使间质干细胞不分化地增殖的方法、及浓缩间质干细胞的方法

摘要

本发明中涉及的方法浓缩脐带血中的间质干细胞，将浓缩的间质干细胞使用特定的因子不分化地增殖。

说明书

【技术领域】

本发明涉及将脐带血中的间质干细胞浓缩，不分化地增殖的方法、 及浓缩脐带血中的间质干细胞的方法。

【背景技术】

间质干细胞已知是有向属于间质的细胞(例如，成骨细胞、脂肪 细胞、肌细胞及软骨细胞等)的分化能的细胞。另外，近年报告，间 质干细胞甚至可分化为不是神经细胞及肝脏等的中胚叶性的组织。因 此，间质干细胞在再生医疗中的利用被大地期待。

间质干细胞存在于骨髓及脐带血等，采集的细胞集团中的间质干 细胞所占的比例非常地小。从而，利用间质干细胞时，一般是浓缩或 者分离间质干细胞。例如，作为浓缩间质干细胞的一例，已知从血液 除去红细胞的HES法、Ficoll法及滤器法等。

【现有技术文献】

【非专利文献】

非专利文献1：Pittenger，M.F.et al.，Multilineage Potential of  Adult Human Mesenchymal Stem Cells.Science，284:143-147,1999。

非专利文献2：Basford，C.et al.，The Cord Blood Separation  League Table：a Comparison of the Major Clinical Grade Harvesting  Techniques for Cord Blood Stem Cells.Inter.J.Stem Cells，3:32-45, 2010。

非专利文献3：Yasutake，M.et al.，Stem cell collection filter  system for human placental/umbilical cord blood processing.Vox  Sang.，80:101-105,2001。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

但是，用至今已知的方法无法充分地浓缩仅微少含有的间质干细 胞。从而，例如即使培养浓缩的样品，也由于大量地含杂质，从而无 法得到充分的数的间质干细胞。

从而，鉴于这样的课题，本发明的目的是从脐带血有效得到充分 的数的间质干细胞。

【解决课题的技术方案】

为了解决上述课题，本发明中涉及的方法是使间质干细胞不分化 地增殖的方法，其包括：使用特异性地识别血细胞的抗体生成浓缩了 脐带血中的间质干细胞的样品的工序，以及在含SHH、FGF1或FGF2 的培养基中培养上述样品的工序。

为了解决上述课题，本发明中涉及的方法是浓缩间质干细胞的方 法，其包括使用与血细胞特异性地结合的抗体珠浓缩脐带血中的间质 干细胞的工序。

【发明效果】

通过本发明可从脐带血有效得到充分的数的间质干细胞。

【附图说明】

【图1】是显示确认从脐带血分离的细胞中含间质干细胞的FACS 解析的结果的图。

【图2】是显示由本发明中涉及的培养方法增殖的细胞的数的经 时的变化的图。

【图3】是显示确认在培养第14天间质干细胞选择性地增殖的 FACS解析的结果的图。

【图4】是显示通过比较培养前及培养第14天的间质干细胞，确 认间质干细胞选择性地增殖的FACS解析的结果的图。

【实施方式】

本发明中涉及的方法是使间质干细胞不分化地增殖的方法，其包 括：使用特异性地识别血细胞的抗体生成浓缩了脐带血中的间质干细 胞的样品的工序，以及在含SHH、FGF1或FGF2的培养基中培养上 述样品的工序。

即，本发明中涉及的方法是将除去脐带血中含的血细胞(红细胞 及白细胞)的大部分之后的样品使用含特定的因子的培养基培养的方 法。如后述的实施例所示，通过使用上述特定的因子，间质干细胞维 持未分化的状态而选择性地增殖。从而，通过本发明中涉及的方法， 可从微少含间质干细胞的脐带血得到能适用于医疗用途的程度的数的 间质干细胞。

接下来说明本发明中涉及的方法的各工序的细节。

〔脐带血中的间质干细胞的浓缩〕

如上所述，本发明中涉及的方法包括浓缩脐带血中的间质干细胞 的工序。在所述工序中，通过使用特异性地识别血细胞的抗体，从脐 带血除去血细胞的大部分来浓缩间质干细胞。所述抗体与磁珠等的载 体结合。通过将与抗体结合的载体与脐带血(来源的样品)混合之后， 回收经抗体与血细胞结合的载体，得到浓缩了间质干细胞的样品。作 为代替的方法，上述抗体可由生物素标记。所述方法利用链霉亲和素 对标记上述抗体的生物素的相互作用，可选择性地除去血细胞。

其中，作为上述抗体的例，可举出抗血型糖蛋白A抗体、抗CD2 抗体、抗CD3抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD14抗体、 抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD56抗体、抗CD61 抗体、抗CD66b抗体及抗CD45抗体等。其中举的抗体是一例，本发 明中涉及的方法中可使用特异性地识别红细胞或白细胞的所述领域公 知的各种抗体。

如上所述利用抗体及载体，作为浓缩间质干细胞(选择性地除去 血细胞)的方法，可举出组合Stem Cell Technologies公司提供的 RoboSep装置和负筛选祖细胞富集试剂盒等的方法。所述方法由于可 大致不经人的手而自动地实施脐带血中的间质干细胞的浓缩，对于本 发明中涉及的方法适宜。Stem Cell Technologies公司除了上述试剂盒 之外，也提供使用者选择使用的抗体与试剂组合的试剂盒。从而，通 过组合例举的抗体和所述试剂盒，利用RoboSep装置浓缩脐带血中的 间质干细胞是可能的。

脐带血在使用抗体浓缩间质干细胞之前，优选部分分离。优选由 使用从脐带血分离单核细胞级分的Ficoll溶液的密度梯度离心分离预 先分离脐带血。

在本发明中涉及的方法中，优选确定如上所述浓缩的样品中含的 间质干细胞的大概数。由此，可预先确定浓缩的样品中的间质干细胞 由几天的培养可增殖至希望得到的细胞数。浓缩的样品中含的间质干 细胞的大概数可由使用公知的流式细胞仪、以及荧光标记的抗CD105 抗体或抗CD73抗体的FACS解析确认。FACS解析中使用的抗体只 要是对于间质干细胞的表面标志物特异性的抗体即可。

从一个体得到的脐带血是约100mL左右。在日本国内，由于充分 地含有有核细胞的量(例如约60mL以上)的脐带血储存在脐带血库 中，难以用于其他用途。从而，优选从更少的量的脐带血得到充分的 数的间质干细胞。如后述的实施例中证明，通过本发明中涉及的方法， 从25mL的脐带血得到的间质干细胞在约2周内增殖超过10⁷细胞。

〔间质干细胞的不分化地增殖〕

本发明中涉及的方法包括培养浓缩了间质干细胞的样品的工序。 在所述工序中，上述样品使用作为生长因子含SHH、FGF1或FGF2 的培养基进行培养。通过使用所述培养基，可使在仅添加Flt-3L、IL-3 及IL-6的培养基中几乎不增殖(参照实施例)的间质干细胞不分化地 增殖。

上述培养基以在间质干细胞的不分化地增殖中使用的公知的培养 基作为基本培养基使用。上述基本培养基是，如实施例所示由Stem  Cell Technologies公司等市售的，或是将市售品部分改变的培养基， 或者与市售品具有类似的组成。上述培养基可含在干细胞的增殖中使 用的公知的细胞因子(例如，Flt-3L、SCF、IL-3及IL-6)。对上述 培养基适宜的其他添加物是在间质干细胞的不分化地增殖中使用的各 种的添加物，所以是本领域技术人员公知的。

SHH以例如，5～500ng/mL、更优选为50～200ng/mL、最优选 为100ng/mL的浓度含在用于选择性地不分化地增殖间质干细胞的培 养基中。FGF1以0.1～50ng/mL、更优选为1～10ng/mL、最优选为 5ng/mL的浓度含在用于选择性地不分化地增殖间质干细胞的培养基 中。FGF2以0.1～50ng/mL、更优选为1～10ng/mL、最优选为5ng/mL 的浓度含在用于选择性地不分化地增殖间质干细胞的培养基中。 Flt-3L以例如500～5000IU/mL、更优选为1000～4000IU/mL、最优 选为2000IU/mL的浓度含在用于选择性地不分化地增殖间质干细胞 的培养基中。SCF以例如1～400ng/mL、更优选为10～200ng/mL、 最优选为100ng/mL的浓度含在用于选择性地不分化地增殖间质干细 胞的培养基中。IL-3以例如200～5000IU/mL、更优选为500～ 2500IU/mL、最优选为1000IU/mL的浓度含在用于选择性地不分化地 增殖间质干细胞的培养基中。IL-6以例如200～5000IU/mL、更优选 为500～2500IU/mL、最优选为1000IU/mL的浓度含在用于选择性地 不分化地增殖间质干细胞的培养基中。

浓缩的上述样品使用上述培养基培养任意期间(至得到希望得到 的数的间质干细胞)。上述期间随得到的样品中含的间质干细胞的数 而变更。以后述的实施例的情况为例，上述期间在，例如，从25mL 的脐带血回收浓缩的样品时是约14天。由约14天的培养而上述情况 的样品中的间质干细胞可能增殖超过，例如约1×10⁷细胞。

从以上的记载可知，本发明中涉及的SHH、FGF1或FGF2是向 用于选择性地不分化地增殖从脐带血浓缩的间质干细胞的培养基加的 添加剂(例如间质干细胞的增殖促进剂)。另外，本发明涉及作为向 用于不分化地增殖间质干细胞的培养基加的添加剂，使用SHH、FGF1 或FGF2。

另外，如以上说明，由本发明中涉及的方法从脐带血得到对于在 再生医疗等中使用而言充分的数的间质干细胞是可能的。例如，利用 至今用于研究用途的少量(例如不足60mL)的脐带血，可得到有用 的间质干细胞。

本发明中涉及的方法是分离从人采集的脐带血中含的干细胞，并 使其增殖的方法。由本发明得到的间质干细胞是例如再生医疗使用的 材料。另外，由本发明得到的间质干细胞是在再生医疗中直接使用的 细胞(药品)。

〔总结〕

本发明中涉及的方法是使间质干细胞不分化地增殖的方法，其包 括：使用特异性地识别血细胞的抗体生成浓缩了脐带血中的间质干细 胞的样品的工序，以及在含SHH、FGF1或FGF2的培养基中培养上 述样品的工序。

另外，在本发明中涉及的方法中，上述培养基优选还含SCF。

另外，在本发明中涉及的方法中，上述培养基优选还含Flt-3L、 IL-3及IL-6。

本发明中涉及的方法是浓缩间质干细胞的方法，其包括使用与血 细胞特异性地结合的抗体珠浓缩脐带血中的间质干细胞的工序。

另外，在本发明中涉及的方法中，上述抗体珠含珠及与所述珠结 合的抗体，所述抗体优选选自：抗血型糖蛋白A抗体、抗CD2抗体、 抗CD3抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD14抗体、抗 CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD56抗体、抗CD61 抗体及抗CD66b抗体。

【实施例】

〔1.脐带血中的间质干细胞的浓缩〕

由使用Ficoll溶液(GE HEALTHCARE公司)的密度梯度离心 分离(30分钟、900g、25℃)从25mL的脐带血分离单核细胞级分。 使用RoboSep装置(Stem Cell Technologies公司)，从得到的单核细 胞级分进一步去除血细胞，将其余的细胞集团浓缩。在从此单核细胞 级分除去血细胞中，使用负筛选祖细胞富集试剂盒(Stem Cell  Technologies公司)作为试剂。在所述试剂中包括与磁珠结合的抗血 型糖蛋白A抗体、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD11c抗体、抗 CD11b抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD24 抗体、抗CD56抗体、抗CD61抗体及抗CD66b抗体。从而，所述试 剂也可能除去在表面表达由这些的抗体识别的抗原的细胞。所述分离 中的顺序及必要的其他试剂的全部则依照对应于上述试剂的RoboSep 装置的动作程序、及附属的使用者手册。

将根据以上的操作得到的样品之一部分与荧光标记的抗CD105 抗体(Biolegend公司、对间质干细胞的细胞表面标志物的抗体)混合。 然后，由BD FACSCalibur(注册商标)流式细胞仪(日本BD公司) 研究此混合物中所含的间质干细胞的程度。此FACS解析的结果示于 图1。图1是显示对CD105阳性细胞进行FACS解析的，单线性区的 直方图的图。如图1所示，可确认在上述样品中含在表面表达CD105 的间质干细胞。

〔2.间质干细胞的不分化地增殖〕

【2-1.SHH对脐带血来源的细胞的增殖的作用】

使1.中得到的细胞如以下一样增殖。经培养的0～14天，使用补 充Flt-3L(Cellgenix公司)、SCF(Cellgenix公司)、IL-3(Miltenyi  Biotec公司)及IL-6(Miltenyi Biotec公司)及SHH(Miltenyi Biotec 公司)的MesenCult-XF培养基(Stem Cell Technologies公司)，在 5％CO₂的存在下，于37℃使细胞增殖。上述培养基中的各细胞因子 的最终浓度各自是，2000IU/mL(Flt-3L)、100ng/mL(SCF)、 1000IU/mL(IL-3)、1000IU/mL(IL-6)及100ng/mL(SHH)。为 了确认添加到培养基的因子的有效性，与上述培养平行，仅补充 Flt-3L、IL-3及IL-6的MesenCult-XF培养基、及仅使用MesenCult-XF 培养基，各自培养1.中得到的细胞。由锥虫蓝染色确定培养的第0、3、 6、8、11及14天的各自中的总细胞数。确定的细胞数的经时的变化 示于图2。

如图2所示，使用除公知的细胞因子之外，补充SHH的培养基 时(添加SHH、Flt-3L、SCF、IL-3、IL-6)可确认，在第0天时是 0.9×10⁶细胞的细胞在培养14天后，增殖至1.94×10⁷细胞。另一方面， 在未加SHH时(添加Flt-3L、IL-3、IL-6、及未添加这些)几乎见不 到细胞的增殖。

【2-2.选择性地增殖的细胞种的确认】

为了确认由2-1.的培养增殖的细胞是间质干细胞，由FACS解析 确认在培养的第14天增殖的细胞的种类。使用荧光标记的抗CD105 抗体(Biolegend公司)及荧光标记的抗CD73抗体(Biolegend公司) 研究第14天的培养物之一部分。使用BD FACSCalibur(注册商标) 流式细胞仪(日本BD公司)实施全部的FACS解析。这些的FACS 解析的结果示于图3(抗CD105抗体)及图4(抗CD73抗体)。图 3是显示，对在培养第14天的CD105阳性细胞进行FACS解析的， 单线性区的直方图的图。图4是显示对培养前及培养第14天的CD73 阳性细胞进行FACS解析的，单线性区的直方图的图。

如图3所示，与图1的结果相比，CD105阳性细胞(即间质干细 胞)明显增殖。另外，如图4所示，与培养前相比，由2周的培养， CD73阳性细胞(即间质干细胞)明显增殖。从以上的结果，在2-1. 中，间质干细胞保持未分化地增殖，例如，可在再生医疗的用途得到 充分的数的间质干细胞。从而得知，特别是，SCF与本发明中涉及的 SHH的组合在间质干细胞的不分化地增殖中显示重要的作用。

【2-3.FGF1或FGF2对脐带血来源的细胞的增殖的作用】

将1.中得到的细胞在96孔板中如以下一样培养。使用补充后述的 表1的组合的细胞因子(5ng/mL的FGF1(Miltenyi Biotech公司)、 5ng/mL的FGF2(Miltenyi Biotech公司)、100ng/mL的SCF(Cellgenix 公司))的MesenCult-XF培养基，在5％CO₂的存在下，于37℃使 细胞增殖。7天的培养之后，由显微镜确认细胞数，评价细胞因子的 各组合对间质干细胞的增殖的作用。

【表1】

  无 SCF 无 ± + FGF1 + +++ FGF2 + +++

※与未添加细胞因子时相比，

±:无变化

+:略促进增殖

++:促进增殖

+++:显著地促进增殖

如表1所示，由单独的FGF1或FGF2的添加，间质干细胞的增 殖被略促进。由FGF1或FGF2的与SCF的组合，间质干细胞的增殖 被显著地促进。从以上的结果得知，FGF1及FGF2有促进间质干细 胞的增殖的作用。

本发明不限于上述的各实施方式及实施例，在权利要求中表示的 范围内各种变更是可能的，将实施方式及实施例中公开的各种技术方 案适宜组合而得到的实施方式也包括在本发明的技术的范围内。

【工业实用性】

本发明特别是可在使用间质干细胞的再生医疗中利用。