一种植物维管束发育基因sm-Nvas及其应用

摘要

本发明公开了植物维管束发育基因sm-Nvas的核苷酸序列、菌核病和稻瘟病抗性特征及其抗病性在作物育种的应用。该方法包括下列步骤，首先烟草突变体的获得及鉴定；其次是植物维管束发育基因sm-Nvas的克隆；第三是植物维管束发育基因sm-Nvas的遗传转化(受体包括水稻、拟南芥等)；第四是转基因植株抗病性的鉴定(水稻：稻瘟病；拟南芥及油菜：菌核病)；第五是该基因抗病性在作物育种的应用。本发明所涉及核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；拟南芥菌核病抗性特征如附图1所示；水稻稻瘟病抗性特征如附图3所示。

说明书

技术领域

本发明提供了一种受水杨酸和稻瘟病菌的双诱导的植物维管束发育基因sm-Nvas， 该基因用于水稻抗稻瘟病和白叶枯病分子育种，属于基因工程技术领域。

背景技术

植物维管束系统包含木质部和韧皮部，都由原形成层细胞发育而来。原形成层细胞 具有强大的功能，形成的木质部和韧皮部存在于各种特化的组织器官中，比如叶、茎和 根等。维管束在植物体内形成束状，连接植物的各个部位，为植物提供水、养分及植物 生长所必要的其它物质。在植物的分生组织细胞中，韧皮部、原形成层、木质部细胞系 在早期就特定发育和分化，这一系列事件的发生通常需要特异基因直接或间接的作用。

VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN(VND)的两个转录因子VND6和VND7分别 促进后生木质部和初生木质部的分化。产生于韧皮部的TDIF(CLE41/CLE44)在抑制木质 部分化的同时还增加原形成层细胞的增殖。PXY/TDR对于维持形成层细胞的分裂和木 质部、韧皮部的空间排布是必需的。TDIF作为信号分子与其受体PXY/TDR介导韧皮部 和木质部之间的信号传递，两者相互作用能够维持形成层干细胞的活力，并调控其向木 质部的分化。WOX4在原形成层和形成层中优先表达，在TDR/TDIF的作用下表达量上 调。遗传分析显示WOX4基因在促进原形成层和形成层的增殖是必需的，但对于原形 成层分化为木质部却不是必需的。利用功能缺失突变体的实验证实在二次生长过程中 TDIF-TDR-WOX4对维管束分生组织的维持起着关键作用。植物GTs对糖的修饰作用与 木质部和韧皮部的发育和形成具有密切的关联性。Persson等在拟南芥突变株中发现随 着拟南芥细胞壁中木聚糖的含量下降，将引起茎维管束和维管束间纤维细胞壁的不平坦 而引起木质部坍塌，进而影响木质部的功能发挥。在白杨树中，木聚糖和甘露糖对次级 壁的产生是必须的，而次生木质部的发育与次级壁又相关联，说明在木质部发育过程中 需要相关的糖基转移酶来实现。在稻科植物中，木聚糖在α-(1,2)–或α-(1,3)–与阿拉伯糖 相连，GT61家族蛋白对阿拉伯糖基木聚糖生物合成起着重要作用。

发明内容

本发明提供了一种植物维管束发育基因sm-Nvas，将该基因导入至植株中，均导致 转基因植株矮化、茎和叶脉增粗、叶脉增多等表型特征，该基因的核苷酸序列如SEQ ID  NO:1所示，由1392个碱基组成。该基因所编码的多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示，由463个氨基酸组成。

在抗性鉴定中发现，该基因在水稻中具有增强稻瘟病抗性等特征。因此该植物维管 束发育基因sm-Nvas能够应用于培育抗稻瘟病的水稻品种中，具体包括以下步骤：

(1)、根据植物维管束发育基因sm-Nvas，构建超量表达载体；

(2)、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入水稻品种，利用甲基茉莉酸和水杨 酸诱导型启动子在植物细胞中诱导表达目的基因；

(3)、该品种对稻瘟病菌表现出抗菌性。

在抗性鉴定中发现，该基因在拟南芥和油菜等农作物中具有菌核病抗性，因此该植 物维管束发育基因sm-Nvas能够应用于培育抗菌核病的农作物品种中，具体包括以下步 骤：

(1)、根据权利要求1所提供的植物维管束发育基因sm-Nvas，构建超量表达载体；

(2)、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入农作物品种，利用甲基茉莉酸和水 杨酸诱导型启动子在植物细胞中诱导表达目的基因；

(3)、以上品种对菌核病均表现出抗菌性。

本发明在前期工作中发现了一个植株矮化、茎杆增粗、叶脉增多等特征的烟草突变 体。以该突变体为材料克隆了一个新的受茉莉酸甲酯(MeJA)及水杨酸(SA)双重诱导的 UDP-糖基转移酶家族的新成员，细胞学观察和组织特异性研究结果揭示该基因的生物 学功能与烟草的维管束发育相关。在sm-Nvas超表达的烟草(W38)和拟南芥(Col-0)转基 因植株中，均导致转基因植株矮化、茎和叶脉增粗、叶脉增多等表型特征。

附图说明

图1为本发明实施例中所提供的转sm-Nvas基因的拟南芥植株菌核病抗性对照图；

图2为本发明实施例中所提供的转sm-Nvas基因拟南芥植株的基因表达图；

图3为本发明实施例中所提供的转sm-Nvas基因水稻稻瘟病抗性对照图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并 不局限于以下实施例。

本发明实施例中所用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技 术；所用的仪器设备、试剂等，除非特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过 公共途径获得。

1、烟草突变体的获得及鉴定

采用的烟草突变体表现出植株矮化、茎杆增粗、叶脉增多等表型；对突变体和野 生型叶脉和茎进行石蜡切片，细胞学观察均显示维管束列数和管状分子数明显增多，维 管束长度和薄壁细胞长度有所缩短，推测该表型的产生与维管束发育有关。

2、植物维管束发育基因sm-Nvas的克隆

通过差异展示技术从烟草突变体中分离了一个RNA表达水平明显高于野生型(W38) 植株的cDNA序列，利用RACE技术获取了基因的全长cDNA，利用全长cDNA为探针 筛选基因组文库，获取了序列为1392个核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，此基因即为 植物维管束发育基因sm-Nvas，生物信息学预测该基因编码463个氨基酸，其氨基酸序 列如SEQ ID NO.2所示。

3、植物维管束发育基因sm-Nvas的遗传转化

(1)转基因培养基配方

1)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73 克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

2)维生素贮存液(100X)配制

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

3)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

4)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

5)诱导愈伤培养基MS+2mg L^-1BA+0.2mg L^-1NAA+30g L^-1蔗糖+8.0g L^-1琼脂粉 (pH5.8)

6)筛选培养基MS+2mg L^-1BA+0.2mg L^-1NAA+30g L^-1蔗糖+8.0g L^-1琼脂粉 +600mg L^-1Amp+50mg L^-1hptⅡ(pH5.8)

7)生根培养基1/2MS+600mg L^-1Amp+30g L^-1蔗糖+8.0g L^-1琼脂粉(pH5.8)

8)2,4-D贮存液(1mg L^-1)的配制：秤取2,4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶 解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

9)6-BA贮存液(1mg L^-1)的配制：秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解 5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

10)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg L^-1)的配制：秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢 氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

(2)拟南芥转基因转化步骤

1)拟南芥的培养

将拟南芥种子经10％双氧水消毒后接种于MS培养基上，于22℃、光照10h培养 1-2周，长出无菌苗后转移至坧石和土(3:1)混合物上培养。

2)转化流程

1、挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌GV3101菌株至5ml新鲜 YEB液体培养基(50μg/ml Kan，125μg/ml Rif)中，28℃摇培24h。

2、取上述菌液0.1ml接至50ml新鲜YEB液体培养基(50μg/ml Kan，125μg/ml  Rif)中，28℃220rpm培养2～4h，使OD值达到0.8左右。

3、取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min，弃去上清，用 转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。

4、将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入10mlEP管中，加入上述转化 液，浸染5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做好标记。

3)转化后的管理

1、在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培养 16-24h(过夜)后，将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足营养液，恢复正常培养。

2、为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取适量重悬目的质粒的新鲜转 化液，逐个醮沾花蕾。

3、转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔出现分枝，及时 剪除。

4、待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥 角果大部分枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml的EP管中(在盖上扎一小孔以便干 燥)。种子完全干燥后，放于1.5ml新EP管中4℃短期保存。

4)抗生素筛选转化种子

1、种子消毒及接种同1，所用的培养基是筛选培养基(1/2MS+250mg L-1潮霉素)；

2、将消毒过的种子接入筛选培养基中，4℃春化处理2d；

3、光照8h；

4、黑暗2d；

5、光照超过24h；

6、一些种子已经长到1-2cm高，并且生根，小叶变绿，而其他种子仅长到1cm高， 未生根叶片发黄。无菌条件下将那些生根且高的幼苗移栽在无抗生素的1/2MS培养基 中；

7、获得的阳性转化苗常规培养，光照培养(光照10h、22℃/黑暗14h、20℃)约1 个月，幼苗约8片真叶；

8、移栽出幼苗，进行DNA分子鉴定，观察其形态变化。

(3)水稻转基因转化步骤

1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导和继代培养

1、取饱满的水稻种子，除去颖壳，淘汰病残米粒，选取健壮完整的稻米粒作为 水稻胚愈伤组织诱导的起始材料。

2、在超净工作台上将去壳的米粒装入100ml的灭菌锥形瓶中，倒入75％的酒 精洗1min，用灭菌水清洗2次，再用0.1％的氯化汞消毒15min，并不断摇动锥形瓶， 使消毒液与米粒表面充分接触。

3、消毒结束后，用灭菌水清洗种子3次，将种子沥干，接种于诱导培养基上， 置于培养室内避光培养，温度控制在26-28℃左右。培养20天左右，将长出的愈伤与 种子分离，直接用于转化或者接种于新的继代培养基上继续培养，此后每20天左右继 代一次。

2)农杆菌的培养

从-70℃冰箱中取出含有转化质粒和只含有pU1301载体的农杆菌菌种，用接种环 蘸取菌种在含有卡那霉素的LB平板上致密划线，28℃培养2－3天，然后刮取长好的 菌斑至转化预培养培养基(液体)，振荡培养1－2h，调整其OD值在1.0左右，用于转化。

3)水稻愈伤组织的转化和抗性筛选

1、取生长旺盛的胚性愈伤组织接种于转化预培养培养基上，28℃预培养2-3天。

2、预培养结束后，将愈伤组织集中于培养好的农杆菌中，浸染30min，每隔10min 左右振荡一次，使菌液能和愈伤组织表面充分接触。

3、浸染后，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上，吸干多余菌液，转移至共培养固体 培养基上，20℃暗培养2-3天至菌落明显可见。

4、共培养好的愈伤，用无菌金属勺舀到无菌的三角烧瓶中，先用无菌水洗4次至 澄清，再用含有0.4g/L头孢霉素的无菌水洗1次，倾去水后，将愈伤倒出，放在无菌滤 纸上，在超净工作台上干燥30-40min，置于筛选培养基上，28℃暗培养。

4)抗性愈伤分化成苗

转化后的愈伤在筛选培养基上培养3-4周后，即可见瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈 伤中长出。待抗性愈伤长大后可挑选一部分抗性愈伤转移至分化培养基上，28℃光照培 养2周左右可见愈伤变绿，3-4周即可长出幼芽。待幼芽长至3cm左右时，将其从愈伤 组织上分离并接种于生根培养基上。

5)转基因苗的炼苗及移栽

在含有50mg l^-1hygromycin的选择培养基上筛选出抗性的转基因幼苗，再生植株 在生根培养基上生长15-20天，根系发达、植株高度达8cm以上时，即打开培养瓶， 加入适量无菌水进行炼苗。经2-5天炼苗，将植株从培养瓶中取出，洗净培养基，移栽 至温室苗盆。

6)转基因植株检测

提取转基因植株的总DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，对转基因植株进行阳 性分析。

4、转基因植株抗病性的鉴定

拟南芥菌核病鉴定

1)菌核病菌的培养：从4℃保存的菌核菌平板菌落外缘用灭菌的打孔器切取1块直 径为6mm的菌丝块，移至PDA培养基平板中央，在25℃人工气候箱活化培养，2d 后再接至新鲜PDA培养基平板中央，3d后从菌落边缘新生的菌丝中用灭菌的打孔器切 取1块直径为6mm的菌丝块，按5块/50mL加入到液体培养基中，在25℃、180rpm 振荡培养4d。

2)菌核病菌的接种：对阳性转基因植株和WT植株叶片注射接种，每个株系接种4 片叶子，每片叶子主叶脉左侧接空培养基对照，右侧接种病原菌，每片叶接100μL菌 液。阴性对照则植株接种液体培养基。

3)抗病性鉴定：4d后观察植株叶片损伤情况，其结果如图1所示，图1中1为野 生型对照植株，2-10为转基因植株。图2为转sm-Nvas基因拟南芥植株的基因表达图。

水稻稻瘟病鉴定

1)菌种活化

2)4-5叶期的水稻幼苗(播种后10-14天)接种稻瘟病菌孢子悬浮液(浓度2-3X 10⁵孢子/毫升)。接种后的植株在100％湿度和25℃的温育箱里放置24小时，然后转移到 15-25℃温控的温室里，7-10后进行病斑检测，以0(没有病斑)-5(枯死)作为发病的 衡量标准，结果如图3所示，在图3中，A为野生型，B为转基因植株，C为阴性对照。