一种基于多重PCR快速筛选产龙胆苦苷重组酵母的方法

摘要

本发明提供一种基于多重PCR快速筛选产龙胆苦苷重组酵母的方法：提取候选菌株基因组DNA，进行多重PCR扩增，根据电泳结果从候选菌株中筛选得到含有MECT、MECPS以及GGPPS基因的片段的重组酵母菌株；重组酵母菌株于YPD液体培养基中进行发酵培养，通过对发酵液进行HPLC分析筛选得到产龙胆苦苷重组酵母菌株。本发明以龙胆苦苷生物合成代谢途径关键酶基因作为分子标记，基于多重PCR扩增筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株，极大地简化了产龙胆苦苷酵母菌株的筛选过程，方法简单、快速、高效、低廉，是一种具有广泛运用前景的高通量筛选方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于多重PCR扩增技术快速筛选重 组酵母菌株的方法。

背景技术

龙胆苦苷(gentiopicroside)是秦艽等龙胆属植物的主要化学成分，1854年从药 用植物Genatiana Iutea.LINN分离纯化获得，属于裂环环烯醚萜苷类，具有抗 氧化、抗炎、保肝、利胆及抗肿瘤等作用。

近年来，随着临床需求量的增加，秦艽野生资源采挖过渡，龙胆苦苷的药源 日益受到限制，迫切需要寻求及扩大龙胆苦苷新型药源途经以满足市场的需求。

低能离子注入的独特机制，使其成为一种新的转基因手段。研究证明，注入 的离子对受体细胞具有极强的腐蚀作用，使受体细胞表面形成可使外源DNA进 入的通道；由于注入正离子的累积，大大降低了受体细胞表面的负电性，从而减 少了受体细胞对带负电的外源DNA的排斥力，有利于外源DNA的导入。低能 离子束介导外源基因组的遗传转化为远缘或超远缘物种间的基因转移提供了一 种新的交流途径。低能离子束介导DNA转化技术在构建工程菌方面虽然具有极 大优势，但它属于一种随机转化方式，因此构建一种高通量快速筛选方法显得尤 为重要。

目前，运用低能离子注入技术进行超远缘遗传育种是一种无筛选标记的分子 遗传育种方法。目前基于此方法构建重组菌株的筛选方法是根据目的产物的化学 性质，利用定性标识去筛选。如毛培宏等利用低能离子注入方法介导麻黄基因组 转化酵母，其所运用的筛选方法为颜色反应，即根据麻黄碱的特征性颜色反应进 行筛选，研究人员从3000多株重组菌中筛选获得9株产麻黄碱酵母重组菌株。 该方法工作量达，步骤繁琐，检测极限高，从而大大影响了目的工程菌的筛选效 率。

多重PCR特异性扩增是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应 体系中同时加入三对特异性引物，针对同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。多重PCR方法可以同时检测出多个基因，极大地提高了检测效率， 降低了工作量及成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于多重PCR快速筛选产龙胆苦苷重组酵母的 方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)重组菌株初筛：将经过低能离子注入介导秦艽总基因组DNA转化处理 后的出发酵母菌株接种至YPD固体培养基上进行培养得到大量转化子(即生长 在YPD固体培养基上的单菌落)，提取转化子基因组DNA，以转化子基因组 DNA为模板进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行核酸电泳分析，根据电泳分 析结果从转化子中筛选得到同时含有MECT基因片段、MECPS基因片段以及 GGPPS基因片段的重组酵母菌株；

2)重组菌株复筛：将步骤1)筛选得到的重组酵母菌株于YPD液体培养基 中进行发酵培养，通过对发酵培养所得发酵液进行HPLC分析筛选得到产龙胆苦 苷重组酵母菌株。

所述多重PCR扩增中，对MECT基因的片段采用上游引物F1和下游引物 R1进行扩增，上游引物F1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物R1的 核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述多重PCR扩增中，对MECPS基因的片段采用上游引物F2和下游引物 R2进行扩增，上游引物F2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物R2的 核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述多重PCR扩增中，对GGPPS基因的片段采用上游引物F3和下游引物 R3进行扩增，上游引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游引物R3的 核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

本发明的有益效果体现在：

本发明以目标产物龙胆苦苷生物合成代谢途径多个关键酶基因作为分子标 记，基于多重PCR扩增技术快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株，极大地简化了 产龙胆苦苷重组酵母菌株的筛选过程，此方法简单、快速、高效、低廉，是一种 具有广泛运用前景的高通量筛选方法。

附图说明

图1为实施例中秦艽总基因组DNA的电泳图。

图2为实施例中MECT、MECPS、GGPPS基因多重PCR扩增后的电泳图； 其中，M为DL2000Maker，1、2为秦艽总DNA，3、4为重组菌株，5、6为出 发菌株。

图3为实施例中产龙胆苦苷重组菌株HPLC检测图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

本发明为基于低能离子注入介导的合成生物学构建的龙胆苦苷重组酵母菌 提供一种简单、快捷、廉价、高效的高通量筛选方法。本发明通过利用离子束介 导技术构建产龙胆苦苷重组酵母菌，基于多重PCR方法对重组菌株进行高通量 筛选；将经多重PCR筛选出来的重组菌株进行液体发酵，再利用HPLC测定发 酵液中龙胆苦苷含量，并对产龙胆苦苷重组酵母进行发酵培养和遗传稳定性研 究。

(1)秦艽总基因组DNA的提取：本发明中秦艽总基因组DNA的提取采用 的是经典的CTAB法，即：

秦艽新鲜嫩叶采自陕西太白县秦艽种植基地，采集后置于-20℃冷冻保存。 取保存嫩叶，称取4.5g，剪碎，于预冷研钵中，加入少量PVP-40，液氮研磨至 细粉状，加10mL 65℃预热的2％CTAB缓冲液(2％CTAB、100mmol/L Tris-HCl、 20mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl、0.5％β-巯基乙醇)，充分搅拌，分装700μL 至1.5mL的EP管中，置65℃水浴60min，期间每隔10min摇动一次，每次轻 微震荡3～4次，冰上冷却10min。加入700μL酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)， 轻轻震荡摇匀至乳白色2～3min(室温15～20℃)，7000rpm，离心10min，取 上清液，重复3～4次。移出上清液，加700μL异丙醇(-20℃预冷)，颠倒混匀 30s，有白色絮状物析出，置-20℃冰箱冷却30min。12000rpm，离心10min，小 心弃除上清液，保留白色沉淀。加700μL 75％乙醇和100μL NaAc，轻弹管底， 使沉淀悬浮，静置30min，10000rpm，离心10min，弃上清，加800μL 75％乙醇 洗涤30min，离心，弃上清，65℃水浴烘干，得DNA，加100μL TE溶液溶解， 备用，秦艽总基因组DNA电泳结果如图1。

(2)筛选体系的建立

根据龙胆苦苷生物合成途径确定龙胆苦苷合成中的关键酶，并设计相应的特 异性引物，以秦艽总基因组DNA为模板进行多重PCR扩增，优化并确定扩增条 件，初步建立起重组菌株的筛选方法；

引物设计：根据相关研究确定龙胆苦苷代谢途径中的关键酶分别为2-C-甲基 -D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-Methyl-D-erythritol-4 –phosphatecytidyltransferase,MECT)、2-甲基赤藓糖-2,4-环二磷酸合成酶 (2-C-methylerythritol 2,4-cyclo Diphospha te synthetase,MECPS)、牛儿基二磷酸 合酶(Geranylgeranyl-diphosphate synthase，GGPPS)。在NCBI数据库中分别查 找其蛋白序列，对其序列进行blast蛋白序列比，确定其同源蛋白序列，借助 codehop网站进行引物设计。

关键酶基因特异性引物序列分别为：

1)MECT基因(AAZ80386.1)：

5'-ggcggcaagggcaarmgnatgggng-3'(参见SEQ.ID.NO.1)

5'-gagccctcggtgatgtacacnggrtgytt-3'(参见SEQ.ID.NO.2)

2)MECPS基因(AAY40863.1)：

5'-ggtgggccacggcttygayytnca-3'(参见SEQ.ID.NO.3)

5'-cttcttcatcagcagcacnayngtrtg-3'(参见SEQ.ID.NO.4)

3)GGPPS基因(AAQ72786.1)：

5'-caagcccaccaaccacaargynttygg-3'(参见SEQ.ID.NO.5)

5'--ggccaggcccagcarnggngcngc-3'(参见SEQ.ID.NO.6)

上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

多重PCR反应体系20μL：2×Taq PCR MasterMix 10μL，引物(浓度为10μM) 各1μL，模板2μL(浓度为2μg/mL)，ddH₂O调整终体积为20μL。Taq PCR  MasterMix为天根生化科技(北京)有限公司生产。

反应程序：94℃5min；循环35次：94℃30s，61℃45s，72℃1min；72℃7min。 扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果可以得到所扩增产物分别为 450bp(MECT基因片段扩增条带)、750bp(MECPS基因片段扩增条带)和 1300bp(GGPPS基因片段扩增条带)左右的目的片段，符合预期片段大小扩增结 果。

(3)低能离子注入介导秦艽总基因组转化酵母

本发明以多形汉逊酵母DL-1(H.polymorpha DL-1，来源为ATCC No.26012) 为出发菌株，利用低能离子注入介导秦艽总基因组DNA随机转化出发菌株。

菌种活化：将冷冻保存的多形汉逊酵母菌株(出发菌株)37℃活化3～4h， 然后于37℃、YPD液体培养基(质量分数1％酵母膏，质量分数2％蛋白胨， 质量分数2％葡萄糖)中进行种子液培养8～10h，取种子液，采用血球计数板计 数法确定稀释倍数，用保护液(质量分数0.5％葡萄糖水溶液和质量分数0.5％蔗 糖水溶液，体积比为1:1)进行稀释，使菌体浓度为1.0×10⁷CFU/mL，得菌悬液。

菌膜制备：取100μL菌悬液均匀涂布于无菌平皿中央，吹干，形成菌膜。

低能离子注入：离子源为N⁺，注入能量为15～25KeV，剂量为 1.5×10¹⁶～2.5×10¹⁶ions/cm²，将菌膜置于离子注入机靶台上，在1×10^-3Pa真空状 态下以10s脉冲方式，间隔10s注入N⁺，然后立即将秦艽总基因组DNA溶液涂 于菌膜上使其接触充分。

温育及洗脱：在37℃下温育2h，后用涂布器反复刮下无菌平皿上的菌膜， 得菌体液。

固体平板培养：取菌体液0.1mL，于无菌操作台上均匀涂布于YPD固体培 养基(质量分数1％酵母膏，质量分数2％蛋白胨，质量分数2％葡萄糖，质量 分数2％琼脂粉)上，并于37℃培养48h，得到1072株转化子。

(4)重组酵母菌株的初筛

随机选取300个转化子，分别提取其基因组DNA，以秦艽总DNA(即秦艽 总基因组DNA)作为阳性对照，出发菌株DNA作为阴性对照，进行多重PCR 扩增，筛选出含有MECT、MECPS以及GGPPS基因的片段的候选重组酵母菌株 9株。参见图2，以秦艽总DNA为模板的多重PCR扩增结果中分别有三条特异 性条带，即1300bp、750bp、450bp，依次对应GGPPS、MECPS、MECT基因； 而相应的以出发菌株DNA为模板的PCR扩增结果显阴性，即任何无条带产生。

(5)利用HPLC(高效液相色谱)分析初筛重组菌株

以(4)筛选出的9株候选重组酵母菌株为研究对象，37℃、125r/min条件 下在YPD液体培养基中培养发酵96h，提取发酵液，利用HPLC进行鉴定分析， HPLC分析检测图谱见图3，结果表明，根据标准品对照，有3株显阳性结果， 在13.8min处出峰，即为产龙胆苦苷的重组酵母菌株。

经过多个批次实验，可以确定利用(4)中方法确定的重组菌株在发酵以及 HPLC后确定的阳性结果概率稳定保持在25％～40％。

(6)产龙胆苦苷重组菌株的遗传稳定性研究

将3株产龙胆苦苷的重组酵母菌株接种于装有YPD液体培养基的250mL三 角瓶中进行摇瓶培养，条件为：37℃、125r/min，传代培养8代后，提取发酵液， 测定龙胆苦苷产量，据此评价重组菌株的遗传稳定性。3株重组菌株均可以稳定 遗传，但产量稍有下降(从2.20mg/L下降到2.08mg/L)。

上述结果表明，本发明可以高效筛选获得产龙胆苦苷的重组酵母菌，虽然在 传代培养中龙胆苦苷的产量有小幅度下降，但其整体影响并不大，筛选获得的重 组酵母菌具有一定的遗传稳定性。

(7)产龙胆苦苷重组菌株的发酵实验

将遗传稳定的重组酵母菌种子液(同上述(3)中种子液获得方法)接种于 5L发酵罐中进行液体发酵(于YPD液体培养基中，接种50mL种子液，在37℃、 125r/min下培养96h)。发酵完成后，提取发酵液，对其进行HPLC分析，测定 其龙胆苦苷含量为2.056mg/mL，结果表明该重组菌株有进一步发酵研究的价值。