Raji细胞和CD3阳性的Jurkat细胞，形成双荧光的细胞复合体，见图8，结果显示依赖抗体浓度而变化，最高比率达到15％左右。实施例4：双特异性抗体的热稳定性测定

1.双特异性抗体的Tm值测定

双特异性抗体的热稳定性通过差示扫描热量计(MicroCal VP-DSC，GE公司)进行测定，双抗体样品纯化后置换于PBS缓冲液中，以PBS缓冲液作为对照，量热扫描数据以60℃/小时的加热速率从10℃到100℃进行扫描获得。扫描结果显示(图9)，双特异性抗体的Tm值都在70℃以上，表现出了良好的热稳定性。

2.双特异性抗体的热挑战性实验

单链抗体片段(ScFv)通过一个连接肽(Gly4Ser)3把重链可变区和轻链可变区连接起来而形成的。但是有报道ScFv内在的不稳定性可能会影响抗体药物的质量(MichaelsonJS1,etc.,Anti-tumor activity of stability-engineered IgG-like bispecificantibodies targeting TRAIL-R2 and LTbetaR.MAbs.2009 Mar-Apr；1(2):128-41)。因此，我们将抗体稀释到0.4mg/ml,分别4℃，37℃，42℃，47℃，52℃，57℃，62℃，67℃，72℃，77℃，82℃，PCR仪处理1h，每管15ul。离心取上清，按照以下步骤进行流式检测，收集单细胞悬液加入96孔板，3×10⁵/孔，加入各种处理抗体，并加入荧光二抗，流式上机检测，结果见图10和11，结果显示CD20×CD3双抗体与Raji细胞上CD20结合的T₅₀值为60.69；与Jurkat细胞上CD3结合的T₅₀值为58.99，都显示了良好的热稳定性。

实施例5：双抗体介导的体外细胞杀伤检测

1.PBMC细胞的分离及CIK细胞培养

取新鲜抗凝血，400g离心5min，弃上清。加入10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温或冰上裂解4-5分钟。在裂解过程中宜适当摇动以促进红细胞裂解。4℃400g离心5min，弃红色上清。若红细胞裂解不完全，重复步骤2和3一次。洗涤1-2次。加入5倍细胞沉淀体积的PBS，重悬沉淀，4℃400g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。根据实验需要用适当4℃PBS重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

CIK细胞的培养，用CIK细胞启动培养液(无血清X-Vivo细胞培养液+750IU/ml IFN-γ±2％自体血浆)将每份细胞补满30ml，加到75cm²培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱培养。培养24小时后，加入CIK细胞刺激因子混合液1ml(无血清X-Vivo细胞培养液+75ng/ml Anti-human CD3ε、750IU/ml IL-2、0.6ng/ml IL-1α)，继续置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱内培养。接下来的步骤根据CIK细胞的生长情况决定补液(无血清X-Vivo培养液+750IU/ml IL-2±2％自体血浆)、分瓶的事情，基本上要维持细胞在2*10^6的浓度左右生长。最后用流式细胞仪FC500对收集的CIK细胞进行表型检测，包括：CD3，CD56，CD4，CD8，检测这些细胞表面抗原在CIK细胞的表达情况。检测结果见图12，表型结果显示CIK细胞具有18.1％的CD3和CD56双阳性，培养的细胞具有很好的NK T细胞的比率。

2.双抗体有效介导CIK细胞杀伤肿瘤细胞检测

收集Raji单细胞悬液，用终浓度为5uM的CFSE染色(染色步骤见protocol-1 CFSE染色)，染色后用该细胞培养的10％FBS-1640将细胞重悬至2×10^5/ml，按照2×10^4/孔，即100ul/孔加入96孔板培养过夜。实验设计加入培养的CIK细胞，50ul/孔，设置对照孔，无需加入CIK细胞的孔则用相同体积的培养基补入。加入CIK细胞的同时按实验设计加入相应抗体，50ul/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。48h后取出96孔板，此过程中的所有上清及细胞悬液均对应收集到1.5ml EP管中，离心500g×5min。弃上清，各孔加入150ul 1％FBS-PBS重悬混匀细胞。各管于流式上机前10-15min加入PI(终浓度为1ug/ml)流式上机检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞Raji的死亡率。检测结果见图13，细胞杀伤结果显示CD20×CD3 MSBODY双特异性抗体介导CIK细胞杀伤肿瘤细胞显示良好的杀伤效果，其最大杀伤效率和EC50都明显强于美罗华单抗。

3.双抗体有效介导PBMC细胞杀伤肿瘤细胞检测

制备Raji单细胞悬液。用终浓度为5uM的CFSE染色(染色步骤见protocol-1 CFSE染色)，染色后用该细胞培养的10％FBS-1640将细胞重悬至2×10^5/ml，按照2×10^4/孔，即100ul/孔加入96孔板培养过夜。实验设计加入PBMC细胞，50ul/孔，设置对照孔，无需加入PBMC细胞的孔则用相同体积的培养基补入。加入PBMC细胞的同时按实验设计加入相应抗体，50ul/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。48h后取出96孔板，此过程中的所有上清及细胞悬液均对应收集到1.5ml EP管中，离心500g×5min。弃上清，各孔加入150ul 1％FBS-PBS重悬混匀细胞。各管于流式上机前10-15min加入PI(终浓度为1ug/ml)流式上机检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞Raji的死亡率。检测结果见图14，细胞杀伤结果显示CD20×CD3 MSBODY双特异性抗体介导PBMC细胞杀伤肿瘤细胞显示良好的杀伤效果，其最大杀伤效率和EC50都明显强于美罗华单抗。

实施例6：双特异性抗体杀伤皮下移植瘤的药效检测

CD20×CD3 MSBODY药效学评价基于CD20表达阳性raji细胞建立的血液扩散瘤模型上完成。模型建立方法：1x10⁶ raji细胞通过尾静脉注射到雌性NOD/SCID小鼠体内。药效评价：接种raji细胞第3天对小鼠随机分组，其中对抗体治疗组回输包被有CD20×CD3MSBODY的人T细胞细胞1.6x10⁷/只(通过抗人CD3抗体和IL-2诱导人PBMC培养获得)，两个对照分别回输PBS和未包被抗体的人T细胞(所有回输治疗小鼠中均添加有IL-22000U/只)，首次回输治疗完毕后再在第6、9、12、14天对小鼠以相同的方式进行回输治疗。整个治疗过程当中对小鼠状态及体重实时监测，约15天后每天观察小鼠，统计各组生存率。

基于以上实验模型对CD20×CD3 MSBODY进行药效学评价后得到结果如图15显示，回输PBS和没有包被CD20×CD3 MSBODY的T细胞对照组在接种25天之后开始死亡，到28天后PBS组全部死亡，35天后T细胞组全部死亡，连续观察40天CD20×CD3 MSBODY给药治疗组小鼠存活率100％且身体健康状态正常。由此说明，T细胞在通过CD20×CD3MSBODY介导后结合并聚集在CD20阳性肿瘤细胞周围，通过CD3刺激T细胞产生的细胞毒杀伤肿瘤细胞，而对照组在没有T细胞或有T细胞没有CD20×CD3 MSBODY介导的情况下肿瘤细胞没有得到及时彻底的杀伤和清除。此结果与理论设计相符，通过CD20×CD3MSBODY介导的T细胞可以特异性的杀伤CD20阳性肿瘤细胞并发挥更大于单纯T细胞的杀伤作用。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。