水稻维管束发育相关基因AVB基因的图位克隆和功能分析

摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是研究植物功能基因的模式作物。水稻的株型研究一直是水稻育种的重点。水稻的地上部位均是由茎端分生组织发育而来，在圆顶形SAM的周边区域，部分干细胞分化形成侧生器官原基，由侧生器官原基进一步发育成熟器官的过程一般可分为细胞分裂和细胞伸长两个阶段，但这两个阶段并没有明显界限。侧生器官原基的细胞分裂速度直接决定了最终的细胞数目，在决定器官大小方面起着重要作用。在侧生器官原基发育为成熟器官的过程中，原形成层细胞在特定的位置上不断分化并最终形成维管系统。植物的维管系统连通从根部到地上部分的整个植物体，长途运输营养物质和水分并为植物体提供机械支撑。
　　但由于目前对调控侧生器官原基的分化和细胞分裂速率的分子机制了解并不深入，需要更多的研究以深化理解。在本研究中，首先我们证明了AVB基因参与维持侧生器官原基正常的细胞分裂过程，其次我们证明了AVB基因参与生长素诱导的原形成层细胞的分化过程，最后我们发现AVB基因影响原形成层细胞的细胞分裂过程。具体的研究结果如下：
　　1. avb突变体表型观察
　　相比于野生型缙恢10号，avb突变体最明显的特征是整个营养生长阶段叶片变窄，并且随着生长的继续，叶片变窄的程度逐渐加深。除了叶片变窄外，在成熟期测量各节间的直径发现相比于野生型，突变体的各节间直径也明显减少了。除了叶片和茎秆变窄，成熟期突变体的穗部也明显表小了，穗茎轴变窄，一次枝梗和二次枝梗数目减少。相比于地上部分器官的宽度明显减小，突变体的叶片长度及各节间的长度并没有发生明显变化。
　　2. avb突变体组织学分析
　　为了探明造成 avb突变体地上部分器官变窄的原因，对野生型和突变体的各个器官进行组织切片，观察发现相比于野生型，突变体叶片、叶鞘、茎秆、穗茎轴横切面上的细胞总数显著减少，且大小维管束的数目减少，在叶鞘、茎秆和穗茎轴部位还观察到大小维管束的面积明显增大，相邻维管束之间的细胞数目增多。同时发现相比于野生型，突变体地下根部，一次枝梗和二次枝梗横切面上细胞总数和维管束均无明显变化。
　　3. AVB基因遗传分析和分子定位
　　利用日本晴与avb突变体进行杂交，发现F1代植株均表现正常，表明突变性状是受隐性基因控制的；F2代群体出现性状分离，有正常群体和窄叶群体两组，正常单株：窄叶单株符合3:1的分离比，表明突变性状受1对隐性核基因控制。以日本晴与avb突变体杂交的F2代窄叶单株作为定位群体，利用SSR和InDel标记进行AVB基因的定位，最终将AVB基因定位在第3染色体长臂标记SF2和SR3之间，物理距离46Kb。
　　4. AVB候选基因克隆和转基因验证
　　对定位区间内的8个注释基因的DNA片段进行测序，最终发现编码一个未知功能蛋白的基因Os03g0308200的蛋白编码区域发生了单碱基的改变，由C碱基变为 T碱基，对应的密码子由精氨酸密码子突变为终止密码子，因此我们初步推测Os03g0308200基因是AVB基因的候选基因。为了验证候选基因Os03g0308200就是我们要寻找的AVB基因，我们构建了包含Os03g0308200基因全长序列的互补载体和包含部分cDNA片段的干涉载体，把互补载体转入avb突变体中发现突变表型完全恢复，把干涉载体转入中花11的转基因植株中的Os03g0308200基因表达量明显下调，且叶片明显变窄且维管束数目减少，这说明Os03g0308200基因就是AVB基因。
　　5. AVB基因的表达模式分析
　　利用定量PCR分析AVB基因在水稻植株中的表达情况，使用水稻ACTIN4作为内参，以AVB基因在幼穗中的表达水平作为标准，发现AVB基因在茎尖生长点部位表达水平最高。利用原位杂交观察 AVB基因在过茎尖纵切面上的信号发现AVB基因信号主要集中在茎尖部位，说明AVB基因的主要表达位点是茎尖部位。为了进一步分析AVB基因在茎尖部位的表达情况，我们仔细分析了过水稻顶端分生组织的横切和纵切上AVB基因的信号分布情况，发现AVB基因的表达主要集中在顶端分生组织的叶原基启动部位和叶原基，随着叶原基的分化发育，AVB基因的表达集中在原形成层细胞中。在成熟叶片中，AVB基因的表达均匀分布在整个维管束，没有韧皮部和木质部特异性。
　　6. AVB基因参与生长素诱导的原形成层分化过程
　　考虑到生长素信号在原形成层分化中的作用，且在 avb突变体的叶原基发育过程中，发现原形成层分化数目减少，我们推测AVB基因可能与生长素之间有关系，为此我们使用活性生长素IAA和生长素极性运输抑制剂TIBA处理缙恢10号，发现在用TIBA处理两小时后，茎尖生长点部位的AVB基因的表达量明显上调。并且我们在AVB基因的启动子上发现了3个典型的生长素反应元件，这3个生长素响应元件分别用罗马数字Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ表示，体外凝胶阻滞实验显示生长素响应因子的DNA结合结构域可以与这3个生长素响应元件结合，以离起始密码子最近的Ⅲ号元件的结合能力最强，因此我们推测AVB基因可能通过启动子上的生长素响应元件参与叶片发育过程中生长素诱导的原形成层分化过程。
　　7. AVB基因的蛋白功能分析
　　AVB蛋白含有988个氨基酸残基。根据Phytozome网站上提供的信息，水稻中AVB家族蛋白共有5个。虽然NCBI网站上提供的注释信息认为AVB蛋白是功能未知且没有保守结构域，但根据全球蛋白质资源数据库提供的信息，AVB蛋白属于Armadillo-type fold蛋白家族，ARM类折叠（Armadillo-type fold）是由两层α螺旋组成的右手超螺旋结构，一般用于介导蛋白质之间的相互作用。对AVB的同源蛋白进行系统进化树分析发现AVB在陆生植物界是保守的，且功能都没有过报道。
　　为了进一步获得水稻植株内AVB蛋白产物的分布情况，我们采用western blot分析了在水稻植株的不同部位，AVB蛋白的存在情况，结果发现AVB蛋白质只存在于茎尖生长点部位且avb突变体中AVB蛋白完全缺失。AVB蛋白的亚细胞定位结果显示AVB蛋白产物定位于细胞质和细胞核中。
　　考虑到avb突变体地上器官横切面上细胞数目减少，我们推测avb突变体的细胞分裂过程可能受到了AVB蛋白缺失的影响。采用流式细胞仪分析野生型和突变体生长点部位细胞的染色体倍性，发现突变体生长点细胞的四倍体比例明显低于野生型的，这说明相对于野生型，突变体处于S期的细胞数目明显减少，细胞分裂过程确实受到了AVB蛋白缺失的影响。histone H4作为染色体的组成成分，特异地在处于G1-S期的细胞中表达，采用原位杂交考察野生型和突变体过SAM横切面上histone H4基因的表达情况进一步证明了AVB蛋白维持着生长点区域干细胞细胞分裂的正常进行。不同于叶原基部位histone H4基因表达频率降低，在幼嫩叶鞘的原形成层细胞中，histone H4基因的表达频率明显增高，暗示相对于野生型，突变体原形成层细胞具有更强的细胞分裂能力，这也解释了为什么在突变体中，维管束面积增大。
　　8. avb突变体的转录组分析
　　为了获得由AVB基因突变所造成的突变体转录组水平上的变化情况，在分蘖后期，提取野生型和avb突变体的茎尖生长点部位的总RNA进行RNA-Seq，每个材料设置了3个独立的生物学重复。通过RNA-Seq共筛选到730个在野生型和突变体中差异表达的基因，其中678个基因在avb突变体中表达上调，52个基因下调。使用AgriGo网站对筛选到的差异基因进行gene ontology（GO）富集分析。GO富集结果显示参与多细胞器官发育过程（GO：0007275）的基因受到AVB基因突变的强烈影响：水稻中参与这一过程的基因共有45个，其中44个基因的表达水平都发生了不同程度的改变：36个基因的表达明显上调，8个基因的表达水平下调。这一结果与茎尖生长点区域的细胞倍性分析以及histone H4基因的原位杂交分析的结果吻合，更进一步证明了AVB基因通过影响细胞分裂过程造成水稻SAM分化形成地上器官过程的异常。

目录

声明

第1章文献综述

1.1顶端分生组织的维持与分化

1.2侧生器官原基的分化

1.3维管系统的分化发育过程

1.4细胞分裂过程与器官形态建成

第2章引言

2.1研究目的和意义

2.2研究内容

第三章 材料与方法

3.1材料

3.2形态学分析

3.3 组织学分析

3.4 染色体倍性分析

3.5 基因组DNA的提取

3.6 目标基因定位

3.7 候选基因的克隆

3.8 候选基因的转基因验证

3.9 基因表达水平的定量分析

3.10 基因表达部位的原位杂交分析

3.11 蛋白产物的亚细胞定位分析

3.12 蛋白产物的western blot分析

3.13 体外凝胶阻滞分析

3.14 RNA-seq分析

第4章结果与分析

4.1 avb突变体形态学和组织学分析

4.2 AVB基因的图位克隆

4.3 AVB基因的表达分析

4.4 AVB基因的蛋白产物分析

4.5 avb突变体的转录组分析

第5章讨论与结论

5.1讨论

5.2结论

附件

附件1 表达载体pCAMBIA1301图谱

附件2 表达载体pTCK303图谱

附件3 表达载体S65T-2图谱

参考文献

致谢

附录 I 部分发表的论文