一种从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法

摘要

本发明涉及一种从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法，是以中国蜂胶为原料，经过下述步骤：（1）中国蜂胶水提物的制备；（2）醇沉；（3）大孔吸附树脂粗分离；（4）半制备型高效液相色谱分离纯化。用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到3种高纯度的成分，经鉴定分别是咖啡酸、阿魏酸和异阿魏酸。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

说明书

技术领域

本发明属于化工领域，具体是涉及一种从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法。

背景技术

中国蜂胶具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂、降血糖等，因此广泛应用于食品和保健品工业。中国蜂胶的化学成分极其复杂，到目前为止，至少已分离鉴定出20余类300余种化学成分，包括酚酸、黄酮、氨基酸、类固醇等物质，其中酚酸和黄酮类成分为主要活性成分。中国蜂胶脂溶性部位主要含有黄酮类成分，而水溶性部位则主要含有有机酸类物质（如咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸等）。咖啡酸具有利胆、止血、升白的作用，它对各种急性细菌感染疾病、由放疗和化疗所致的白细胞减少症有显著的疗效；阿魏酸具有抗血小板凝集、降血脂、防治冠心病、清除自由基、抗菌消炎、抗肿瘤、抗突变、增加免疫功能等作用；异阿魏酸具有很强的抗炎活性。

由于蜂胶易溶于乙醇，因此有关中国蜂胶脂溶性部位的化学成分研究的报道非常多，而水溶性部位的化学成分的研究报道相对较少。为了实现对中国蜂胶的综合利用，本发明提供了一种简单快速的从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单快速的从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法。

本发明的方案如下：

从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法，其步骤为：

（1）中国蜂胶水提物的制备：将中国蜂胶冷冻，粉碎，用蒸馏水加热提取，过滤，水提液自然冷却至室温，将上层凝固的蜂蜡除去，下层水溶液经减压浓缩至相对密度为1.2左右。

（2）醇沉：向上述浓缩液中加入95%乙醇至乙醇含量为70%左右，静置过夜，取上清液浓缩得浸膏。

（3）大孔吸附树脂粗分离：将上述浸膏以适量水溶解后上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再依次用20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液为流动相梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱部分，浓缩，得样品1。

（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将样品1用半制备型高效液相色谱分离纯化，色谱柱为C₁₈ SMB 100柱(400 mm×25.4 mm I.D., 10 μm)，流动相为甲醇-水，检测波长为280 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热提取时提取时间为0.5-2.5小时，提取次数为2-6次。更加优选的是，提取时间为2小时，提取次数为4次。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时蒸馏水的用量为3倍量-10倍量（优选8倍量）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热提取时的温度60℃-90℃（优选80℃）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）对中国蜂胶水提物的粗分离所用的HPD系列的大孔吸附树脂的型号有100、400、500、600、722和826（优选826）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（4）半制备型高效液相色谱分离纯化所用甲醇的浓度为10%-20%（优选15%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（4）分离纯化用甲醇-水溶液进行洗脱，洗脱液的流速为20-30 mL/min（优选25 mL/min）。

本发明涉及一种从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法，步骤为：（1）中国蜂胶水提物的制备：取粉碎好的中国蜂胶，用蒸馏水加热提取，过滤，水提液自然冷却，除去上层凝固的蜂蜡，提取液经减压浓缩至相对密度为1.2左右。（2）醇沉：向上述浓缩液中加入95%乙醇至乙醇含量为70%左右，静置过夜，取上清液浓缩得浸膏。（3）大孔吸附树脂粗分离：将上述浸膏以适量水溶解后上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再依次用20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液为流动相梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱部分，浓缩得样品1。（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将样品1用半制备型高效液相色谱分离纯化，色谱柱为C₁₈ SMB 100柱(400 mm×25.4 mm I.D., 10 μm)，流动相为甲醇-水，检测波长为280 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。该工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

本发明从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法，首先用水提醇沉的方法将水溶性化学成分提取出来，可以使脂溶性成分尽可能不被溶出，多糖类成分沉淀分离除去；再用大孔吸附树脂对中国蜂胶水溶性部位进行粗分离，经过粗分离可以对化合物实现分组，这一点可以从图1和图2中看出；最后用半制备型高效液相色谱法进行分离纯化就可以得到3种化合物，所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图4至图6中看出。除此之外，还具有如下优势：

（1）中国蜂胶水提液自然冷却至室温后，蜂蜡会自动析出，凝固的蜂蜡很容易除去，反复处理几次，可以除去水提物中绝大多数的蜂蜡。水提物经过醇沉后可以将多糖除去，可以最大程度降低大孔吸附树脂被污染的程度。

（2）用大孔吸附树脂对中国蜂胶水提物进行粗分离，用水作流动相可以除去绝大多数强极性杂质，用不同浓度的乙醇-水溶液梯度洗脱可以使混合物实现分组，组成得到简化。

（3）用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到3种高纯度单体化合物，该方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。

（4）提取、分离、纯化过程中仅用到水、乙醇和甲醇，不使用对环境和人体危害大的氯仿、苯等有机溶剂，乙醇-水、甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后可以重复使用多次，绿色环保。

（5）优化了半制备型高效液相色谱法的分离条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和效率都大为提高。

附图说明

图1是中国蜂胶水提物的高效液相色谱图。

图2是样品1的高效液相色谱图。

图3是样品1的半制备型高效液相色谱图。

图4是咖啡酸的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图5是阿魏酸的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图6是异阿魏酸的高效液相色谱图及紫外光谱图。

在图1-6中，I：咖啡酸；II：阿魏酸；III：异阿魏酸。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。

实施例：从中国蜂胶水提物中分离纯化咖啡酸、阿魏酸及异阿魏酸的方法，其步骤为：

（1）中国蜂胶水提物的制备：将中国蜂胶冷冻，粉碎，用8倍量蒸馏水于80℃水浴中加热提取4次，每次2 h，过滤，水提液自然冷却，除去上层凝固的蜂蜡后经减压浓缩至相对密度为1.2左右。

（2）醇沉：向上述浓缩液中加入约2倍量95%乙醇至乙醇含量为70%左右，静置过夜，取上清液浓缩得浸膏。

（3）大孔吸附树脂粗分离：将上述浸膏以适量水溶解后上HPD826型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再依次用20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液为流动相梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱部分，浓缩，得样品1。

（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将样品1用半制备型高效液相色谱分离纯化，色谱柱为C₁₈ SMB 100柱（400 mm×25.4 mm I. D., 10 μm），流动相为甲醇-水（15：85，V/V），检测波长为280 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。

发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30 mL/min（优选25 mL/min），优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：

表一 样品1的制备型高效液相色谱分离条件

在实施例1中，采用20%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分洗脱时间较短，但相互之间分离效果不够理想，所得成分纯度较低。实施例2中采用15%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例3中采用10%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分分离良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。

图3是当选用实施例2体系时的半制备型高效液相色谱图，由图3可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，纯度高于98%，这一点可从图4至图6中看出。

经现代波谱数据证实所提取纯化得到的3个化合物的化学结构式如下：

 

咖啡酸                                              阿魏酸                                 异阿魏酸

3个化合物的鉴定结果如下：

咖啡酸：¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm: 12.01 (1H, br, -COOH), 8.90~9.90 (2H, br, 4-OH, 3-OH), 7.42 (1H, d, J=16 Hz, 7-H ), 7.02 (1H, d, J=2.0 Hz, 2-H), 6.96 (1H, dd, J=2.0, 8.0 Hz, 6-H), 6.76 (1H, d, J=8.0 Hz, 5-H ), 6.17 (1H, d, J=15.9 Hz, 8-H ). ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δppm: 167.80 (9-C), 148.07 (4-C), 145.50 (3-C), 144.49 (7-C), 125.67(1-C), 121.07 (8-C), 115.71 (2-C), 115.10 (5-C), 114.59 (6-C).

阿魏酸：¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm: 7.45 (1H, d, J=16.0 Hz, 7-H), 7.09 (1H, s, 2-H), 7.07 (1H, s, 6-H), 6.94 (1H, d, J=8.0 Hz, 5-H), 6.24 (1H, d, J=15.6 Hz, 8-H), 3.81 (3H, s, -OCH₃). ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δppm: 167.66 (9-C), 149.79 (3-C), 146.63 (4-C), 144.10 (7-C), 127.05 (1-C), 120.89 (6-C), 116.22 (2-C), 114.05 (5-C), 111.99 (8-C), 55.59 (OCH₃).

异阿魏酸：¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm: 7.45 (1H, d, J=15.6 Hz, 7-H), 7.09 (1H, d, J=2.0 Hz, 5-H), 7.07 (1H, s, 2-H), 6.95 (1H, d, J=8.0 Hz, 6-H), 6.24 (1H, d, J=16.0 Hz, 8-H), 3.81 (3H, s, -OCH₃). ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δppm: 167.76 (9-C), 149.82 (4-C), 146.64 (3-C), 144.14 (7-C), 127.06 (1-C), 120.97 (8-C), 116.25 (6-C), 114.06 (2-C), 111.95 (5-C), 55.60 (OCH₃).

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。