用于CD4+T细胞群之抗原特异性扩增的标准化离体平台

摘要

本发明涉及出于免疫诊断或治疗目的，用于以抗原特异性的方式分离和扩增人T细胞群的方法、肽、核酸和细胞。本发明还涉及衍生自人多能干细胞的专职抗原呈递细胞，以及通过所述抗原呈递细胞实现的可定制抗原呈递。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年5月8日提交的序列号为61/644265的美国申请 的优先权，并且其公开内容通过引用包括在本文中。

技术领域

本发明涉及出于免疫诊断或治疗目的，用于以抗原特异性的方式分离 和扩增人T细胞群的方法、肽、核酸和细胞。本发明还涉及衍生自人多 能干细胞的专职抗原呈递细胞(professional antigen presenting cell)，以 及通过抗原呈递细胞实现的可定制(customizable)抗原呈递。

背景技术

CD4⁺T细胞在适应性免疫中作为炎症、耐受性的介导者和作为B细 胞成熟的促进者发挥重要作用(Pao等，1996；Klein等，2010)。人CD4⁺T细胞库包含以百万计的不同的细胞，这些细胞表达不同的T细胞受体 (TCR)。的确，许多人类病症涉及CD4⁺T细胞的离散亚群，其响应于 高特异性抗原而增殖，并且分离可能与特定疾病相关的小比例的CD4⁺细 胞是一项艰巨的任务。因此，在临床或治疗条件(setting)中尚未能实现 具有应答特定肽之TCR的CD4⁺T细胞的常规分离或表征。

由T细胞群所示出的巨大TCR库是在胸腺发育期间存在于胸腺的未 成熟T细胞的阿尔法(α)和贝塔(β)，或者伽马(γ)和德尔塔(δ)TCR 基因体细胞重组事件的结果(Haas等，1993；Hayday等，1995)。该重 组过程产生了具有以百万计的不同TCR组合的T细胞库，其集体地与每 个可能的氨基酸序列结合(Haas等，1993；Hayday等，1995)。该库在 静息状态通过血管和淋巴系统循环，直到T细胞遇到具有组织相容性复 合物(HLA II类)的专职APC(例如树突细胞(DC))，所述专职APC 呈递以适当的亲和力与其TCR结合的肽(Wen等，1998；Sakaguchi等， 2000；Huang等，2012)。细胞和CD4⁺T细胞之间形成的免疫突触刺激 增殖，从而产生数十到数千个克隆。新产生的T细胞离开次级淋巴器官， 借助循环通过身体并且在呈递抗原的部位积聚。活化的CD4⁺T细胞释放 细胞因子，所述细胞因子作用于邻近的细胞并协调适应性免疫应答。数天 后，在抗原的来源被减弱后，大多数克隆通过激活诱导的细胞死亡而消除， 少数作为记忆细胞(准备好只要抗原(病原体)再次出现即触发快速应答) 保留的克隆除外(Wen等，1998；Villadangos等，2005)。

从新鲜全血中分离的许多CD4⁺T细胞将分裂一次或两次，但为了临 床应用目的的实现需要额外的增殖周期。例如，在测定期间相对稳健地分 裂(例如，超过5次)的CD4⁺T细胞的比例可用于指示对未知肽的反应 性。包含单一的蛋白质或肽的不同片段的组可以用来创建与响应于该抗原 的CD4⁺T细胞有关的增殖谱。然后从这些结果推导的信息可用于确定多 种人类病症的状态和可能的作用进程。然而，CD4⁺T细胞的临床表征受 到成功扩增抗原特异性CD4⁺T细胞群所需的适当的APC之制备的可用 性和可变性的限制。

使分离或表征抗原特异性CD4⁺T细胞群的诊断和治疗方法的开发进 一步复杂化的是人群中的人HLA-DR受体的异质性。简言之，II类HLA 复合物包含HLA-DRB和HLA-DRA受体的异源二聚体，其形成含有肽 的结合口袋(binding pocket)。人群中包含数十种，也许数百种不同的 HLA-DRB等位基因。因此，在人群中，大量的HLA II类等位基因与以 百万计的可能的TCR组合相组合，使得技术上难以从病源T细胞驱动的 自身免疫病症中分离抗原特异性CD4⁺T细胞(Villdangos等，2005；Huang 等，2012)，例如I型糖尿病(Haskins等，2011；Goianovich等，2012； Delong等，2012)、类风湿性关节炎(Nikken等，2011；Albani等，2011) 和多发性硬化(McFarland等，2007；Codarri等，2012；Sallusto等， 2012)。简而言之，在一个人中与给定肽结合的TCR在另一人中可能不与 相同的肽结合，这是因为个体表达不同的HLA-DRB等位基因，从而致使 通用探针的开发复杂化而且在某种程度上难以再现。然而，HLA-DRA等 位基因只有两个，其中一个见于98％的人群中。因此，利用广泛表达的 HLA-DRA等位基因评估特异性CD4⁺T细胞应答的方法将适用于绝大部 分人群。

因此，鉴于上述讨论，本文中描述的组合物和方法用于提供对CD4⁺T 细胞应答进行标准化分析的平台。这些方法和组合物包括一个分化方案， 其由人胚胎干细胞(hESC)有效地产生髓系树突细胞(DC)，其可用于 刺激从全血中分离的抗原特异性CD4⁺T细胞。总之，虽然CD4⁺T细胞 的临床表征受到原代树突细胞(DC)制备的可变性的限制，但是使用干 细胞衍生的DC，通过提供一种充分表征的并且功能上可修改的APC群 来分析T细胞对任何给定抗原的应答避免了这个问题。

发明内容

本发明提供了利用人胚胎干细胞(hESC)衍生的树突细胞以抗原特 异性的方式离体刺激CD4⁺T细胞群增殖的组合物和方法。本发明的树突 细胞是可定制的，因为任何可想到的驱动抗原特异性CD4⁺T细胞应答的 肽抗原均可被呈递到树突细胞的表面，并用于表征特异性CD4⁺T细胞应 答。因此，本发明包括任何用于对在多个对象个体中对特定抗原的免疫应 答进行比较或者在同一对象中在不同时间对特定抗原的免疫应答进行比 较的标准化方法。类似地，本发明提供了为了多种其他目的扩增抗原特异 性CD4⁺T细胞群的方法，例如用作细胞疫苗或作为可以被重新引入到患 者的活化的CD4⁺T细胞群以治疗可通过增强对特定肽靶标之免疫应答缓 解的疾病。例如，在某一抗原特异性CD4⁺T细胞群被认为有利但数目不 足的情况下，可以体外扩增那些细胞并将其返回至对象。此外，在其中高 增殖性CD4⁺T细胞被认为有害(例如，自身免疫)的情况下，可体外扩 增那些细胞并将其重编程为调节性T细胞(Treg)，其在返回到对象时将 抑制那些特异性T细胞应答。

本发明的优点包括但不限于，使用相对少量的血液从任何人中鉴别和 分离人CD4⁺T细胞亚群的能力。本发明的用途可包括但不限于，表征对 疫苗的应答，以及诊断和/或治疗涉及CD4⁺T细胞应答和/或CD4⁺T细胞 库变化的人疾病。例如，本发明提供了用于诊断和治疗以下疾病的方法和 组合物：阿尔茨海默病、多发性硬化、狼疮、银屑病、获得性免疫缺陷综 合征(AIDS)、重症综合性免疫缺陷综合征(SCID)、重症肌无力、类风 湿性关节炎、I型糖尿病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、桥本脑炎、多肌 炎、舍格伦综合征、克罗恩病、横贯性脊髓炎、血管炎、韦格纳肉芽肿病、 帕金森病、肌营养不良、白癜风、自身免疫性心脏病、腹腔疾病、吉兰- 巴雷综合征、发作性睡病、病因不明的自身免疫性疾病、自闭症和过敏。

附图说明

图1举例说明了hESC向共同髓系祖细胞的分化，其包括：

(A)示出光滑边缘的多能hESC(H9)集落的显微照片；(B)表明H9 细胞多能性的SSEA4免疫染色的流式细胞术直方图；(C)平板接种 (plating)后不久30至50个hESC细胞的小团块附着到OP9细胞上；(D) hESC/OP9共培养4天后分化的集落；(E)共培养8天后示出大的分化集 落；(F)流式细胞术直方图示出共培养8天后，分离自集落的CD34⁺细 胞(红色)，同种型对照是黑色；(G)在平板接种到pHEMA包被的培养 瓶1天后，单细胞悬液重新形成聚集体；(H)是(G)的插图，示出具有 南瓜形无颗粒形态的髓系细胞的大聚集体，且OP9细胞没有附着在经包 被的培养瓶上并经历细胞凋亡；(I)在含GM-CSF的培养基中培养3天 后，大多数髓系细胞开始从聚集体分离，培养物中出现单个的CMP；(J-L) 流式细胞术点状图示出CD34和CD45的相对表达，包括(J)CD34^lo/CD45^hi群由第一天的2-4％增加至(K)第三天的20-30％，以及(L)第12天的 60-70％；(M)J-L的同种型对照；(N)12天后CD45⁺染色的直方图；和 (O)CMP分化和扩增12天后CD43⁺免疫染色的直方图。标尺＝10微米。

图2举例说明了由图1中举例说明的干细胞标志物(HSC)向共同髓 系祖细胞分化的十二天期间内，HSC的表达减少而髓系细胞标志物的表 达增加。在直方图中，抗原和同种型对照分别用红色和黑色表示。

图3举例说明了hESC衍生的树突细胞(DC)的形态和功能活性， 包括：(A)用GM-CSF和IL-4培养10天后，显著比例的细胞分化为未 成熟(i)DC，其(箭头)比未分化的CMP(楔形)更大更亮；(B)显 微照片显示被iDC吞噬羧化物修饰的红色荧光乳胶珠(2微米大小)，明 场图像的荧光叠加示出iDC中的荧光珠(箭头)；(C)前侧散射和侧向散 射(FSC/SSC)的点状图示出具有内化珠的iDC；(D)流式细胞术的直 方图显示由iDC内化的红色荧光珠(FL4通道)；(E)用TNF-α和LPS 刺激了72个小时的iDC的图像；(F)是B框住的细胞的插图，箭表示长 突起(processes)以及成熟DC的形态；(G)使用霍夫曼光学显示的成 熟DC的DIC图像；(H)成熟DC的苏木精染色示出长树枝状突起(箭) 和暗紫色的核；(I)流式细胞术显示用TNF-α和LPS诱导成熟iDC的 DC标志(DCsign)免疫染色(红色)和未用TNF-α和LPS诱导成熟iDC 的DC标志免疫染色(蓝色)；(J)流式细胞术示出DC成熟之后CD80⁺免疫染色增加；(K)TNF-α和LPS诱导成熟后CD86⁺免疫染色；和(L) 在成熟DC上HLA-DR的表面表达。

图4举例说明了流式细胞术结果，示出在CMP向DC分化期间的第 8、12、和14天，DC标志物的表达。在第12天时给出了DC成熟的因 素。在该直方图中，抗原和同种型对照分别用红色和黑色表示。

图5举例说明了hESC衍生的DC需要两个群以形成激活岛(islands  of activation，IOA)，包括：(A)用于处理DC以与T细胞共培养的方案 的示意图；(B)iDC的流式细胞术点状图，示出FSC/SSC点状图上选通 的群；(C)在B中选通之群的DC标志/FSC图，Q1-UR(42.8％)是DC 标志⁺细胞。(D)在图B中选通之群的CD14⁺/FSC点状图，Q5-UR(51.3 ％)；(E)DC标志的点状图：CD14示出CD14^lo/DC标志^hi与CD14^hi/DC 标志^lo的比例为1∶1.5，定义为比例均衡的DC；(F)DC与成熟因子混合 的显微照片，示出激活岛(IOA)；(G)IOA的高倍率明场图像；(H)IOA 的相差图像，注意薄的边缘；(I)用抗-CD14的磁性微珠纯化的DC不包 括DC标志^hi/CD14^lo群，(J)不形成IOA；(K)用抗-DC标志MACS微 珠纯化的DC不包括DC标志^lo/CD14^hi群，和(L)不形成IOA。

图6举例说明了CD4⁺T细胞的纯化和用成熟DC刺激，其包括：(A) 概述从全血中纯化T细胞的示意图；(B)流式细胞术的点状图(FSC/SSC) 显示选通的T细胞群，和(C)直方图显示选通之群的抗CD4免疫染色； (D)经纯化T细胞的低倍率显微照片显示出均一的形态。(E)直方图示 出第0天CD4⁺T细胞的CFSE免疫染色及(F)与DC和IL-2共培养十 天后，其示出随着每次细胞分裂，子代细胞的荧光减半，如在从1至7 次每次的细胞分裂由红色数字所指示；(G)由Dil标记的T细胞和DC 组成的激活岛的照片；(H)使用DAPI对细胞进行核染色，将假着色的 红色作为对照，示出中间的大DC核和周界附近的小T细胞核；(I)是(G) 和(H)的合并图像；(J)用IL-2和来自标准制备物的DC孵育的CD4⁺T细胞中CFSE荧光的直方图，和(K)DC标志纯化的制备物，和(L) CD14纯化的制备物。

图7举例说明了DC-诱导的T细胞增殖的分析，包括：(A)三个直 方图显示在接种疫苗之前从人对象(对象1至3)中分离的并且已与hESC 衍生的DC共培养之CD4⁺T细胞的CFSE荧光，所述hESC衍生的DC 已被预先加载(pre-loaded)了流感肽(INF，蓝色)或无肽(对照，红 色)；(B)三个直方图显示接种流感疫苗1周后从同一对象中分离的并且 已与已被预先加载流感肽(INF，蓝色)或无肽(对照，红色)的DC共 培养之CD4⁺T细胞的CFSE荧光；(C)与对照DC(对照)共培养的疫 苗接种后CD4⁺T细胞CFSE荧光的三个直方图，其中虚线表示从含IL-2 的同伴培养物(companion culture)计算的第五次细胞分裂；(D)与已 被预先加载流感肽(INF)的DC共培养的疫苗接种后CD4⁺T细胞的CFSE 荧光；(E)柱状图示出在接种流感疫苗之前和之后三个人对象的CD4⁺T 细胞的相对增殖(分裂5至7次)。白色柱表示在含预先加载流感肽(INF) 之DC的培养物中CD4+T细胞的增殖；黑色柱表示含有未加载肽(对照) 之DC培养物中CD4⁺T细胞的增殖；(F)柱状图显示在三个对照对象(c1 至3)和六个诊断推定为患有阿尔茨海默病的对象(AD1至6)中CD4⁺T 细胞的增殖(5到7次分裂)。白色柱表示在含有预先加载人Aβ1-42肽之 DC的培养物中CD4⁺T细胞的增殖(5至7次分裂)；黑色柱表示含有未 预先加载肽之DC的培养物中CD4⁺T细胞的增殖(5至7次分裂)。

图8示出pCR8/GW-TOPO-HLADRA+接头载体的质粒图谱。

图9示出HLA-DRA的全长DNA和氨基酸序列。

图10示出[Genbank登录号CAI18477.1](人淀粉样蛋白β)的全长 DNA序列和氨基酸序列。

图11示出HLA-DRA/Aβ1-13融合蛋白的氨基酸序列，其包含信号 肽(No.1)、信号肽切割位点(No.2)、Aβ1-13(No.3)、接头(No.4) 和HLA-DRA(No.5)。

图12示出HLA-DRA/Aβ7-13融合蛋白的氨基酸序列，其包含信号 肽(No.1)、信号肽切割位点(No.2)、Aβ7-13(No.3)、接头(No.4) 和HLA-DRA(No.5)。

图13示出HLA-DRA/Aβ16-30融合蛋白的氨基酸序列，其包含信号 肽(No.1)、信号肽切割位点(No.2)、Aβ16-30(No.3)、接头(No.4) 和HLA-DRA(No.5)。

图14示出HLA-DRA/Aβ24-35融合蛋白的氨基酸序列，其包含信号 肽(No.1)、信号肽切割位点(No.2)、Aβ24-35(No.3)、接头(No.4) 和HLA-DRA(No.5)。

图15示出HLA-DRA/Aβ31-42融合蛋白的氨基酸序列，其包含信号 肽(No.1)、信号肽切割位点(No.2)、Aβ31-42(No.3)、接头(No.4) 和HLA-DRA(No.5)。该Aβ31-42包含T411替换。

图16示出HLA-DRA/Aβ7-23融合蛋白的氨基酸序列，其包含信号肽 (No.1)、信号肽切割位点(No.2)、Aβ7-23(No.3)、接头(No.4)和 HLA-DRA(No.5)。

图17示出HLA-DRA/Aβ1-13融合构建体的DNA和氨基酸序列。

图18示出HLA-DRA/Aβ7-13融合构建体的DNA和氨基酸序列。

图19示出HLA-DRA/Aβ16-30融合构建体的DNA和氨基酸序列。

图20示出HLA-DRA/Aβ24-35融合构建体的DNA和氨基酸序列。

图21示出HLA-DRA/Aβ31-42融合构建体的DNA和氨基酸序列。

图22示出HLA-DRA/Aβ7-23融合构建体的DNA和氨基酸序列。

图23示出感染了改造为表达任一绿色荧光蛋白(GFP)(其充当载体 对照，泳道1)和下面的各HLA-DRA/Aβ融合蛋白之慢病毒的293细胞 之细胞裂解物的Western印迹，分别是：HLA-DRA/Aβ1-13(泳道2)； HLA-DRA/Aβ7-13(泳道3)；HLA-DRA/Aβ16-30(泳道4)；HLA-DRA/Aβ 24-35(泳道5)，和HLA-DRA/Aβ31-42(泳道6)。

图24示出在人树突细胞系KG-1中表达的重组HLA-DRA构建体的 表面表达。左上方显示具有所示选通的KG-1细胞的FDC/SSC散点图。 上部中图显示，在无刺激的条件下，KG-1细胞的抗HLA-DRA免疫染色。 右上图显示，LPS刺激后KG-1细胞的抗HLA-DRA免疫染色。与感染了 表达HLA-DRA/Aβ7-13的慢病毒的细胞(蓝色)相比，对照细胞(红色) 示出较少的HLA-DRA染色。同种型对照染色在所有图中用黑色显示。 下方四个图示出感染含有上述HLA-DRA/Aβ7-13、HLA-DRA/Aβ16-30、 HLA-DRA/Aβ24-35和HLA-DRA/Aβ31-42之慢病毒载体的KG-1细胞 的HLA-DRA免疫染色类似的增加。

图25示出：(A)FSC/SSC散点图表示在那些细胞的混合物中检测到 hESC-衍生的髓系树突细胞(DC)和从一个或更多个新鲜血液样品分离 的T细胞。在流式细胞仪分析之前，用CFSE预先标记T细胞，然后与 DC混合，接着混合物中的所有细胞用与荧光缀合的抗CD4染色。在这 一步中fsc/ssc用来将潜在的T细胞与其它选通出来的群(包括DC和非 DC)分离。我们未证明它们是DC。荧光标记的CD4⁺细胞从一个较小的 亚群中选通。并不是所有在DC群中的检测事件都是实际上的DC；(B) 仅(A)所示的CD4⁺T细胞群的T细胞选通的FSC/SSC散点图；(B) 中描述了CD4⁺T细胞群的散点图(x轴为CFSE荧光，y轴为抗CD4) 显示已分裂(即，增殖)的T细胞中包含较少的CFSE，从而由图左侧表 示细胞群，并且在实验开始时没有可测量的增殖，因此在左边没有细胞； (D)示出(C)中所示的散点图，只是T细胞和DC的混合物在进行分 析之前在对照条件下(T细胞与不表达HLA-DRA(Ab)构建体的DC一 起培养)或试验条件下(T细胞与表达HLA-DRA(Ab)构建体的DC一 起培养)一起培养十天。对照的细胞群，其被表示为绿色的事件，具有其 CD4⁺T细胞总群的2.6％(图左侧描绘的)，即，图的这一侧示出的是分 裂的细胞。实验的细胞群，其被表示为红色的事件，具有其CD4⁺T细胞 总群的2.6％(图左侧描绘的)。3.8和2.6之间的差异表示Aβ特异性T 细胞群。图25(E)示出已感染了被改造以表达HLA-DRA构建体(分别 含有全长Aβ、A1(Aβ1-13)、B2(Aβ7-13)、C3(Aβ16-30)、D4(Aβ24-35) 或E5(Aβ1-42))之慢病毒的CD4⁺T细胞群的FSC/SSC散点图(x轴为 CFSE荧光，y轴为抗CD4)。

图26显示从具有ApoE3/E3基因型，并且没有痴呆迹象的47岁男性 之血液中分离的CD4⁺T细胞的细胞增殖响应的柱状图。该CD4⁺T细胞 与hESC衍生的已感染了被改造以表达HLA-DRA构建体之慢病毒的DC 共培养，所述HLA-DRA构建体分别包含仅HLA-DRA(对照)、A1 (Aβ1-13)、B2(Aβ7-13)、C3(Aβ16-30)、D4(Aβ24-35)或E5(Aβ1-42)。 柱代表经历5次或更多次细胞分裂的细胞的比例，即，指示一个持续和特 定的增殖响应。

图27示出与图26所示相同类型的数据，只是供血者是一位具有 ApoE3/E3基因型的、没有阿尔茨海默病迹象的88岁男性。

图28示出与图26所示相同类型的数据，只是供血者是一位具有 ApoE4/E4基因型的、已被诊断出患有阿尔茨海默病14年的86岁女性。

图29示出与图26所示相同类型的数据，只是供血者是一位具有 ApoE3/E4基因型的58岁的女性，并且是一位患有晚期阿尔茨海默病的 母亲的女儿。该供血者是图30和图31中供血者的姐姐/妹妹。

图30示出与图26所示相同类型的数据，该供血者是图29图和图31 中供血者56岁的妹妹，和她姐姐一样，具有APOE3/E4基因型。

图32示出与图26所示相同类型的数据，该供血者是图30和图31 中供血者的61岁的姐姐。和她妹妹一样，具有APOE3/E4基因型。

具体实施方式

本文所公开的本发明的方法和组合物涉及到评估人对象对多种肽抗 原的免疫应答。换言之，本发明涉及一种用于对多个对象个体中对特定抗 原免疫应答进行比较或者在同一对象中在不同的时间对特定抗原的免疫 应答进行比较的标准化方法。本发明包括在人II类白细胞(HLA)的环 境下对通过抗原呈递细胞(APC)呈递之任何肽抗原的免疫应答的分析。 本发明还特别涉及评估免疫应答的CD4⁺T细胞组分。

在多个实施方案中，本发明的方法将人胚胎干细胞(hESC)分化为 成熟的专职APC。例如，本发明的方法可以诱导hESC分化为共同的髓 系祖细胞，其进而可以分化为未成熟树突细胞，并且然后进一步分化为成 熟树突细胞。在多个实施方案中，本发明使H9hESC分化；然而，本领 域技术人员可以选择使用本领域中已知的任何人多能干细胞。例如，胚胎 干细胞可以选自胚胎干细胞系或者可以直接获自原代胚胎组织。已经建立 了多种胚胎干细胞系，包括但不限于：H1、H7、H9、H13和H14(Thompson 等)；hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03(BresaGen公司，Athens， Ga.)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ES Cell International 公司，Singapore)；HSF-1、HSF-6(旧金山加利福尼亚大学)；13、14、 16(Technion-Israel Institute of Technology，Haifa，Israel)；UCSF-1和 UCSF-2(Genbacev等，Fertil.Steril.83(5)：1517-29，2005)；HUES 1-17 系(Cowan等，NEJM 350(13)：1353-56，2004)；和ACT-14系(Klimanskaya 等，Lancet，365(9471)：1636-41，2005)。

如上所述，本发明的hESC衍生的成熟树突细胞在HLA II类分子的 情况中主要呈递单个肽抗原的片段。在本发明的APC上呈递的肽可以是 由本领域技术人员选择的为了评估针对包含该肽之抗原的CD4⁺T细胞应 答特异性的任意肽。在多个实施方案中，所述抗原包含的肽是疫苗组合物 的组分。例如，在多个实施方案中，抗原性肽包含流感HA的氨基酸126 至138(即，NH₂-HNTNGVTAACSHE-OH)，并且可在本发明的方法中 用以评估已施用(一种由GlaxoSmithKline，PLC销售的流 感病毒疫苗)之对象中的CD4⁺T细胞应答。

然而，由于本发明的方法涉及可用于对任何可引起CD4⁺T细胞应答 的肽的免疫应答进行评估的标准平台，本领域技术人员可以使用本发明的 方法来评估CD4⁺T细胞对任何可在对象中引起这样的应答的疫苗的应 答。因此，本发明可包括本领域中已知的疫苗的实例，还包括用于炭疽病 的AVA(BioThrax)；用于水痘的VAR(Varivax)和MMRV(ProQuad)； 用于白喉的DTaP(Daptacel、Infanrix、Tripedia)、Td(Decavaca、generic)、 DT(-generic-)、Tdap(Boostrix、Adacel)、DTaP-IPV(Kinrix)、 DTaP-HepB-IPV(Pediarix)、DTaP-IPV/Hib(Pentacel)和DTaP/Hib (TriHIBit)；用于甲型肝炎的HepA(Havrix、Vaqta)和HepA-HepB (Twinrix)；用于乙型肝炎的HepB(Engerix-B、RecombiVaxHB)、 Hib-HepB(Comvax)、DTaP-HepB-IPV(Pediarix)和HepA-HepB (Twinrix)；用于B型流感嗜血杆菌的Hib(ActHIB、PedvaxHIB、 Hiberix)、Hib-HepB(Comvax)、DTaP/Hib(TriHIBit)和DTaP-IPV/Hib (Pentacel)；用于人乳头瘤病毒(HPV)的HPV4(Gardasil)和HPV2 (Cervarix)；用于流行性感冒的TIV(Afluria，Agriflu、Fluarix、Fluvirin、 Fluzone)和LAIV(FluMist)；用于日本脑炎(JE)的JE(Ixiaro和JE-Vax)； 用于麻疹的MMR(M-M-RII)和MMRV(ProQuad)；用于脑膜炎的 MCV4(Menactra)、MPSV4(Menomune)和MODC(Menveo)；用于 流行性腮腺炎的MMR(M-M-RII)和MMRV(ProQuad)；用于百日咳 的DTaP(Daptacel、Infanrix、Tripedia)、Tdap(Adacel、Boostrix)、 DTaP-IPV(Kinrix)、DTaP-HepB-IPV(Pediarix)、DTaP-IPV/Hib (Pentacel)和DTaP/Hib(TriHIBit)；用于细菌性肺炎的PCV7(Prevnar)、 PCV13(Prevuar13)和PPSV23(Pneumovax 23)；用于脊髓灰质炎的 Polio(Ipol)、DTaP-IPV(Kinrix)、DTaP-HepB-IPV(Pediarix)和 DTaP-IPV/Hib(Pentacel)；狂犬病(Imovax Rabies和RabAvert)；用于 轮状病毒的RV1(Rotarix)和RV5(RotaTeq)；用于风疹的MMR (M-M-RII)和MMRV(ProQuad)；用于带状疱疹的ZOS(Zostavax)； 用于天花和猴痘的Vaccinia(ACAM2000、Dryvax)；用于破伤风的DTaP (Daptacel、Infanrix、Tripedia)、Td(Decavac、generic)、DT(-generic-)、 TT(-generic-)、Tdap(Boostrix、Adacel)、DTaP-IPV(Kinrix)、 DTaP-HepB-IPV(Pediarix)、DTaP-IPV/Hib(Pentacel)和DTaP/Hib (TriHIBit)；用于肺结核(TB)的BCG(TICE BCG、Mycobax)；用 于伤寒的Typhoid Oral(Vivotif)和Typhoid Polysaccharide(Typhim Vi) 和用于黄热病的YF(YF-Vax)。

除了涉及疫苗的肽之外，本发明的方法也基于CD4⁺T细胞对与指定 的自身免疫疾病状态相关联的特定肽的反应来对多种自身免疫疾病的治 疗进展进行诊断和追踪。如本文中所理解的，“自身免疫疾病”是由个体 自身组织产生并且针对个体自身组织的疾病或病症。自身免疫性疾病或病 症的实例包括，但不限于：关节炎(类风湿关节炎、幼年型类风湿关节炎、 骨关节炎、银屑病关节炎)、卡普兰综合征、费尔蒂氏综合征、银屑病、 皮炎、舍格伦综合征、施蒂林病、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解 症、全身性硬皮病和硬化、与炎性肠病有关的响应(responses associated  with inflammatory bowel disease)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫 综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结 肠炎、肾小球肾炎、过敏性疾病、湿疹、哮喘、涉及T细胞的浸润和慢 性炎症响应的病症(conditions involving infiltration of T cells and chronic  inflammatory responses)、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘 附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)、幼年型糖尿病、多发性硬化、过敏性 脑脊髓炎、与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相 关的免疫应答、结核病、结节病、包括韦格纳肉芽肿病的肉芽肿病、粒细 胞缺乏症、血管炎(包括ANCA)、再生障碍性贫血、戴-布贫血、包括自 身免疫性溶血性贫血(MBA)的免疫性溶血性贫血、恶性贫血、纯红细 胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏症、血友病A、自身免疫性中性白 细胞减少、全血细胞减少、白细胞减少、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神 经系统(CNS)炎性疾病、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体 复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经 炎、白塞氏病(Bechet disease)、卡斯尔曼综合征、古德帕斯丘综合征、 兰伯特-伊顿肌无力综合征、雷诺氏综合征(Reynaud′s syndrome)、舍格 伦综合征、史-约综合征、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、 类天疱疮(pemphigoid bullous)、天疱疮、自身免疫性多内分泌腺病、莱 特尔氏病、僵人综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM 多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓 性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、睾丸和卵巢的自 身免疫性疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、原发性甲状腺功能减 退症；自身免疫性内分泌疾病，包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎 (桥本氏甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、阿狄 森氏病、格雷夫斯氏病、自身免疫性多腺体综合征(或者多腺体内分泌病 综合征)、I型糖尿病也被称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和席汉氏综 合征；自身免疫性肝炎、淋巴细胞间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管 炎(非移植)和非特异性间质肺炎(NSIP)、吉-巴综合征、大血管血管炎 (包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎)、中血管血管炎(包括川 崎氏病和结节性多动脉炎)、强直性脊柱炎、贝尔热病(IgA肾病)、急进 性肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(麸质肠病)、冷球蛋 白血症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、冠状动脉疾病等。

在多个实施方案中，本发明的组合物和方法可用于评估CD4⁺T细胞 库对阿尔茨海默肽淀粉样蛋白-β(Aβ)的应答。简言之，Aβ是具有来源 于蛋白水解处理淀粉样前体蛋白(APP)得到的42个氨基酸的多肽。如 本文中所理解的，Aβ蛋白质还包括突变体和其通过氨基酸交换而衍生的 等位基因变体。在多个实施方案中，本发明的方法使用可包含Aβ1-13、 Aβ7-13、Aβ16-30、Aβ24-35、Aβ31-42和Aβ7-23的肽来替代全长Aβ。

在多个实施方案中，对所有Aβ肽广泛和强烈的应答表明正在进行对 Aβ和Aβ所有片段的免疫应答。本领域技术人员能解释这样的应答是对 积累的Aβ病理持续响应的指示，最终变得像无反应性开始一样变得较低 强健，最终导致在阿尔茨海默病后期阶段较低强健的CD4⁺应答。也就是 说，对Aβ或者某些Aβ片段具有相对强健CD4⁺响应的个体即便可能没有 发现认知上或行为上的改变，也将被认为患前阿尔茨海默病。

通常，在本发明的方法中可使用任何可使APC优选地呈递特定单一 肽片段的方法。例如，在多个实施方案中，本发明的方法通过直接向APC 培养物中添加足量的肽以以使APC的HLA II类分子呈递该肽或其片段 来加载APC。在本发明的多种另外的方法中，肽抗原在其中已引入编码 该肽之核酸的APC表面呈递。例如，可以在病毒或质粒载体中编码该肽。

在本发明的多种实施方案中，由APC呈递的肽是作为融合蛋白的肽 组分来被呈递的，所述融合蛋白还包括至少一部分HLA-II蛋白。例如， 本发明的融合蛋白可包含来源于人白细胞抗原(HLA)II类-DRA(HLA  II类α链的旁系同源)的核酸和氨基酸序列。在多种另外的实施方案中， 本发明的融合蛋白包括包含Aβ片段的HLA-DRA融合构建体。例如，作 为全长Aβ的替代，融合蛋白可包含Aβ1-13、Aβ7-13、Aβ16-30、Aβ24-35、 Aβ31-42和Aβ7-23。

HLA-DRAα链约33-35kDa并且它的基因含有5个外显子。外显子 1编码前导肽，外显子2和外显子3编码两个胞外结构域，和外显子4编 码跨膜结构域和胞质尾区。HLA-DRA在该肽结合部分不具有多态性，并 且作为用于β链DRB1、DRB3、DRB4和DRB5的唯一的α链。HLA-DRA 序列是公开可得的。例如，核苷酸和氨基酸序列可见于：GenBank登录 号CAI18477.1(氨基酸序列)、M60334.1(DNA序列)、NP_061984.2(氨 基酸序列)、AAA36275.1(氨基酸序列)、AAA59785.1(氨基酸序列)、 AAA36302.1(氨基酸序列)、AAAH71659.1、CAI18476.1(氨基酸序列) 和G13122(基因序列)；以及在EMBL登录号AL935032.13(DNA序列)、 CAG33294.1(氨基酸序列)、CAQ08811.1(DNA序列)和EAX03629.1 (DNA序列)。本领域技术人员将理解，HLA-DRA核酸和蛋白质分子可 不同于这些可公开获得的，例如导致一个或更多个替换、缺失、插入或其 组合同时仍保持了HLA-DRA之生物活性的多态性。因此，在本发明的 多个实施方案中，本发明融合蛋白的HLA-DRA组分的氨基酸序列可以 与图2中示例的HLA-DRA序列或其片段有约90％、约91％、约92％、 约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的同一 性。

在多个实施方案中，本发明的融合蛋白包含接头。通常接头是位于所 述HLA-DRA和融合蛋白所需的融合肽组分之间的柔性肽接头元件。接 头元件优选具有25个氨基酸或更小的长度。在某些实施方案中，接头元 件的长度为3至30个氨基酸，特别是长度为3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12至13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28或30个氨基酸。在一个实施方案中，接头元件的长度是5至25 个氨基酸、8至20个氨基酸或10至20个氨基酸。更优选地，接头的长 度为9至15个氨基酸。通常本文所用的接头元件可以由任何已知的氨基 酸或人工氨基酸衍生物组成。在某些实施方案中，接头元件由小的并且亲 水的非带电氨基酸构成。通常，根据本发明的接头元件可以包含选自G、 S、A和T的氨基酸。接头元件优选为甘氨酸/丝氨酸接头，即，基本上由 氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头，如聚甘氨酸。在本发明的某些实施 方案中，接头序列是IGGGSGGGGSGGGGS。

如上所述，本发明还涉及扩增肽抗原限定性CD4⁺T细胞群的方法。 在多个实施方案中，如上所示，本发明的方法涉及CD4⁺T细胞群的抗原 特异性扩增以对例如疫苗、自身免疫疾病、以及与Aβ沉积相关的认知疾 病产生免疫应答。

通常，本发明的方法可从使用标准的放血方法分离的全血中获得人 CD4⁺T细胞。初始的纯化去除了大多数髓系细胞和B细胞，富集T细胞 群。然后用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)将T细胞染色，然 后与表达一组HLA-Aβ融合蛋白的APC混合并共培养7至10天。在这 个孵育期后，细胞混合物用CD4-特异性荧光抗体染色并通过流式细胞仪， 例如荧光激活细胞扫描仪或分选仪。用CD4-阳性(CD4⁺)荧光来鉴别 CD4⁺T细胞，并使用CFSE的强度来确定自试验开始经历了多少次增殖。

如上所述，本发明的方法在APC中表达HLA-DRA融合蛋白。因此， 本发明的方法和组合物包括能够在APC中表达本发明的融合构建体的 DNA或RNA载体。通常载体包含启动子、待表达核苷酸序列的下游终止 子。在本发明的多个实施方案中，所述载体编码重组病毒。例如，在本发 明的某些实施方案中，所述载体包含来自慢病毒基因组的序列，例如FUW 慢病毒载体(描述于Science.2002年2月1日.295(5556)：868-72.Epub 2002年1月10日)。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法可以用作直接免疫方案的 一部分。例如，病毒载体、脂质体或其它递送方法可用来将HLA-DRA 融合蛋白构建体直接递送到淋巴结内。这种方法将允许在内源性APC的 HLA类II复合物中快速呈递未知肽。因此，本发明提供了传统疫苗方法 的理想替代方案，所述传统方法引入肽作为辅助复合物，其必须由APC 细胞进行处理然后搬运至淋巴结，这个过程可能需要进行三到七天。未知 结合HLA-DRA融合蛋白的直接递送和及时表达在产生对迅速致死的病 原体(如埃博拉病毒)的免疫反应中尤其有用。

实施例

实施例1.使用加载了流感抗原的hESC-衍生的DC来评估CD4⁺T细胞应 答的方法。

hESC的造血干细胞(HSC)分化。在具有5×补充剂的mTeSR培养 基(Stem Cell Technologies)中培养H9(NSCB代码WA09，第23代) hESC细胞系，该培养基补充有额外的bFGF(4微克/毫升，Life  Technologies)。使用标准的方法在基质胶(matrigel)中培养多能性 H9hESC的集落(图1A)，并且每5代用SSEA4染色检测多能性，通过 显微镜和流式细胞术对其进行评估(图1B)。轻柔地将集落刮为30至60 个细胞的团块，并将其收集到15毫升试管中，然后以300×g离心5分钟， 并重悬于HSC分化培养基中(HDM：α-MEM，10％FBS，100μM的单 硫代甘油)。

在收获H9细胞进行分化之前，清洗大约70％汇合的OP9小鼠基质 细胞(ATCC)的培养瓶并用HDM预孵育。OP9细胞在经凝胶化的 (G1393，Sigma)T75培养瓶中于OP9生长培养基(OP9M：α-MEM(Life  Technologies)，含有20％FBS(HyClone))中培养。将含有hESC细胞 团块的HDM直接加入到培养瓶中。在第4天将所有的HDM更换为新鲜 的HDM，并在第6天和第8天，将一半HDM培养基更换为新鲜的HDM。

在HDM中共培养2天后，H9集落的含HSC团块的初始造血分化附 着到OP9饲养层并开始(bega)(图1C)。共培养4天后，集落形态类似 于hESC集落，但细胞大小更易变(图1D)。8天后，含有HSC之集落 的形态是高度可变的，并且明显不同于光滑边缘，甚至出现了多能性 hESC集落(图1E)。CD34的免疫染色示出了共培养8天后从集落分离 的细胞的表达分析(图1F)。

共同髓系祖细胞的分化。在pHEMA包被的(Sigma)的T25培养瓶 内维持髓系细胞。为了诱导HSC分化为共同髓系祖细胞(CMP)，将细 胞用胶原酶IV(1毫克/毫升)在KnockOut DMEM/F-12(Life  Technologies)中于37℃处理20分钟，接着用0.05％胰蛋白酶-EDTA在 37℃处理15分钟。用10％的FBS淬灭胰蛋白酶活性，沉淀(300×g)， 重悬于髓系分化培养基(Myeloid differentiation medium，MDM)中， 并平板接种于pHEMA包被的培养瓶中。髓系扩增进行10至12天。MDM 包含α-MEM、10％FBS、100纳克/毫升GM-CSF、100μM的单硫代甘 油。MDM也可用来扩增髓系细胞数目。在重新平板接种的一天之内，分 化的CMP前体重新形成具有南瓜形核的团块(图1G，H)；3天后，团 块开始分解然后单细胞出现(图11)。包括CD34在内的HSC标志物的 表面表达降低的同时CMP标志物表达增加，所述CMP标志物包括CD14、 CD11b(SI2)、CD45(图1J-N)和CD43(图10；图2)。

未成熟树突细胞(iDC)的产生。为了在髓系扩增后产生髓系DC， 将细胞通过70微米的过滤器过滤并用25％分级以去除死细胞和 细胞团块(图5A)。用含5％FBS的PBS清洗细胞，并重新平板接种于 DC分化培养基(DDM)中8至10天。DDM是StemSFEM培养 基(Stem Cell Technologies)，补充有生长补充剂(Millipore)、 100纳克/毫升的GM-CSF、100纳克/毫升的IL-4(Endogen)。每四天用 新鲜的DDM更换iDC培养物中一半体积的DDM。为了扩大iDC的数目， 使它们在相同的条件下分裂和维持。在补充有TNF-α(100纳克/毫升) 和LPS(250纳克/毫升)的DDM中诱导DC成熟，保持3天。在DC分 化条件下8天后，iDC具有皱的形态(图3A)，并示出DC标志、CD80 和CD86的表面表达(图3I-K)。iDC的特征行为是病原体和细胞碎片的 吞噬作用，这是使用人免疫球蛋白包被的荧光胶乳珠测定的(Dagenault 等，2010)。更具体地说，将平均直径为2微米的羧化物修饰的红色荧光 胶乳珠(L3030，Sigma)在具有PBS的50％人AB血清中在37℃调理 30分钟。在孵育后，将这些经调理的乳胶珠添加到DC培养物中并且在 37℃轻柔摇动30分钟进行孵育。相同的对照在4℃孵育。30分钟后，通 过加入2毫升的冰冷的PBS终止吞噬作用，随后用冰冷的PBS洗涤细胞 两次。使DC重悬于1毫升冷的PBS中，且通过加入等体积的4％多聚甲 醛来固定，保持在4℃的暗处直到成像。iDC内化了这些珠子(图3B) 且流式细胞术显示大部分iDC具有吞噬的珠子(图3C，D)。

树突细胞的成熟。在用补充有100纳克/毫升的TNF-α(PeproTech) 和250纳克/毫升的LPS(Sigma)的DDM触发成熟之前，未成熟DC被 预先加载了目的肽。用相差显微术(图3E，F)、苏木精和伊红(H&E) 染色的光学显微术(图3G)以及DIC显微术(图3H)观察到成熟DC 具有分叉的树枝状突起。使用由细胞离心涂片器(Cytospin)铺展到玻片 上的经固定细胞(2％多聚甲醛)进行H&E染色。用H&E溶液覆盖具 有iDC和成熟DC的载玻片并孵育15分钟，随后用酸和蓝化溶液(bluing  solutions)(Vector Laboratories)处理。用水清洗载玻片，经过醇系列(50 ％、70％、95％、100％乙醇)并用Permount(Fisher)封装盖玻片。H &E染色的图像用安装在显微镜上的彩色CCD摄像头捕捉。

流式细胞术证实iDC和成熟DC两者都表达DC标志(图3I)。更具 体地，iDC培养物用Percoll分离进行纯化(图5A)，含有表达高水平DC 标志(图5B，C)或CD14(图5D)的群。一个群是DC标志^hi/CD14^lo， 另一个群是DC标志^lo/CD14^hi(图5E)。这些群通常分别是约1∶1.5的比 例。为了比例平衡的研究，用抗-CD14或抗-DC标志的磁珠纯化iDC。简 言之，将DC用70微米过滤器过滤以去除聚集体并用髓系树突细胞的试 剂盒纯化，用以分离表达CD14的细胞，随后通过MACS柱(Miltenyi) 纯化。将分离的细胞在DDM中培养4周。为了富集分离的DC标志^hi细 胞，我们使用人DC标志试剂盒(Miltenyi)来纯化细胞并且它们也在DDM 中扩增4周。

当将成熟DC与原代T细胞进行混合时，培养物在3到5天内形成 了细胞聚集体，称为“激活岛”(Islands of activation，IOA)(图5F-H)。 IOA通过第一荧光标记的DC成像，将它们在预热的含有Dil(2μM，Life  Technologies)的无血清培养基中在37℃孵育20分钟，且经分离的T细 胞用DiO(1μM)以相同的方式标记。孵育后，加入10倍体积的T细胞 培养基并在300×g离心5分钟沉淀细胞。然后用含有0.1％BSA的PBS 洗涤细胞两次。将荧光标记的DC(红色)和T细胞(绿色)混合，并在 一个pHEMA包被的培养瓶中过夜(16小时)培养，然后通过加入等体 积的4％多聚甲醛固定并静置30分钟。通过直接将DAPI添加到定影溶 液(20μM的终浓度)中来用DAPI标记细胞核。不对细胞进行洗涤，因 为离心和重悬可能会破坏IOA，所以用显微镜挑取IOA并放置于盖玻璃 底下的室来成像。IOA的图像由C1共聚焦显微镜捕捉。

iDC的纯化，用抗DC标志的磁珠富集DC标志^hi/CD14^lo群并去除大 部分DC标志^lo/CD14^hi群(图5I)，但防止IOA的形成(图5J)。互补性 研究中，用抗CD14磁珠富集DC标志^lo/CD14^hi细胞，降低了DC标志 ^hi/CD14^lo群(图5K)，并且还防止了IOA的形成(图5L)。

流式细胞术也证实，iDC和成熟DC两者都表达CD80(图3J)、CD86 (图3K)以及CD11c(图3)。HLA II类复合物在iDC的内体(endosome) 中隔离，并随着DC成熟被运输到表面(图3L)。

为了确定hESC-衍生的DC是否可以刺激T细胞增殖，从全血中分 离人T细胞(图6A)，用CFSE标记，并与加载抗原的成熟DC共培养7 至10天。之后，CD4⁺T细胞用抗CD4进行免疫染色并通过CD4⁺群的 CFSE荧光评估其增殖(图6B，C)。使用与DC和IL-2(Life Technologies) 一起孵育的T细胞(图6D)作为阳性对照，以确定连续细胞分裂的CFSE 荧光(图6E，F)。为了检测IOA，我们在将T细胞与成熟DC混合前， 用具有亲脂性的DiI荧光标记T细胞。第二天可以看到具有T细胞围绕 较大DC的IOA，(图6G-I)。与成熟DC和IL-2混合的T细胞的增殖多 达7代(图6J)，用抗DC标志(图6K)或抗CD14(图6L)磁珠纯化 的DC仅发生了5代增殖。

hESC-衍生的DC刺激流感HA肽特异性CD4⁺T细胞的增殖。T细胞 是从通过肌肉内注射接受市售流感疫苗由 GlaxoSmithKline分布)之前和一周后的人对象中抽取的20毫升全血样 品收集的。从对象抽取的全血在含EDTA的血管(#366643，BD  Biosciences)。在无菌条件下用PBS将血样稀释至1∶1，并且40毫升的 稀释样品在30毫升的的顶部分层，并以400×g旋转30 分钟。收集外周血淋巴细胞(PBL)层(图6A)并用PBS稀释(1∶7)， 随后以300×g离心10分钟。细胞用在通过将沉淀重悬在PBS中再清洗细 胞两次。存活的细胞用台盼蓝排除法(exclusion)计数。除去贴壁细胞以 使用尼龙羊毛柱富集T细胞。简言之，用T细胞培养基(RPMI1640，具 有10％FBS)洗涤尼龙羊毛柱并在37℃孵育一小时。然后，将10⁷个细胞 /毫升的PBL添加到预热的柱中并在37℃孵育1小时，在这之后通过打开 柱的旋塞来收集非贴壁细胞。该柱用5毫升T细胞培养基洗涤两次以收 集总流出物。T细胞富集的级分用CFSE溶液(4μM，在PBS中)在37 ℃水浴中孵育8分钟。孵育后，将溶液用10倍体积的T细胞培养基稀释， 通过离心(300×g，10分钟)沉淀，并用含有0.1％BSA的PBS洗涤两次。 对CFSE标记的细胞进行重悬、计数，并且一部分被用来通过流式细胞术 BD Biosciences)评估CFSE荧光。在流式细胞术之前，细胞 用647缀合的抗CD4抗体(BD Biosciences)进行免疫染色以允许 分析CD4⁺群中的CFSE荧光。另外流式细胞仪的数据和直方图的分析已 由FCS express 4流式细胞仪软件(全新的软件(De Novo Software))完 成。

将CFSE标记的T细胞与成熟DC共培养，所述成熟DC已被预先 加载了流感HA的免疫原性肽(氨基酸126至138， H-HNTNGVTAACSHE-OH，Anaspec)。(Le等，2010；Schmidt 等，2012)。DC的肽加载包含在水中重悬冻干的流感HA肽和十分之一 体积的10×PBS以中和pH值。在培养基中用终浓度为每毫升10微克的 流感肽加载未成熟DC，在湿润的含5％CO₂的培养箱中培养4天。然后 用如前所述的TNF-α和LPS使未成熟DC成熟。

对CD4⁺T细胞增殖的分析显示在疫苗前样品中对对照DC几乎没有 应答(图7A)，但疫苗接种后样品示出CD4⁺T细胞增殖的显著增加(图 7B，C)，可能是由于疫苗中佐剂的非特异性效应(Fox等，2012；Tetsutani 等，2012；Caproni等，2012)。被预先加载了流感肽的成熟DC也对疫 苗接种前的CD4⁺T细胞几乎没有刺激作用(图7A)，但疫苗接种后的T 细胞以增加的增殖来应答，该应答远高于对对照DC的应答(7B-E)。在 疫苗接种后测定中使用对照DC和流感-DC之间的唯一区别是流感肽的预 先加载，提示应答增加是由于流感特异性CD4⁺T细胞的增殖。

简言之，涉及人对象的所有程序都是在健康科学西部大学(Pomona， CA)、箭头地区医疗中心(Colton，CA)和Casa科利纳(Pomona，CA) 伦理审查委员会的批准下进行的。向所有参与者解释了知情同意书，并由 所有对象和/或法定监护人签字。

实施例2.阿尔茨海默病患者的Aβ-特异性CD4⁺T细胞应答的分析

为了评价hESC-衍生的DC是否可以检测慢性病症中的CD4⁺T细胞 应答，我们招募了六个推定诊断患有阿尔茨海默病(AD)的对象和三个 年龄匹配的对照者。根据与实施例1中所述相同的方法采集全血、处理并 分离T细胞。通过对根据上述用流感HA肽加载DC的相同方法预先加载 有10毫克/毫升的Aβ1-42肽(BioMer Technology)的成熟DC的应答来 评估CD4⁺T细胞增殖。

这种肽的不溶性沉积物积聚成神经炎脑斑(neuritic brain plaque)， 是阿尔茨海默病的病理的明确标志(Braak和Braak，1997)。Aβ特异性 的CD4⁺T细胞减弱了疾病的小鼠模型中阿尔茨海默病的病理和行为 (Ethell等，2006；Cao等，2009)。尝试用Aβ1-42疫苗接种作为阿尔茨 海默病的治疗方案，虽然有前景，但是由于对象子集(6％)中的脑膜炎 症，该试验被叫停(Orgogozo等，2003)。至今仍不清楚，在AD病因中 是否出现了Aβ特异性的T细胞应答，以及他们是否可以提供随着病情的 发展而淹没的早期有益影响(Ethell等，2002；Ethell和Buhler，2003； Cao等，2009年)。按照上述实施例1来制备T细胞，并将其与预先加载 Aβ1-42的成熟DC共培养。6个AD对象中的5个示出响应呈递Aβ之 DC的CD4⁺T细胞增殖比对照DC高三倍，然而对照对象均未表现出高 于2倍对照的响应(图7F)。对加载Aβ之DC没有增殖反应的一个AD 对象(AD4)，可能是由于不正确诊断，因为AD的确诊只能通过死后的大 脑病理做出(Alzheimer，1907；Fischer，1907)。

实施例3.用转染了改造为表达HLA-DRA-Aβ融合蛋白之慢病毒构建体之 hESC衍生的DC来评估CD4⁺T细胞应答的方法。

本发明的组合物和方法已被用来在36个人对象中评估CD4⁺T细胞 库对阿尔茨海默病的肽、淀粉样蛋白(Aβ)的应答。CD4⁺T细胞是从使 用标准放血的方法得到的全血中获得的。初始的基于尼龙羊毛的纯化方法 除去大部分的髓系细胞和B细胞，从而富集了T细胞群。然后用羧化物 荧光二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)将T细胞染色，然后与表达 HLA-DRA-Aβ融合蛋白的APC组混合并共培养7至10天。融合蛋白的 组包括全长Aβ、Aβ1-13、Aβ7-13、Aβ16-30、Aβ24-35、Aβ31-42、和Aβ7-23。 在孵育期后，将细胞混合物用CD4特异性荧光抗体进行染色，并通过流 式细胞仪。利用CD4特异性荧光来鉴别CD4⁺T细胞，并利用CFSE强度 来确定那些CD4⁺T细胞都经历了多少次增殖，因为T细胞最初是用CFSE 染色的。以下实施例举例说明了本发明的多个步骤。

HLA-DRA/淀粉样蛋白β融合构建体。人HLA II类α链(HLA-DRA， 提供了基因库入口)是按照如下方法克隆的：采用标准方法从1毫升全血 的人血外周血单核细胞(PBMC)中分离RNA，然后使用标准的反转录 方法来建立HLA-DRA cDNA模板。接着通过向含校对DNA聚合酶 “Phusion”(New England Biolabs)的标准聚合酶链反应(PCR)中添 加)HLA-DRA cDNA模板来扩增HLA-DRA核苷酸序列(引物是由发明 人Doug Ethell设计的HLA-DRAF(正向)： 5′-TTATTCTTGTCTGTTCTGCCTC；HLA-DRAR(反向)： 5′-CTTCTCTCTAAGAAACACCATCACCTC。PCR的产物溶解在琼脂 糖凝胶上，并且从凝胶中分离出正确大小(约2kb)的单一条带来，然后 按照制造商的说明连接到8/GWTA载体上(Invitrogen，Life  Technologies，Carisbad，CA)。选择一个包含有正确序列并且无突变之 HLA-DRA克隆的TA质粒。用定点诱变(SDM)在 HLA-DRA序列的5′末端引入编码多聚甘氨酸/丝氨酸接头的核苷酸序列。 从SDM得到的后续克隆的标准DNA测序来鉴定具有正确的序列的克隆。 图9示出所得到的8/GWHLA-DRA+接头质粒的质粒图谱。 SDM被用来与该质粒一起用于生成在这些研究中使用的各个淀粉样蛋白 β(Aβ)的融合构建体。具体地说，制造的Aβ+接头+HLA-DRA融合构 建体包含以下Aβ片段：Aβ1-13(图11)、Aβ7-13(图12)、Aβ16-30(图 13)、Aβ24-35(图14)、Aβ31-42(图15)和Aβ7-23(图16)。

使用标准的分子生物学克隆方法在FUW载体的多克隆位点EcoRI 位点处将各个上述Aβ+接头+HLA-DRA融合构建体从它们各自的 8/GW载体亚克隆到FUW慢病毒载体上(在Science.2002 年2月1日.295(5556)：868-72.Epub 2002 Jan 10中描述的)。在插入到 FUW载体之前，对每个Aβ+接头+HLA-DRA融合限制性片段进行凝胶纯 化。Aβ+接头+HLA-DRA插入的方向由限制性酶切消化来验证。具体地， 使用核酸酶XbaI和PstI来确认插入片段的方向。

Aβ+接头+HLA-DRA融合蛋白的蛋白表达由存在于FUW质粒上的 泛素化启动子驱动。Western印迹分析表明当构建体被引入到293细胞中 时，FUW构建体表达Aβ+接头+HLA-DRA融合蛋白。参见图15。细胞 裂解物的Western印迹分析是通过使用HLA-DRA特异性抗体(Abnova 目录#MAB7134，克隆L243)探测印迹进行的。

人类胚胎干细胞(hESC)衍生的树突细胞。通过在37℃水浴中持续 地轻轻摇晃冻存管直到只有小冷冻块(pellet)残留使冷冻小瓶的hESC 之H9系(WiCell/国家干细胞库)迅速解冻。然后从水浴中取出冻存管并 擦干，用异丙醇擦拭。使用1毫升移液枪头(pepitte tip)将冻存管中的 内容物转移到15毫升锥形管中。将9毫升预热的干细胞培养基(完全 mTeSR，来自Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)逐滴加入到 该管中，随着培养基的加入轻柔地混合。然后将细胞在室温(25℃)，300×g 离心5分钟。将培养基吸出，让细胞沉淀保持完整。使用1毫升移液枪头， 将细胞沉淀轻轻地重悬，同时小心维持细胞为聚集体。确保团块均匀分布， 将1毫升细胞聚集体的细胞转移到包被有基质胶(Becton-Dickinson，根 据制造商的说明制备的)的T25培养瓶中。然后将培养瓶快速地从一边 到另一边晃动，随后前后晃动直到细胞聚集体均匀地分布在培养基中。在 湿润的培养箱(37℃，5％CO₂)中培养细胞。每隔一天向每个T25培养 瓶(4毫升)的hESC培养物供给，用新鲜mTeSR培养基100％更换。在 解冻后约5至7天，检查hESC培养物中存在准备好传代的hESC集落(即 致密居中具有光滑的边缘)。

未分化的hESC的传代。用显微镜检查如上所述准备传代的hESC的 集落以鉴定未分化的集落区域，其用移液枪头刮基质胶表面来移除。在此 步骤中，每个培养瓶的表面面积的至多20％被刮下。脱落的细胞被转移 至基质胶包被的含有4毫升的mTeSR培养基的T25培养瓶中。在未分化 的细胞被转移到一个新的T25培养瓶中之后，存在的任何相对较大的集 落均通过用1毫升移液枪头轻轻上下吹吸集落而被打散(breakup)。未分 化的细胞通过摇动T25培养瓶轻柔地混合，然后将培养瓶放置在培养箱 中培养。未分化的hESC集落可通过不存在粗糙的集落边缘来识别，由每 隔一天供给培养物4毫升的mTeSR培养基来维持。未分化的hESC在传 代后5至6天后被用于实验中。

OP9细胞的培养。使用OP9骨髓基质细胞(ATCC目录号CRL-2749) 来刺激hESC的造血干细胞(HSC)系的分化，尽管其它的骨髓基质细胞 在此过程中可以取代。OP9细胞保持在OP9培养基中：1×的α-MEM(Life  Technologie)培养基中补充有20％FBS(未加热灭活)、L-谷氨酰胺。OP9 培养物维持在T75培养瓶中，所述T75培养瓶在湿润的培养箱中37℃和 5％CO₂，如在ATCC方案中所描述的。简言之，OP9的培养物每2天供 给一次，每4天传代一次。为了使OP9培养物传代，将培养基从培养瓶 中吸出，并用8毫升PBS清洗OP9单层细胞。为了使OP9细胞从培养瓶 表面脱落，将TrypLE表达(Life Technologies)溶液(4毫升)加入到该 培养瓶中，并将培养瓶置于37℃培养箱中5分钟。通过加入4毫升含0.5 ％BSA的PBS终止TRYPLE处理。将经处理的细胞和溶液转移到15毫 升的试管中，将试管以300×g离心5分钟。离心后，吸出上清液，并将细 胞重悬于1毫升OP9培养基中。细胞溶液重悬于30毫升OP9培养基中 并将10毫升的重悬细胞分别加入到3个新的T75培养瓶中。在约4天后， 当OP9细胞生长至85％汇合度时，按照上述方法再次对它们进行分离。

hESC通过与OP9基质细胞共培养进行造血分化。为了准备hESC分 化，T75培养瓶中的OP9细胞过度生长(即，分离后4至5天)。将培养 基吸出并将10毫升的hESC-HSC分化培养基(1×α-MEM中补充有10％ FBS(未加热灭活的)和100μM的单硫代甘油(MTG，Sigma目录# M6145))加入到培养瓶中，并将培养物孵育20分钟。当用hESC-HSC 分化培养基孵育OP9细胞时，将mTeSR培养基从hESC集落(分离后 5-6天)的T25培养瓶中除去，并用5毫升的PBS清洗hESC培养物。用 3毫升补充有5％FBS的PBS覆盖细胞，然后用细胞刮(BD Falcon目录 #353085)使hESC集落从T25培养瓶的表面脱落并被打散。接着用移液 管将脱落的hESC集落转移到15毫升锥形管中。然后用另外3毫升的 PBS/5％FBS清洗培养瓶，将其添加到含有刮下来的集落同一个15毫升 试管中。将含有分散的hESC集落的15毫升试管以300×g离心5分钟。 吸出上清液，将沉淀轻轻悬浮于1毫升的hESC分化培养基中，通过轻敲 该培养瓶并用1毫升移液管轻柔地磨碎，并小心不要打碎细胞团块。细胞 悬液的体积为1.5毫升至2毫升，并且通常含有约10⁶个细胞/毫升。将另 外的9毫升的hESC-HSC分化培养基轻柔地加入到hESC细胞悬液中， 并小心保持hESC细胞团块的完好。然后将10毫升含hESC的hESC-HSC 培养基均匀地分布到如上文所述已用10毫升hESC-HSC分化培养基孵育 的OP9培养瓶中。然后将培养瓶放置在一个温润的培养箱(37℃和5％ CO₂)中。孵育1天后，所有的培养基都吸走。将20毫升新鲜hESC-HSC 分化培养基加入到培养瓶中，将培养瓶放回培养箱中。合并的hESC/OP9 培养物自起始平板接种起的第4天和第6天供给，每次供给用新鲜的 hESC-HSC分化培养基更换50％的培养基(10毫升)。在第4天开始时， 在显微镜下检查共培养物，以观察hESC集落的分化。好的HSC分化的 特点是与未分化的hESC集落形成对比的畸形集落并且培养基不含有成 脂肪的(含大液泡)OP9细胞。在初始平板接种后7至8天收获HSC集 落。

在GM-CSF批量培养物中髓系祖细胞的扩增。用pHEMA包被塑料 表面。通过在50毫升试管中向10毫升含有10mM NaOH的95％乙醇中 加入4克的pHEMA制备聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)/pHEMA(Sigma 目录#P3932)包被溶液。并且在37℃培养箱中使其旋转过夜。为了包被 T25培养瓶，使用2毫升的pHEMA包被溶液，并且旋转倾斜该培养瓶， 直到整个底部表面被覆盖。将培养瓶侧立放置，过量的pHEMA包被溶 液被排入一个角落，并用吸管除去。培养瓶立即置于水平位置且将盖子取 下，并使其在组织培养罩中干燥过夜(无UV)。第二天将盖子盖在培养 瓶上，并在室温下储存直到使用。第8天的hESC/OP9共培养物的单细 胞悬液是通过如下的用胶原酶-胰蛋白酶溶液连续的酶处理而制备的。首 先，将hESC/OP9共培养的培养基吸出并用10毫升PBS清洗。然后每个 T75培养瓶中加入5毫升的胶原酶溶液(在DMEM/F12(1毫克/毫升) 中无菌过滤的IV型胶原酶，Life Technologies 17104-019号)，并将培养 瓶在37℃孵育20分钟。将胶原酶溶液从培养瓶中移出，并转移到一个50 毫升锥形管中。然后将5毫升的胰蛋白酶-EDTA溶液(在0.5mM EDTA 溶液中含0.05％胰蛋白酶，Life Technologies#25300-054)加入到相同的 hESC/OP9共培养培养瓶中，将培养瓶在37℃下孵育20分钟。将5毫升 的PBS-5％FBS加入到含有胰蛋白酶-EDTA溶液的培养瓶中，并用10毫 升的血清移液管(serological pipet)通过吹吸将脱落的细胞重悬。然后将 细胞转移到含有所收集的胶原酶溶液的同样的50毫升收集管中，通过封 闭收集管并使其颠倒来使细胞混合。将细胞在同一管中以400×g离心10 分钟。除去上清液，将细胞用PBS-5％FBS洗涤，并再次以400×g离心 10分钟。再重复这个洗涤步骤两次，并在最后一次洗涤后，将上清液除 去。将细胞重悬于10毫升的髓系细胞扩增培养基(MCEM。MCEM含 补充有10％非加热灭活的Hyclone FBS(Hyclone)、1×MTG(100μM)、 和100纳克/毫升的GM-CSF(R&D系统目录215-GM)的α-MEM。 GM-CSF是在临用前加入的。在MCEM中重悬细胞后，将细胞悬液通过 安装到一个50毫升试管上的70微米的尼龙过滤器来过滤。过滤步骤后， 用血细胞计数器和台盼蓝来计算细胞的总细胞数。细胞最终以2至3×10⁶个细胞/毫升的浓度悬浮。将包括hESC衍生的共同髓系祖细胞的悬浮细 胞分配到pHEMA包被的T25培养瓶中(5毫升/T25培养瓶)，并在37 ℃和5％CO₂下孵育。在平板接种后第4、8和12天，通过用新鲜的MCEM 更换每个培养瓶50％的培养基来供给培养物新的MCEM。在每次供给时， 取出2.5毫升的培养基，并以300×g离心10分钟。将上清液完全除去， 将细胞沉淀重悬于新鲜的MCEM中，并返回到培养瓶中。在建立共培养 后11天或12天后收集细胞。

髓系在细胞分化成DC。在直接从T25培养瓶中收集以上步骤中描述 的髓系祖细胞，然后通过70微米尼龙筛过滤，转移到15毫升锥形管中， 并以400×g离心10分钟。使用移液管来除去上清液，然后将细胞在5毫 升的PBS中重悬。将细胞悬液用5毫升25％的Percoll(Sigma目 录.No.P1644)悬起，然后以400×g离心15分钟。将细胞用PBS-5％FBS 洗涤两次并以450×g离心10分钟，小心保持细胞沉淀完好。在最后一次 洗涤后，将细胞重悬于8毫升的树突细胞分化培养基(DCDM)中。DCDM 包括由StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)(Stem Cell Tech目录# 09650)构成，并补充有1/500稀释的EX-CYTE生长增强补充剂 (Millipore，目录#81-129-N)、100纳克/毫升的重组人GM-CSF(Sigma) 和100纳克/毫升的重组人IL-4(R&D Biosystems)。向两个T25培养瓶 的每一个中加入一半的含有细胞的溶液。每个培养瓶中细胞悬液的最终浓 度为每毫升DCDM2×10⁵至1×10⁶个细胞。在平板接种后4天和8天通过 更换50％的DCDM供给细胞。从每个培养瓶中取出2毫升培养基并以 400×g离心10分钟。除去上清液并将细胞重悬于2毫升的新鲜DCDM中， 并将该溶液加回到培养瓶中，将培养瓶放回培养箱中。

树突细胞(DC)的成熟(一般的成熟过程)。使用标准的胰蛋白酶溶 液细胞分离的方法，将10至12天的树突细胞培养物收集到15毫升锥形 管中，并以400×g离心10分钟。通过移液管吸除去上清液，将沉淀重悬， 并与4毫升新鲜制备的DC成熟培养基(补充有EX-CYTE生长增强补充 剂(Millipore，目录#81-129-N)的SFEM)轻柔地混合。将重悬的DC 转移到pHEMA包被的T25培养瓶中，并在37℃和5％CO₂下孵育。DC 从平板接种细胞2至3天后开始形成树枝状突起。

树突细胞的感染与成熟。慢病毒的制备。慢病毒是通过在HEK293 细胞中转染质粒产生的。在湿润的培养箱37℃，5％CO₂下，于293培养 基(杜尔贝科最低必需培养基(Dulbecco Minimal Essential Medium， DMEM)，补充有10％FBS和L-谷氨酰胺)中培养人胚胎肾293细胞 /HEK293(以下简称为293)细胞。在细胞80％汇合时，吸除培养基，用 PBS(直径10厘米的培养皿用5毫升)清洗细胞，并将胰蛋白酶-EDTA 放在细胞上3至4分钟(直径10厘米的培养皿用5毫升)以将细胞分开。 经胰蛋白酶-EDTA处理后，将5毫升的293培养基加入到培养皿中，通 过上下吹吸溶液轻柔地移动细胞。将重悬的293细胞和培养基转移到15 毫升试管中，并以500×g离心5分钟。吸除上清液，将细胞团块重悬于1 毫升的PBS中，并用血细胞计数器对细胞计数。在293培养基中稀释细 胞并且在6孔板的每个孔中平板接种2毫升的5×10⁵个细胞。将该板放置 在培养箱中过夜，并在第二天用质粒转染细胞。用脂质体2000(Life  Technologies)将质粒转染到293细胞中。使用以下方式分别在不同孔中 制成所有表达融合蛋白的慢病毒。将50微升的OptiMEM(Life  Technologies)放到两个1.5毫升的微量离心管中，并使其在组织培养罩 中升温至室温10分钟。在一个试管加入下面的质粒：2微克表达 Aβ-HLA-DRA融合蛋白构建体的慢病毒、2微克的VSVG、2微克的Δ8.9。 所有质粒都是用使用Endo-Free Maxi试剂盒(Qiagen)的氨苄青霉素抗 性的大肠杆菌培养物制备的。在第二试管中加入10毫升的脂质体2000。 将两个管中的内容物加到一起，混合并留在组织培养罩中20分钟。在这 段时间后，按照制造商的脂质体方案(Life Technologies)将溶液逐滴加 入到293细胞的孔中，。在将含有脂质体的溶液加入到各孔之后，将平板 返回培养箱中。第二天，从293细胞除去培养基，并用1毫升的DCDM 更换。将细胞再孵育2天，此时含有病毒的培养基被除去，并准备好感染 未成熟DC。在DCDM中10天后，收集树突细胞，并在15毫升锥形管 中以400×g进行沉淀。用移液管除去上清液，并用1毫升的DCDM重悬 含DC的沉淀物，并用血细胞计数器对细胞计数。通常，每个Aβ融合的 慢病毒感染和实验对照(即，IL-2，Aβ肽，未处理的对照)使用5×10⁵个细胞。24孔板中总共有10个孔被准备成pHEMA包被用于感染和对照。 按照如上所述完成pHEMA包被，只是每孔中使用500微升的pHEMA包 被溶液。将来自于转染有融合蛋白载体之293的含有慢病毒的培养基(600 微升)加入到7个孔中。将来自于已转染有空的FUGW慢病毒载体或含 Aβ融合蛋白DNA序列(Aβ1-13、Aβ7-13、Aβ16-30、Aβ24-35和Aβ 31-42)的FUGW载体的293细胞的条件培养基分别加入到6个孔中。剩 下的三个孔做如下处理：1)用含10微克/毫升Aβ1-42多肽的DC的分化 培养基(Biomer Technology，Pleasanton CA)处理；2)用含IL-2的DC 分化培养基处理；和3)仅用DC分化培养基处理。然后向每个孔加入5×10⁵个分化的DC。在加入分化的DC后，将平板来回晃动，然后在37℃和5 ％CO₂孵育2天。在开始感染后的第2天，从各孔移除培养基，并用1毫 升DC成熟培养基(DCMM)更换。DCMM由补充有100微克/毫升的重 组人TNF-α和250纳克/毫升的脂多糖(LPS)的DCDM构成。用DCMM 另外孵育感染的DC3天。

T细胞的分离。使用标准的放血技术从志愿者采集全血。从每个对象 采集约20毫升的全血置于紫色顶EDTA包被的放血管中 (Becton-Dickinson)。将血液用PBS(Gibco目录#14040)1∶1稀释，并 且在50毫升锥形管中，使24毫升的稀释血液在18毫升的Ficoll-Paque  Plus(比例1∶1.4，GE Healthcare Biosciences，Upsala，SE，目录 #17-1440-02)上成层。包含经稀释的血液和Ficoll-Paque Plus的试管在室 温下以400×g离心30分钟。将上清液(即黄色血浆成分)吸走并弃去。 小心地移出血浆成分和Ficoll层之间的界面层并转移到新试管中。此界面 层包含有外周血淋巴细胞(PBL)和单核细胞。在含PBL的试管中填充 25毫升1×PBS，混合然后以1500×g离心10分钟。通过抽吸除去上清液， 并用10毫升PBS将沉淀物重悬。再重复两次1500×g离心10分钟和洗涤 步骤。在最后清洗后，将细胞重悬于1毫升的PBS中，并用血细胞计数 器计数。然后将细胞重悬于RPMI中达到20-50×10⁶个细胞/毫升的细胞浓 度。

通过PBL传代并在无菌尼龙羊毛柱(Polysciences公司，目录号 21759)中孵育它们而从贴壁细胞(例如B细胞和单核细胞)纯化T细胞。 简言之，通过将5毫升的RPMI培养基加入到柱的顶部使10毫升的尼龙 羊毛柱变湿，并通过打开柱底部的旋塞使培养基通过该柱。还用5毫升的 RPMI培养基完成第二次洗涤，然后通过在顶部加入培养基同时关闭旋 塞，将5毫升的RPMI培养基留在柱中。然后用注射器柱塞密封该柱的 顶部，随后将含有RPMI培养基的柱于37℃孵育1小时。在该孵育后， 将该柱夹持在竖直位置并打开旋塞，以允许RPMI培养基穿过该柱。然 后用另外5毫升的RPMI清洗该柱并使打开旋塞。将4毫升的细胞悬液 (2-5×10⁶个细胞/毫升)加入到柱的顶部(总共4毫升的PBL)，并使溶 液进入该柱，关闭旋塞。然后使1毫升的RPMI在柱的顶部分层，并使 其进入尼龙羊毛柱。关闭旋塞，将柱的顶部用注射器柱塞密封，并且使该 柱在37℃孵育1小时。在孵育1小时后，将柱竖直地安装在组织培养罩 中，移走柱塞。打开旋塞，靠重力收集流出柱的流出物。此流出物由T 细胞富集的级分组成。用10毫升的RPMI培养基再洗涤该柱一次，并且 靠重力流动来收集流出物。将两种流出物合并在50毫升锥形管中，并以 1500×g离心10分钟。吸出上清液，并将T细胞富集的制备物重悬于1毫 升PBS中。用血细胞计数器对细胞计数。在细胞悬液中仅相对比较大的 细胞作为目的T细胞进行计数。

T细胞的羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色。在对从尼 龙柱收集的T细胞悬液进行了计数之后，将该悬液以1500×g离心10分 钟，并重悬于4毫升含有0.1％BSA的PBS(预先温热至37℃)中。然后 将4毫升含8μM CFSE(CellTrace^TM CFSE细胞增殖试剂盒，Invitrogen) 的PBS/BSA加入到4毫升细胞悬液中，并将该混合物在37℃水浴中孵育 8分钟。孵育后立即用10毫升含10％hyclone胎牛血清(FBS)的RPMI 稀释细胞溶液。然后将细胞悬液在25℃以1500×g离心10分钟。用10毫 升含有0.1％BSA的PBS(牛血清白蛋白级分V，Calbiochem目录#2930) 洗涤CFSE染色的T细胞两次，在25℃以1500×g离心5分钟。在最后一 次洗涤后，将T细胞重悬于1毫升的RPMI中并计数。通过流式细胞术 (Accuri/BD)分析CFSE染色的重悬T细胞的等分试样来确认CFSE染 色。通过流式细胞术(FL1通道)进行分析以确认CFSE染色的均匀强度。 在被感染的3天前从成熟DC除去成熟分化培养基。

将成熟的呈递HLA-DRA-Aβ的树突细胞和来自诊断患有AD之对象的具 有CFSE标记的T细胞共培养。然后将一百万(1×10⁶)个CFSE染色的 T细胞加入到已被表达HLA-DRA-Aβ融合蛋白之慢病毒感染的成熟树突 细胞的各孔中，预先加载有Aβ1-42肽(10微克/毫升)，或两个未处理的 孔。通过从一边到另一边晃动、随后前后晃动24孔板来混合细胞，以使 T细胞均匀地分布在孔中。将平板放回培养箱中。在第二天，每个孔中加 入1微升的人IL-2(GIBCO，目录号PHC0026)。IL-2的终浓度为200 纳克/毫升。通过使平板经受从一侧到另一侧的温柔晃动将IL-2分散开来， 然后将细胞在37℃孵育9天。在第10天，如下面所述，通过ACCURI^TM流式细胞仪测定CD4阳性T细胞群。

用抗CD4免疫染色。通过对每个孔中用新的1毫升移液枪头将每孔中的 培养基转移到一个单独的15毫升锥形管中，收集10天的T细胞和改造 的DC的共培养物。用1毫升PBS洗涤平孔板的表面，并且将洗涤液与 对应孔中先前的洗涤液合并。一旦所有孔中的细胞被收集，将该试管在 450×g离心10分钟。弃去上清液，将细胞用5毫升PBS洗涤一次，然后 以450×g再离心10分钟。弃去上清液，收集沉淀物。将细胞用荧光缀合 的抗CD4抗体进行免疫染色(活)并通过流式细胞术测定。孵育后，将 50微升的每种细胞悬液(即，1×10⁶个细胞)转移到新的流式细胞管中。 每个管中加入1微升氟Alexa647缀合的抗CD4抗体(Alexa647 小鼠抗人CD4抗体，BD Biosciences，目录号557707)。将剩余的50微 升NMS-封闭的T细胞用作抗体的同种型对照。将1微升的同种型对照抗 体(Alexa647小鼠IgG1k同种型对照，BD Biosciences目录号 557714)加到用于每个实验条件下的同种型对照的细胞中。抗CD4标记 的细胞和同种型对照的细胞在4℃于黑暗中孵育1小时。孵育后，在每个 试管中加入1毫升冷的含0.5％BSA的PBS(Calbiochem目录号2930)， 并将试管以200×g离心5分钟。弃去上清液，并且重复两次洗涤步骤。在 最后一次的洗涤液中仅包含PBS而无0.5％BSA。用200微升冰冷的 1×PBS重悬各管中的细胞。

通过ACCURI^TM流式细胞仪测量CD4⁺T细胞增殖。用Accuri流式细 胞仪测定细胞。使用前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)的点状图来创 建围绕含T细胞的群的选通，其是在初步研究中所确定。该选通内的细 胞事件绘制在直方图FL2上，其示出Alexa647荧光(红色)。由抗CD4 抗体标记的细胞在直方图中具有显著更多的荧光并且选通被用于分离那 个群。FL1(绿色)荧光直方图显示CD4⁺细胞中的CFSE标记。最强烈 的标记见于(最右边)没有分裂的细胞中。进行细胞分裂之细胞的CFSE 荧光逐步减少。IL-2处理条件CFSE图被用来确定每个步骤(即分裂) 的荧光程度。这些标志物被转移到每个实验条件的CFSE图来确定在实验 过程中已分裂5次以上的CD4⁺T细胞。在每种条件下的T细胞增殖谱的 比较被用来确定各血液样品中Aβ-特异性CD4⁺T细胞的相对丰度和响应 性。

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