一种快速检测呼吸道合胞病毒A型和B型的核酸检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种快速检测呼吸道合胞病毒A型和B型的核酸检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括核酸扩增反应液、酶混合液、呼吸道合胞病毒A型/B型反应液、阳性对照和空白对照。本发明克服了现有技术中呼吸道合胞病毒A型和B型核酸检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，提出了一种具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点的呼吸道合胞病毒A型和B型核酸检测试剂盒，在呼吸道合胞病毒A型和B型的临床诊断、疾病监测等方面具有极大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其应用，具体涉及一种快速检测呼吸道合胞 病毒A型和B型的核酸检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial viruses，简称RSV)是属于副粘液病毒科 的一种RNA病毒。它是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因 之一，特别是2-6个月的小婴儿在感染呼吸道合胞病毒以后常常可以发生严重的毛 细支气管炎和肺炎。另外它还是引起老年人慢性支气管炎加重以及免疫损伤患儿下 呼吸道感染的重要病原。

目前呼吸道合胞病毒被分为A亚型和B亚型，呼吸道合胞病毒的反复感染可能 就与不同亚型的存在有关。开展呼吸道合胞病毒亚型的监测对流行病学研究及疫苗 的发展都有极其重要的意义。

目前医院诊断呼吸道合胞病毒感染的方法主要有病毒分离培养、免疫学诊断以 及核酸检测法。病毒分离培养检测操作复杂，费时较长，需几周才能报告结果，且 敏感性低；免疫学诊断主要以金标法和EIA为主，具有快速，简便等优点，但特异 性和敏感性较差；核酸检测法是刚刚兴起的最新的检测方法，发展迅速，具有非常 高的特异性和敏感性，技术操作也不复杂，可以有利于早期诊断、无症状病人诊断、 以及病程的跟踪。

目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光 PCR技术。检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完 整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时， 与模板结合的探针被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团 分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光 信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。对于荧光PCR检测病毒来说，引物的 设计至关重要，其直接影响检测的特异性。如果引物的特异性不够，则可能导致假 阳性的出现。

双重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入两条不同荧光标记的探 针。例如，针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记VIC。PCR 反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待 检样本包含靶基因2，则标记VIC的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确 定两个靶基因(如图1所示)。

现有的呼吸道合胞病毒A型和B型检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较 低无分型检测等缺陷，有待改进。本发明针对呼吸道合胞病毒A型和B型病毒的 靶序列分别设计了不同的Taqman探针，在很大程度上保证了用于检测病毒时的结 果的特异性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的呼吸道合胞病毒A型和B型检测试 剂盒特异性差、灵敏性较低等缺陷，提供一种快速检测呼吸道合胞病毒A型和B 型的核酸检测试剂盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速 客观等优点，对呼吸道合胞病毒A型和B型的检测具有良好的应用前景。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的一种快速检测呼吸道合胞病毒A型和B型的核酸检测试剂盒，包括 以下各组分：核酸扩增反应液、酶混合液、呼吸道合胞病毒A型/B型反应液、阳 性对照和空白对照，其中所述的呼吸道合胞病毒A型/B型反应液包含以下3组组 分：

组分(1)：三条用于检测呼吸道合胞病毒A型/B型的引物；其中，三条引物 的碱基序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；

组分(2)：一条检测呼吸道合胞病毒A型的探针，所述探针的碱基序列为SEQ  ID No.4所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

组分(3)：一条检测呼吸道合胞病毒B型的探针；其中，所述探针的碱基序 列为SEQ ID No.5所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭 基团。

在本发明中，优选的，组分(2)和组分(3)中所述的荧光报告基团分别选自 FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED640中的任一 种，且组分(2)和组分(3)中的荧光报告基团不同；组分(2)和组分(3)中所 述的荧光淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任一种。

本发明对上述引物和探针的摩尔配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现， 它们之间不同的摩尔配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本 发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测 效果：

在本发明中，优选的，组分(1)中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3 所示的引物序列按照等摩尔混合。

在本发明中，优选的，所述的检测呼吸道合胞病毒A型/B型的引物及检测呼 吸道合胞病毒A型的探针的摩尔配比为：SEQ ID No.1:SEQ ID No.2:SEQ ID No.3: SEQ ID No.4为6:6:6:2.5。

在本发明中，优选的，所述的检测呼吸道合胞病毒A型/B型的引物及检测呼 吸道合胞病毒B型的探针的摩尔配比为：SEQ ID No.1:SEQ ID No.2:SEQ ID No.3: SEQ ID No.5为6:6:6:4.5。

呼吸道合胞病毒A型/B型引物探针核苷酸序列见表1：

表1 呼吸道合胞病毒A型/B型引物探针

名称 序列(5′→3′) A型-FP GGTTTAAGAGAAGAAATGATAGAAAA(SEQ ID No.1) A型-RP1 ATCATTGTCACTATCATTCCCTTC(SEQ ID No.2) A型-RP2 ATCATTGTCACTATCGTTGTCTTC(SEQ ID No.3) A型-P X1-TATGGCAAGACTCAGGAATGAGGAAAG-Y1(SEQ ID No.4) B型-FP GGTTTAAGAGAAGAAATGATAGAAAA(SEQ ID No.1) B型-RP1 ATCATTGTCACTATCATTCCCTTC(SEQ ID No.2) B型-RP2 ATCATTGTCACTATCGTTGTCTTC(SEQ ID No.3) B型-P X2-CTATCATTGGTCATTAATGCTTCCGCTCT–Y2(SEQ ID No.5)

注：X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。

在本发明中，优选的，所述的酶混合液包括Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制 剂，逆转录酶为M-MLV逆转录酶，Taq酶为热启动Taq酶；

在本发明中，优选的，所述的核酸扩增反应液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、 氯化镁以及核苷酸混合液。；

在本发明中，优选的，所述的阳性对照为灭活的呼吸道合胞病毒A型和B型 的病毒培养液；所述的空白对照为去RNA酶水。

进一步的，本发明还公开了以上任一项所述的核酸检测试剂盒在制备检测呼吸 道合胞病毒A型和B型的试剂中的应用。

本发明的试剂盒采用双重荧光定量PCR技术，分别设计针对呼吸道合胞病毒 A型和B型的特异性引物和探针，实现了在同一反应体系中同时检测呼吸道合胞 病毒A型和B型的目的。引物和探针的设计采用primer 5.0专用软件设计，将设 计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物 和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A260nm/A280nm 在1.8-2.0之间为合格)。

本发明提供的一种快速检测呼吸道合胞病毒A型和B型的核酸检测试剂盒具 有如下技术效果：

1)本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开 始)仅为2-3小时，而且在同一反应体系中实现同时检测呼吸道合胞病毒A型和B 型。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减 少了污染产生的机会。

2)能够同时检测出呼吸道合胞病毒A型和B型，解决了现有产品只能在一管 中检测一种病毒的问题。本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结 果快速客观等优点，在临床诊断、疾病预防监测领域具有极大的应用前景。

附图说明

图1是双重荧光定量PCR技术原理图；

图2是本发明试剂盒检测样本的曲线图；

图3是本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒A型的灵敏度试验结果图；

图4是本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒B型的灵敏度试验结果图；

图5是本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒A型的特异性试验结果图；

图6是本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒B型的特异性试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例与试验例中所用试剂均为市售。

实施例1一种快速检测呼吸道合胞病毒A型和B型的核酸检测试剂盒的制 备

所述试剂盒包括核酸扩增反应液、酶混合液、呼吸道合胞病毒A型/B型反应 液、阳性对照和空白对照；

其中，核酸扩增反应液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁、核苷酸混合 液；

呼吸道合胞病毒A型/B型反应液包含以下组分：

组分(1)：由三条检测呼吸道合胞病毒A型/B型的引物组成；其中，三条引 物的碱基序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；检测呼吸 道合胞病毒A型/B型的引物浓度为：SEQ ID No.1为600nM(nmol/L)，SEQ ID No.2 为600nM，SEQ ID No.3为600nM；

组分(2)：由一条检测呼吸道合胞病毒A型的探针组成，探针的碱基序列为 SEQ ID No.4所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭 基团BHQ1；探针SEQ ID No.4的浓度为250nM；

组分(3)：由一条检测呼吸道合胞病毒B型的探针组成；探针的碱基序列为 SEQ ID No.5所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团VIC，3′端标记有荧光淬灭 基团BHQ2；探针SEQ ID No.5的浓度为为450nM。

呼吸道合胞病毒A型/B型反应液用去RNA酶水配制。

酶混合液包括Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂，其中，Taq酶为热启动Taq 酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。

阳性对照为灭活的呼吸道合胞病毒A型和B型病毒培养液；空白对照为去 RNA酶水。

试验例1本发明试剂盒的使用方法包括下列步骤：

1、提取样本RNA

1.1取200ul临床样品，加入400ul Binding Buffer supplemented with Poly(A)， 充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离心15s，弃去收集管中的废液。

1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去 收集管中的废液。

1.3加入450ul Washing Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管 中的废液。

1.4重复步骤1.3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净。

1.5加入50ul Elution Buffer至过滤管中，室温静置2min，8000rmp离心1 min，离心所得溶液即为纯化的RNA。

2、在每个PCR反应管放入组分如表2中所示的呼吸道合胞病毒A型和B型 检测试剂(实施例1制备)和RNA样本：

表2

反应液组分 加量(ul)/1人份 核酸扩增反应液 7.5 酶混合液 5 呼吸道合胞病毒A型/B型反应液 4 去RNA酶水(阴性参考品) 3.5 RNA样本 5 总体积 25

3、在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增：

4、扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染呼吸道合胞病毒A型、B型。扩 增曲线如图2所示。

结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.3，判断为呼吸道合 胞病毒A型阳性；无典型“S”型扩增或CT>36.3，且内标的CT≤35.0，判断为呼吸 道合胞病毒A型阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为呼 吸道合胞病毒B型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.0，且内标的CT≤35.0，判断 为呼吸道合胞病毒B型阴性。

5个临床样本具体检测结果见表3。

表3

试验例2本发明试剂盒的灵敏性试验

阳性参考品为灭活的呼吸道合胞病毒A型和B型病毒培养液。分别将含有 5×10⁴TCID₅₀/ml呼吸道合胞病毒A型和B型病毒培养液的核酸提取液按照稀释浓 度为5×10⁴、5×10³、5×10²、50、10、1TCID50/ml六个浓度进行灵敏度试验。

阴性参考品分别为甲型流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠 状病毒、A组乙型链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌的病毒培养 液。

采用本发明试剂盒(实施例1制备)按照试验例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度 改变，结果见图3、图4。

试验结果表明，本发明试剂盒对于呼吸道合胞病毒A型和B型的诊断具有高 度的灵敏性。其中，对呼吸道合胞病毒A型的检测灵敏度能够达到10TCID50/ml， 对呼吸道合胞病毒B型的检测灵敏度能够达到1TCID50/ml。

试验例3本发明试剂盒的特异性试验

用本发明呼吸道合胞病毒A型和B检测试剂盒(实施例1制备)检测呼吸道合胞 病毒A型、B型、甲型流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒等。

检测结果表明：FAM通道仅对呼吸道合胞病毒A型进行扩增，VIC通道仅对 呼吸道合胞病毒B型进行扩增。

试验结果表明本发明检测试剂盒能特异性扩增呼吸道合胞病毒A型和B型， 而不与其它病毒核酸发生交叉反应，结果见图5、图6。