干预GDNF基因表达后骨髓间质干细胞向神经样细胞分化的实验研究

摘要

研究发现全骨髓贴壁法可分离骨髓间充质干细胞，Hayley等进一步研究证实该方法可成功分离小鼠骨髓间充质干细胞，本研究在此基础上通过连续半换液法在体外培养12天后获得较高融合度的原代梭形贴壁生长细胞，传代培养后细胞仍保持良好的贴壁生长特性及梭形形态，经流式细胞技术检测结果表明该贴壁细胞高表达表型分子CD45、CD90，极低表达CD34、CD44，可认为本研究中梭形贴壁细胞为骨髓间充质干细胞，进一步MTT实验结果提示细胞活力增殖较好，较Li等人的研究结果，本研究不仅成功实现了对骨髓间充质干细胞分离、纯化，并在一定程度上缩减了原代细胞获取时间，可为后续研究提供质量、数量较为理想的种子细胞。故本研究中采用基因修饰方法，以腺病毒为载体将GDNF基因导入骨髓间充质干细胞后发现，当MOI=IOO转染72h后荧光显微镜观察发现Ad-rGDNF-GFP转染组中细胞可成功的表达GFP，同时细胞形态保持完好，并未出现病毒转染所产生的细胞“病变”效应；荧光定量PCR检测结果表明载rGDNF重组腺病毒转染BMSCs后细胞内源性GDNF表达水平较对照组明显提高，并具有统计学差异性，结合MTT结果发现，Ad-rGDNF-GFP转染组细胞内源性GDNF表达提高后，细胞活较力对照组显著提高，这些结果表明采用重组目的基因腺病毒并以合适的MOI转染方式，可在保持细胞较好活力的前提下持续性的提高靶细胞内源性GDNF目的基因的表达水品。进一步采用免疫荧光鉴定技术发现，Ad-rGDNF-GFP转染组中细胞于转染7d后表达神经元特异性标记物NSE，细胞胞体皱缩明显，伸出神经样细胞突触结构，而对照组中骨髓间充质干细胞NSE表达阴性，且细胞仍维持原梭形或成纤维样细胞形态，表明提高内源性GDNF基因表达水平可促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化。与采用神经营养因子蛋白诱导细胞分化相比较，采周基因修饰方法可提高靶细胞内源性目的基因表达水平，无需在诱导分化过程中添加外源性诱导剂，更有助于实现对靶细胞的持续、稳定性诱导分化作用，Yang S与Ye Y等研究发现富含GDNF等多种神经样因子的脑组织萃取物或脑脊液可诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化，但诱导剂成分混杂，无法确定在骨髓间充质干细胞分化过程中起关键作用的因素，本研究中通过基因修饰方法提高细胞内源性GDNF基因表达水平后骨髓间充质干细胞可向神经样细胞自行分化，在明确分化关键因素基础上有助于对分化机制的进一步探索与研究。