一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域。根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术，针对SLC26A4基因IVS7(-2)位点A>G突变设计出一组特异引物，正常外引物序列如SEQ ID NO.1所示，突变外引物序列如SEQ ID NO.2所示，正常内引物序列如SEQ ID NO.3所示，突变内引物序列如SEQ ID NO.4所示。利用这四条引物对待测样品进行PCR检测，并根据琼脂糖电泳结果判断待测样品中SLC26A4基因的基因型。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为SLC26A4基因IVS7-2A>G突变提供了检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体地说涉及用于检测耳聋相关基 因SLC26A4IVS7-2A>G突变的试剂盒及其应用。

背景技术

溶质转运蛋白家族26,成员4(solute carrier family 26,member 4； SLC26A4)基因定位于7q31，编码离子转运相关蛋白，对SO₄^2-，HCO^3-， I^-，Cl^-等多种单价或二价离子进行转运，在机体离子成分平衡的维持中 发挥重要作用。内耳具有复杂而精细的液体平衡系统，因此任何致病性 的基因突变都会导致内耳离子成分和渗透压的改变，从而对人的听觉和 身体平衡产生重要影响。SLC26A4纯合或杂合突变是大前庭水管综合 征明确的致病原因。

该基因突变在中国聋哑人群中的发病率约8-12％。该基因可以有数以 百计的突变形式，但中国聋哑人群中常见致病突变为SLC26A4基因 IVS7-2A＞G，该突变筛查为纯合突变或复合杂合突变者时，意为发现了 患儿耳聋的遗传致病因素，可以通过预防感冒，避免颅脑外伤、剧烈运 动等防止听力波动和防止聋哑的发生，并进行定期检测，对发现听力下 降者给与早期干预和治疗。

目前针对单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP) 基因突变检测的方法有数十种，如基因芯片法、荧光定量PCR法、限制 性酶切片段长度多态性(RFLP)法和金标准PCR产物直接测序法等，但 这些方法普遍存在技术要求高、仪器设备要求高、成本高等特点，因此 在基层使用具有一定局限性。迫切需要一种简便、快速检测SLC26A4 IVS7-2A>G突变的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其 应用。

四引物扩增受阻突变体系PCR法(Tetras-primer amplification  refractory mutationsystem-PCR，四引物ARMS-PCR)其基本原理是：针 对一个SNP位点设计2个延伸方向相反的内侧引物(Inner primer)，2个引 物的3’末端碱基分别与SNP位点的1个碱基相同(或互补)，并引入错配碱 基增加引物的特异性，然后按正常的方法设计2个方向相反的外引物 (Outer primer)；用这4个引物链组成的3对引物在1个PCR反应中进行扩 增(巢式PCR)；扩增产物用凝胶电泳检测，出现2条带的是纯合型，出 现3条带的是杂合型。

本发明根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术原理，针对 SLC26A4基因IVS7(-2)位点A>G突变设计出一组特异引物，正常外 引物序列如SEQ ID NO.1所示，突变外引物序列如SEQ ID NO.2所示， 正常内引物序列如SEQ ID NO.3所示，突变内引物序列如SEQ ID NO.4 所示。

本发明提供用于检测的引物组合，其特征在于，包括以下四条引物：

正常外引物S-1：5‘-CATATGAGAATTGATTGTGTGTGTGTGC-3’ (SEQ ID NO.1)

突变外引物S-2：5‘-TGTTTCTTCCAGATCACACACAAATAGG-3’ (SEQ ID NO.2)

正常内引物S-3：5‘-ATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGGCT-3’ (SEQ ID NO.3)

突变内引物S-4：5 ‘-GGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCCG-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明提供了上述引物组合在检测SLC26A4基因突变中的应用。

本发明还提供了上述引物组合在制备SLC26A4基因突变检测试剂 盒中的应用。

含有上述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。因此 含有上述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个 如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物，根 据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的 试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发 明所需要的其它成分及用具。

进一步地，本发明试剂盒的工作程序为，当总体系为20μL时，如 下：

进一步地，本发明试剂盒的工作程序为：预变性94℃、5min；再 经94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；最后72 ℃延伸10min，降温至4℃，结束。

本发明试剂盒的工作程序还包括将PCR产物用2～3％琼脂糖凝胶进 行电泳。

具体操作为：取PCR扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳检测，判断样 品SLC26A4基因IVS7(-2)位点基因型；若电泳结果在566bp和368bp 出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常；若电 泳结果在566bp和255bp出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因 IVS7(-2)位点纯合突变；若电泳结果在566bp、368bp和255bp出现 三条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点杂合突变。

进一步，本发明提供了一种检测SLC26A4基因突变的方法，该方 法以样品总DNA为模板，利用本发明的引物组合进行PCR反应，扩增 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后根据电泳条带判定结果。

其中，样品总DNA来自人类血液、体液或组织。

本发明采用四引物扩增受阻突变体系PCR技术，针对SLC26A4基 因IVS7(-2)位点A>G突变设计两条延伸方向相反的内侧引物(inner primer)，两条引物的3‘末端碱基分别与SNP位点的一个碱基相同(或 互补)，及两条正常的方向相反的外引物(outer primer)。这四个引物可 以组成三个引物对，在同一个扩增体系进行反应，扩增产物用凝胶电泳 检测时，出现两条带的是纯合基因型，出现三条带的是杂合基因型。具 有检测操作简单、成本低、设备要求低、检测结果特异性高及结果易判 读，实用性强等特点。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确 性高，灵敏度高，为SLC26A4基因IVS7-2A>G突变提供了检测方法。

附图说明

图1为本发明引物筛选实验的凝胶电泳结果图，其中泳道1-6为引 物组合一，7-12为引物组合二，13-18为引物组合三；其样本顺序分别为： 1、7和13为人血基因组DNA样本一，2、8和14为人血基因组DNA 样本二，3、9和15为SLC正常对照，4、10和16为SLC纯合突变对照， 5、11和17为SLC杂合突变对照，6、12和18为空白对照；M为GeneRuler 100bp DNA Ladder。

图2为本发明PCR体系筛选实验的凝胶电泳结果图，其中泳道1-6 为体系一，7-12为体系二，13-18为体系三；其样本顺序分别为：1、7 和13为人血基因组DNA样本一，2、8和14为人血基因组DNA样本二， 3、9和15为SLC正常对照，4、10和16为SLC纯合突变对照，5、11 和17为SLC杂合突变对照，6、12和18为空白对照；M为GeneRuler 100bp DNA Ladder。

图3为本发明PCR程序筛选实验的凝胶电泳结果图，其中泳道1-6 为退火温度为55℃，7-12为退火温度为60℃，13-18为退火温度为65℃； 其样本顺序分别为：1、7和13为人血基因组DNA样本一，2、8和14 为人血基因组DNA样本二，3、9和15为SLC正常对照，4、10和16 为SLC纯合突变对照，5、11和17为SLC杂合突变对照，6、12和18 为空白对照；M为GeneRuler 100bp DNA Ladder。

图4为本发明引物检测样品的凝胶电泳结果图，其中，泳道1-12 分别为：正常人血基因组DNA样本一、正常人血基因组DNA样本二、 正常人血基因组DNA样本三、正常人血基因组DNA样本四、SLC纯合 突变人血基因组DNA样本五、SLC纯合突变人血基因组DNA样本六、 SLC纯合突变人血基因组DNA样本七、SLC纯合突变人血基因组DNA 样本八、SLC杂合突变人血基因组DNA样本九、SLC杂合突变人血基 因组DNA样本十、SLC杂合突变人血基因组DNA样本十一、SLC杂合 突变人血基因组DNA样本十二；M为GeneRuler 100bp DNA Ladder。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背 离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改 或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施 例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1引物的设计

本发明通过分析SLC26A4基因IVS7-2位点序列的基础上，利用软件 设计引物，经过多轮筛选，发现以下引物能够快速、准确地对SLC26A4基 因IVS7-2A>G突变进行检测。

选择3种引物进行PCR扩增实验，入选引物均为针对SLC26A4基 因IVS7-2位点序列设计的引物组合。其序列见表1。

表1 针对SLC26A4基因IVS7-2位点的3组引物组合的序列

表2反应体系

样品DNA 5μL 10×PCR buffer，含Mg²⁺2μL 2.5mM dNTPs 0.3μL 20μM的S-1/5 1μL 20μM的S-2/6 1μL 20μM的S-3/7/8 1μL 20μM的S-4/9/10 1μL 5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL ddH2O 补至20μL。

表3 反应程序

结果如图1所示，组合一的引物组在检测人血DNA样本时灵敏度不 够，组合三的引物组部分扩增条带缺失，只有本发明提供的检测引物(组 合二)能够很好的区分SLC26A4基因IVS7(-2)位点的基因型。

因此，本发明提供的检测引物的核苷酸序列：

正常外引物S1：5‘-CATATGAGAATTGATTGTGTGTGTGTGC-3’ (SEQ ID NO.1)

突变外引物S2：5‘-TGTTTCTTCCAGATCACACACAAATAGG-3’ (SEQ ID NO.2)

正常内引物S3：5‘-ATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGGCT-3’ (SEQ ID NO.3)

突变内引物S4：5‘-GGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCCG-3’ (SEQ ID NO.4)。

实施例2PCR检测方法的建立

1、采用实施例1确定的最佳引物组(组合二)进行检测SLC26A4 基因突变的PCR反应体系筛选试验

表4 反应体系一

样品DNA 5μL 10×PCR buffer，含Mg²⁺2μL 2.5mM dNTPs 0.3μL 20μM的S1 1μL 20μM的S2 1μL 20μM的S3 1μL 20μM的S4 1μL 5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL ddH2O 补至20μL。

表5 反应体系二

样品DNA 5μL 10×PCR buffer，含Mg²⁺2μL 2.5mM dNTPs 0.3μL 15μM的S1 1μL 20μM的S2 1μL 15μM的S3 1μL 20μM的S4 1μL 5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL

ddH2O 补至20μL。

表6 反应体系三

样品DNA 5μL 10×PCR buffer，含Mg²⁺2μL 2.5mM dNTPs 0.3μL 10μM的S1 1μL 20μM的S2 1μL 15μM的S3 1μL 20μM的S4 1μL 5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL ddH2O 补至20μL。

表7 反应程序

结果如图2所示，体系一和体系二在检测突变样本时，突变条带弱， 体系三在对SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合和杂合突变的区分时条带 分别更为均一。因此，本发明确定以体系三作为检测SLC26A4基因IVS7 (-2)位点纯合和杂合突变的反应体系。

2、采用实施例1确定的最佳引物组(组合二)进行检测SLC26A4 基因突变的PCR反应程序筛选试验，反应体系参照上述体系三。

预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，分别选择55℃、60℃和 65℃三个温度值作为退火温度，退火25s，72℃延伸25s，34个循环； 最后72℃延伸10min。

结果如图3所示，当退火温度为55℃和65℃时，出现错误结果及无法 判读的情况，当退火温度为60℃时能准确的扩增出正确的结果。

经过上述各条件参数的优化试验，本发明最终确定最佳选择：

PCR反应体系：以总DNA为模板，进行PCR反应，20μL反应体系： 样品DNA 5μL(10-50ng)，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL，2.5mM dNTPs 0.3μL，10μM的S1、20μM的S2、15μM的S3、20μM的S4各1μL， 5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH₂O补足20μL。

2、PCR反应条件

预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延 伸25s，34个循环；最后72℃延伸10min，降温至4℃，结束。

3、电泳

取10ul PCR扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品SLC26A4 基因IVS7(-2)位点基因型；所述判断具体为：3％凝胶电泳电泳检测 扩增产物，若电泳结果在566bp和368bp出现两条带，则说明样本为 SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常；若电泳结果在566bp和255bp出 现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合突变；若 电泳结果在566bp、368bp和255bp出现三条带，则说明样本为SLC26A4 基因IVS7(-2)位点杂合突变。

实施例3临床应用效果

步骤一，选择待测样本：待测样本为经过“PCR扩增-测序”的技术方 法检测的DNA样本，步骤为：取一定量受试者的血样DNA作为模板，采 用设计合成一对通用的SLC26A4基因引物，序列如下：

测序正向引物S5：5‘-AAGTTCAGCATTATTTGGTTGACA-3’ (SEQ ID NO.5)

测序反向引物S2：5‘-TGGTTGTTTCTTCCAGATCACA-3’(SEQ ID NO.6)

进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行测序，根据测序 结果对SLC26A4基因IVS7(-2)位点进行基因分型。

从中选择4个SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常、4个SLC26A4基因 IVS7(-2)位点纯合突变和4个SLC26A4基因IVS7(-2)位点杂合突变的人作 为受试者。

步骤二，将提取的12个受试者的DNA样本进行四引物ARMS-PCR， 步骤为：取一定量受试者的血样DNA作为模板，采用本发明设计合成的 SLC26A4基因引物进行PCR扩增。

步骤三，PCR反应体系及反应程序设置

PCR反应体系：以总DNA为模板，进行PCR反应，20μL反应体系： 样品DNA 5μL(10-50ng)，10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL，2.5mM dNTPs 0.3μL，10μM的S1、20μM的S2、15μM的S3、20μM的S4各1μL， 5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH₂O补足20μL。

PCR检测反应程序为：94℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s， 60℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；72℃延伸5min，降温至4℃， 结束。

步骤四，取10ul PCR扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳检测，判断样 品SLC26A4基因IVS7(-2)位点基因型。结果如图4所示。

步骤五，结果分析及基因型判定：电泳后基因分型结果为1-4号样 本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常，5-8号样本为SLC26A4基因 IVS7(-2)位点纯合突变，9-12号样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位 点杂合突变，该结果与测序法结果一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽 的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域 技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做 的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。