一种增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段。所述UCOE调控元件片段的碱基序列如序列表所示。该调控元件片段在外源蛋白表达的方面，通过构建重组质粒表达载体pCpG-Mini-GFP-UCOE，转染HEK293T细胞，可以增强GFP表达。本发明以人的1.5kbUCOE片段作为对照，利用酶切方法和RT-PCR方法将猪UCOE片段分割成不同长度的片段，构建不同表达载体，转染HEK293T细胞，通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测报告基因GFP的相对表达量筛选出最佳的能够增强外源基因表达的UCOE片段序列，即本发明所请求保护的基因序列。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段。

背景技术

染色体开放元件（ubiquitous chromatin opening element，UCOE）能改变染色体结构使其保持转录活性，这一元件主要包括位点控制区（locus control regions，LCR）和UCOE两种类型。LCR只能在几种特定的组织内参与调节转基因的表达。而UCOE在广泛的组织内都能调节转基因的表达。在结构组成上，那些包含看家基因的双向转录启动子且被丰富的无甲基化CpG岛围绕的基因组区域，因为能够给予转基因稳定高水平的表达，被定义为UCOE。在调控基因表达时UCOE与组织特异性和整合位点无关，它能够改变异染色质结构使其活化处于开放状态，进而使基因始终保持转录而不沉默。调控元件UCOE的应用有可能使一系列载体的转基因表达得以改善。

现有研究一般认为造成转基因表达效率低的主要因素之一是转录沉默，这通常与整合位点周围染色质浓缩、CpG岛的 DNA序列甲基化以及组蛋白去乙酰化这三个因素有关。如果要使外源基因在宿主生物细胞中高效表达必须保证整合到动物染色体中的表达载体周围的染色质环境处于一个开放和活跃转录的状态，不受表观遗传学修饰及其他生物学效应的影响。其次是选用调控成分如核基质/核骨架附着区（S/MARs）、染色质开放元件、启动子、增强子等能实现目的基因在组织中高效、特异地表达。

目前在转基因技术中有两个非常重要的应用。一是快速生产重组蛋白，用于分子生物化学基础研究、药物开发以及临床应用前研究。例如在治疗学方面通过利用UCOE可以控制常见的细胞因子受体γ链基因（IL2RG）的表达，并且证实这种调控对小鼠X-连锁SCID表型疾病有治疗效果。另一种是能更快、更易识别那些可以大规模生产稳定高水平的治疗学蛋白质的克隆细胞系。例如利用调控元件UCOE的CpG岛筛选能产生大量促红细胞生成素的CHO克隆细胞系（促红细胞生成素属于蛋白质药物，被广泛用于治疗肾功能衰竭，以及化疗引起的贫血等）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪的UCOE调控元件片段，能够促进或增强外源基因在宿主细胞稳定高效表达，为解决转基因中出现基因沉默的问题提出了新的办法和解决途径。

本发明所采取的技术方案如下。

一种增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段，长度为957bp，该调控元件片段的碱基序列如序列表所示。

所述UCOE调控元件片段在外源蛋白表达方面的应用，可以增强外源蛋白的表达。

所述增强外源蛋白表达，是通过构建重组质粒表达载体pCpG-Mini-GFP-UCOE，转染HEK293T细胞，增强GFP表达。

本发明以人的1.5kbUCOE片段作为对照，利用酶切方法和RT-PCR方法将猪UCOE片段分割成不同长度的片段，构建不同表达载体，转染HEK293T细胞，通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测报告基因GFP的相对表达量筛选出最佳的能够增强外源基因表达的UCOE片段序列，即本发明所请求保护的基因序列。

本发明将筛选后的猪的957bp UCOE片段插入pCpG-Mini-GFP重组质粒进一步验证UCOE片段功能。而选用该重组质粒进行UCOE功能验证是因为它存在以下一些优势，首先该质粒的真核部分是通过NheI和NcoI双酶切pCpGfree-mcs得到，而且报告基因GFP通过NheI和NcoI插入此真核部分，此部分还包括一个含β-珠蛋白的MAR序列，它能够使得外源基因形成一个独立的染色质环，免受周围异染色质及位置效应的影响，增强外源基因的表达。其次，该质粒的原核部分是在亲本质粒minicircle的attB 位点和 attP 位点设计引物扩增得到的。选用minicircle质粒的原核部分作为改造质粒的一部分的原因是由于亲本质粒minicircle通过ΦC31整合酶与I-SceI限制性内切酶共同作用，在attB 位点和 attP 位点发生重组，可以得到minicircle微环质粒。与常规质粒相比，该微环质粒小且不含细菌的质粒骨架，将其导入宿主细胞中时可以降低免疫应答风险并能消除异染色质使外源基因在体内长期高效表达。上述得到的真核部分和原核部分进行重组得到新型重组质粒pCpG-Mini-GFP，它具有这两部分的所有优点。957bp UCOE片段插入此重组质粒后，通过阿拉伯糖诱导得到微环质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE，转染HEK293T细胞，通过实时荧光定量PCR和Western blot技术分析发现微环质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE的GFP的表达量确实高于对照组 pCpG-Mini-GFP微环质粒。这就进一步验证了筛选后的UCOE片段能增强外源基因的表达。

综上，本发明所提供的猪的UCOE片段具有材料易得、来源广泛的优势，在增强外源基因表达作用方面效果明显，为基因工程的推广应用、研究开发提供了较好的研究基础。

附图说明

图1为猪UCOE调控元件示意图，其中1是位于2个NsiI酶切位点的片段1，长度为4125bp；2是位于2个NotI酶切位点的片段2，长度为1591bp；3是位于NsiI和NotI酶切位点的片段3，长度为1317bp；8是位于NsiI和NotI酶切位点的片段8，长度为1217bp；4是位于2个XbaI酶切位点的片段4，长度为1897bp；9是位于NsiI和XbaI酶切位点的片段9，长度为377bp；10是位于NsiI和XbaI酶切位点的片段10，长度为1851bp；5是位于NsiI和EcoRI酶切位点的片段5，长度为2773bp；13是位于NsiI和EcoRI酶切位点的片段13，长度为1352bp；6是位于NotI和XbaI酶切位点的片段6，长度为957bp；14是位于NotI和XbaI酶切位点的片段14，长度为634bp；11是位于XbaI和EcoRI酶切位点的片段11，长度为499bp；7是位于NotI和EcoRI酶切位点的片段7，长度为1456bp；12是位于NotI和EcoRI酶切位点的片段12，长度为135bp；

图2为猪肝脏组织基因组DNA的电泳图；

图3为pGEM-T-sUCOE质粒的构建，其中A是sUCOE的PCR扩增图，B是pGEM-T-sUCOE质粒经MluI酶切的鉴定图，M是MarkerIV；

图4为p1号质粒的构建，其中A是pGEM-T-sUCOE质粒经NsiI酶切的电泳图，B是pDrive5-GFP-2质粒经NsiI酶切的电泳图，C是p1号质粒经EcoRI酶切的鉴定图；其中M1是MarkerIV，M2是MarkerV；

图5为p2号质粒的构建，其中A是sUCOE经NotI酶切的电泳图，B是pDrive5-GFP-2质粒经NotI酶切的电泳图，C是p2号质粒经PvuII酶切的鉴定图，其中M1是DL5000，M2是MarkerIV；

图6为p3号质粒的构建，其中A是sUCOE3的PCR扩增图，B是sUCOE3经NsiI和NotI双酶切的电泳图，C中1是pDrive5-GFP-2质粒经NsiI和NotI双酶切的电泳图，D中1是p3号质粒经XbaI酶切的鉴定图；M是DL5000；

图7为p4号质粒的构建，其中A中1是pGEM-T-sUCOE质粒经XbaI酶切的电泳图，A中2是pDrive5-GFP-2质粒经XbaI酶切的电泳图，B是p4号质粒经NotI酶切的鉴定，M是DL5000；

图8为p5号质粒的构建，其中A中1是sUCOE经NsiI和EcoRI双酶切的电泳图，A中2是pDrive5-GFP-2质粒经NsiI和EcoRI双酶切的电泳图，B中1是p5号质粒经XbaI酶切的鉴定图；M是DL5000；

图9为p6号质粒的构建，其中A中1是sUCOE经XbaI酶切的电泳图，A中2是pDrive5-GFP-2质粒经NotI和XbaI双酶切的电泳图，B中1是p6号质粒经PvuII酶切的鉴定图；M是DL5000；

图10为p7号质粒的构建，其中A中1是sUCOE经EcoRI酶切的电泳图，A中2是pDrive5-GFP-2质粒经NotI和EcoRI双酶切的电泳图，B中1是p7号质粒经PvuII酶切的鉴定图；M是DL5000；

图11为p8号质粒的构建，其中A是sUCOE8的PCR扩增图，B中1是sUCOE8经NsiI和NotI双酶切的电泳图，C中1是p8号质粒经SmaI酶切的鉴定图；M是DL5000；

图12为p9号质粒的构建，其中A是sUCOE9的PCR扩增图，B是pDrive5-GFP-2质粒经EcoRI酶切的电泳图，C是p9号质粒经HindIII酶切的鉴定图；M是DL5000；

图13为p10号质粒的构建，其中A是sUCOE10的PCR扩增图，B是p10号质粒经SmaI酶切的鉴定；M是DL5000；

图14为p11号质粒的构建，其中A是sUCOE11的PCR扩增图，B中1是sUCOE11经XbaI和EcoRI双酶切的电泳图，B中2是pDrive5-GFP-2质粒经XbaI和EcoRI双酶切的电泳图，C是p11号质粒经XbaI和EcoRI双酶切的鉴定图；M是DL5000；

图15为p12号质粒的构建，其中A是sUCOE12的PCR扩增图，B是sUCOE12经EcoRI和NotI双酶切的电泳图，C是pDrive5-GFP-2质粒经EcoRI和NotI双酶切的电泳图，D中1是p12号质粒经EcoRI和NotI双酶切的鉴定图；M是DL5000；

图16为p13号质粒的构建，其中A是sUCOE13的PCR扩增图，B是p13号质粒经SmaI酶切的鉴定；M是DL5000；

图17为p14号质粒的构建，其中A中1是sUCOE经NotI和XbaI双酶切的电泳图，A中2是pDrive5-GFP-2质粒经NotI和XbaI双酶切的电泳图，B中1是p14号质粒经EcoRI酶切的鉴定图；M是DL5000；

图18为猪的14个重组质粒转染HEK293T细胞后GFP基因的相对mRNA表达水平图；

图19为Western blot结果图：猪的14个重组质粒转染HEK293T细胞后GFP基因的相对蛋白表达；

图20为pCpG-Mini-GFP-UCOE质粒的构建，其中A是sUCOE6的PCR扩增图，B是pCpG-Mini-GFP质粒经SdaI酶切的电泳图，C是pCpG-Mini-GFP-UCOE质粒经PstI酶切的鉴定图；M1是DL2000，M2是MarkerV，M3是DL5000；

图21为微环质粒pCpG-Mini-GFP和pCpG-Mini-GFP-UCOE的酶切鉴定图，其中A中1是pCpG-Mini-GFP微环质粒经BglII酶切的鉴定图，A中2是pCpG-Mini-GFP亲本质粒经BglII酶切的鉴定图，B中1是pCpG-Mini-GFP-UCOE微环质粒经BglII酶切的鉴定图，B中2是pCpG-Mini-GFP-UCOE亲本质粒经BglII酶切的鉴定图；M是MarkerV；

图22为微环质粒pCpG-Mini-GFP和pCpG-Mini-GFP-UCOE转染HEK293T细胞中GFP基因的相对mRNA表达水平图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

介绍具体实施例前，对实施例中所涉及的主要仪器设备、实验试剂等简介如下，未涉及内容以本领域常规所使用或购买的仪器设备、实验试剂为准。

序列样品来源：猪的UCOE序列提取自品种为杜长大三元猪的肝脏组织，取得肝脏组织后液氮速冻后存于-80℃备用。

菌株和质粒

pMD19-T载体(货号6013)购自大连宝生物工程有限公司（Takara）；pGEM-T easy载体（货号A1360）购自Promega公司；Thrans110(北京全式金)；pDrive5-GFP-2质粒(Invivogen)。

主要仪器设备

恒温孵育器，Eppendorf，Germany；

自动高压灭菌锅，SANYO，Japan；

温度梯度PCR分析仪，Biometra，Germany；                                  

JY600C电泳仪与JY-SCZ-2电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；

凝胶成像分析系统，UVP，Germany；

微量紫外分光光度计，Thermo NANODROP 1000；

HH-S2数显电热恒温水浴锅，金怡；

LRH-150 B生化培养箱，广东省医疗器械厂；

申能博彩高精度数控摇床，上海堪鑫仪器设备有限公司；

VD-850型桌上式样洁净工作台，苏州净化；

台式小型离心机5424 R，Eppendorf,Germany；

微量取样器，Eppendorf，Germany；

倒置生物显微镜，Feoca；

CO₂培养箱，SANYO，Japan；

荧光倒置显微镜，DB。

主要试剂

DNase购自Promega公司；

蛋白酶K购于Sigma公司；

酚·氯仿·异丙醇购于Solarbio公司；

LA Taq（货号RR02AG）、DNA切胶回收试剂盒（货号SK8132）、Trizol（货号9108Q）、PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kit试剂盒（货号6210A）、EcoRI（货号1040A）、NotI（货号1166A）、PvuII(货号1243A)、Hind III（货号1060A）、PstI（货号1073A）、SmaI（货号1085A）、NheI、NcoI、PacI、SacI、DL2000、 DL5000、DL15000 、MluI（货号1071A）、、SYRB Mix（货号RR420Q）、BglII（货号1021A）均购自Takara公司；

限制性内切酶NsiI、SdaI、XbaI；T4 DNA连接酶为NEB公司产品；

质粒小量提取试剂盒购自AXYGEN公司；

非酶连接试剂盒(ExnaseTM II，货号C112-01)，Vazyme公司；

动物组织基因组提取试剂盒（货号 F0626）、MarkerV、MarkerIV购自莱枫生物；

PBS溶液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号BCA01)、2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液购自鼎国；

蛋白质标准Marker购自Fermentas公司；

HRP标记的羊抗兔的二抗购自Santa Cruz生物技术有限公司；

GFP抗体购自Abbkine；

ECL Plus发光试剂盒购自GE Healthcare公司；

脂质体转染试剂Tubofect购自Thermo公司；

90% 高糖型DMEM 培养基（货号11995）、10%胎牛血清（货号10099-141）、胰蛋白酶购于GIBCO公司。

实施例1

本发明所提供的可增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段，其碱基序列如序列表所示。下面对其筛选过程简要介绍如下。

图1为本发明的猪的完整的UCOE调控元件示意图，他是以人的UCOE（hUCOE）序列为基础比对得到的。本发明所请求保护的猪的UCOE调控元件片段是通过对猪的完整的UCOE调控元件采用不同酶切组合筛选得到的，具体筛选过程如下。

（1）猪的UCOE片段的克隆及重组质粒构建

①猪基因组DNA的提取

采用动物组织基因组提取试剂盒提取猪肝脏组织基因组DNA，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的提取质量，-20°C保存备用。DNA的电泳图如图2所示。

②引物设计与合成

利用Primer5.0软件设计目的片段引物，根据不同酶切组合设计sUCOE（猪UCOE）引物序列如下表所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

③pGEM-T-sUCOE质粒的构建

以步骤①中提取的猪基因组DNA作模板，以步骤②中设计的sUCOE-1F和sUCOE-1R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE。

PCR扩增体系如下：

                   sUCOE-1F（20μmol/L)，0.5μL；

              sUCOE-1R（20μmol/L)，0.5μL；

              LA Taq，0.5μL；

              2×GCBuffer，25μL；

             dNTP Mixture，8μL；

            步骤①中genomicDNA，100ng；

            ddH₂O补足至50μL。

反应条件：95 °C预变性5min，95 °C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸4min30s，35个循环，最后72°C延伸10min。

扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测，PCR扩增结果如图3（A）所示。使用DNA切胶回收试剂盒纯化回收。

切胶回收的目的片段与载体pGEM-T easy vector进行连接，连接体系如下：

2×Rapid ligation Buffer，5μL；

T4 DNA ligase，1μL；

pGEM-T easy vector，1μL；

sUCOE，3μL；

16 °C连接过夜。

将连接产物转化，挑取白色单克隆菌落，提取质粒，使用MluI限制性内切酶对重组质粒进行单酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3（B）所示。将鉴定正确的质粒命名为pGEM-T-sUCOE。

酶切鉴定体系如下：

 MluI，1μL；

10×H Buffer，2μL；

pGEM-T-sUCOE，200ng；

ddH₂O 补足至20μL。

④构建包含不同sUCOE片段的重组质粒

p1号质粒的构建

使用NsiI限制性内切酶分别对pGEM-T-sUCOE和pDrive5-GFP-2进行单酶切，酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳（结果见图4（A）、图4（B）），切胶纯化，回收目的片段，再对pDrive5-GFP-2去磷酸化，回收后的pGEM-T-sUCOE与去磷酸化的pDrive5-GFP-2连接构建p1号重组质粒。将连接产物转化、EcoRI酶切鉴定（结果见图4（C）），鉴定正确的质粒命名为p1号质粒。

号质粒的构建

NotI限制性内切酶分别对pGEM-T-sUCOE和pDrive5-GFP-2进行单酶切，酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳（电泳图结果见图5（A）、图5（B）），切胶纯化，回收目的片段，再对pDrive5-GFP-2去磷酸化，回收后的pGEM-T-sUCOE与去磷酸化的pDrive5-GFP-2连接构建p2号重组质粒。将连接产物转化、PvuII酶切鉴定（酶切鉴定结果见图5（C）），鉴定正确的质粒命名为p2号质粒。

号质粒的构建

以pGEM-T-sUCOE作模板，步骤①中设计的sUCOE-3F和sUCOE-3R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE3序列。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增后电泳结果参加图6（A）），凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物。回收产物即sUCOE3先用NsiI进行单酶切，然后酶切产物使用平衡酚（酚·氯仿·异戊醇（25:24:1））抽提纯化，纯化后再使用NotI进行单酶切（电泳结果见图6（B））。用NsiI和NotI对 pDrive5-GFP-2进行双酶切（电泳结果见图6（C））。将sUCOE3和pDrive5-GFP-2各自的双酶切产物分别纯化回收，连接构建p3号重组质粒。XbaI鉴定重组质粒（鉴定结果见图6（D）），鉴定正确的质粒命名为p3号质粒。

号质粒的构建

XbaI限制性内切酶分别对pGEM-T-sUCOE和pDrive5-GFP2进行单酶切（电泳结果见图7（A）），纯化回收目的片段，再对载体pDrive5-GFP-2去磷酸化，回收后的pGEM-T-sUCOE与去磷酸化的pDrive5-GFP-2连接构建p4号重组质粒。用限制性内切酶NotI鉴定重组质粒（鉴定结果见图7（B）），鉴定正确的质粒命名为p4号质粒。

号质粒的构建

使用NsiI与EcoRI限制性内切酶分别对步骤③中PCR扩增纯化后的sUCOE PCR产物以及pDrive5-GFP-2进行双酶切（酶切后电泳结果参见图8（A）），纯化回收目的片段，然后连接构建p5号重组质粒。用限制性内切酶XbaI鉴定重组质粒（酶切鉴定结果参加图8（B）），鉴定正确的质粒命名为p5号质粒。

号质粒的构建

p6号质粒构建过程中所采用的猪的UCOE片段即本发明所请求保护的基因序列。

分别使用NotI与XbaI限制性内切酶对步骤③中PCR扩增纯化后的sUCOE PCR产物以及pDrive5-GFP-2进行双酶切（酶切后电泳结果见图9（A）），纯化回收目的片段，构建p6号重组质粒。用限制性内切酶PvuII鉴定重组质粒（酶切鉴定结果见图9（B）），鉴定正确的质粒命名为p6号质粒。

具体步骤如下：

先用NotI内切酶分别对步骤③中PCR扩增纯化后的sUCOE产物及pDrive5-GFP-2载体DNA进行单酶切。

NotI内切酶酶切体系如下：

NotI，1μL；

10×H Buffer，2μL；

0.1%BSA，2μL；

0.1%Tritonx-100，2μL；

sUCOE/ pDrive5-GFP-2，1μg/2μg；

ddH₂O补足至20μL；

37°C酶切2h。

酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化、回收目的片段。

再使用XbaI限制性内切酶分别对回收的目的片段进行单酶切。

酶切体系：

XbaI，0.5μL；

Cutsmart，2μL；

    回收产物，1-2μg；

    ddH₂O补足至20μL。

酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收目的片段。

将回收的sUCOE产物片段与回收的载体pDrive5-GFP-2片段进行连接构建p6号质粒载体。

连接体系：

回收的sUCOE片段，5.5μL；

    pDrive5-GFP-2，1μL；

    T4 DNA连接酶，1μL；

10×T4 DNA Ligase Buffer，2.5μL；

使用PvuII限制性内切酶对所构建的p6号质粒进行酶切鉴定。

鉴定体系：

PvuII，1μL；

10×M Buffer，2μL；

6号质粒，200ng；

ddH₂O补足至 20μL。

号质粒的构建

NotI与EcoRI限制性内切酶对步骤③中PCR扩增纯化后的sUCOE产物，pDrive-GFP-2用NsiI和NotI进行双酶切（酶切产物电泳结果见图10（A）），纯化回收目的片段，构建p7号重组质粒。PvuII限制性内切酶对构建的p7号重组质粒进行酶切鉴定（酶切鉴定结果见图10（B））。

号质粒的构建

以pGEM-T-sUCOE作模板，步骤①中设计的sUCOE-8F和sUCOE-8R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE8序列，扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增产物电泳结果见图11（A）），凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物。

用NsiI与NotI限制性内切酶对回收的PCR产物双酶切并回收酶切产物，将回收酶切产物与NsiI和NotI 双酶切pDrive5-GFP-2后回收产物连接（相关酶切产物电泳结果见图11（B）），构建p8号重组质粒。用限制性内切酶SmaI鉴定重组质粒（酶切鉴定结果见图11（C）），鉴定正确的质粒命名为p8号质粒。

号质粒的构建

以pGEM-T-sUCOE作模板，步骤①中设计的sUCOE-9F和sUCOE-9R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE9序列。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增产物电泳结果见图12（A）），纯化回收的PCR产物。

EcoRI限制性内切酶对pDrive5-GFP-2载体进行单酶切（酶切产物电泳结果见图12（B）），纯化回收目的片段。

非酶连接试剂盒(ExnaseTM II) 进行连接，构建p9号重组质粒。

限制性内切酶HindIII鉴定重组质粒（酶切鉴定结果见图12（C）），鉴定正确的质粒命名为p9号质粒。

号质粒的构建

以pGEM-T-sUCOE作模板，步骤①中设计的sUCOE-10F和sUCOE-10R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE10序列。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增产物电泳结果见图13（A）），纯化回收的PCR产物。

用EcoRI限制性内切酶对pDrive5-GFP-2载体进行单酶切，纯化回收目的片段。

利用非酶连接试剂盒进行连接，构建p10号重组质粒。

用限制性内切酶SmaI鉴定重组质粒（酶切鉴定结果见图13（B）），鉴定正确的质粒命名为p10号质粒。

号质粒的构建

以pGEM-T-sUCOE作模板，步骤①中设计的sUCOE-11F和sUCOE-11R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE11序列。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增产物电泳结果见图14（A））。纯化回收的PCR产物。

XbaI与EcoRI限制性内切酶分别对纯化回收的PCR产物和pDrive5-GFP-2进行双酶切（酶切产物电泳结果见图14（B）），纯化回收目的片段，连接，构建p11号重组质粒。用限制性内切酶XbaI与EcoRI对重组质粒双酶切鉴定（酶切鉴定结果见图14（C）），鉴定正确的质粒命名为p11号质粒。

号质粒的构建

以pGEM-T-sUCOE作模板，步骤①中设计的sUCOE-12F和sUCOE-12R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE12序列。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增产物电泳结果见图15（A）），纯化回收的PCR产物。

EcoRI与NotI限制性内切酶分别对纯化回收的PCR产物和pDrive5-GFP-2进行双酶切（相关酶切产物电泳结果见图15（B）、图15（C）），纯化回收目的片段，连接，构建p12号重组质粒。限制性内切酶EcoRI与NotI对重组质粒双酶切鉴定（酶切鉴定结果见图15（D）），鉴定正确的质粒命名为p12号质粒。

号质粒的构建

以pGEM-T-sUCOE作模板，步骤①中设计的sUCOE-13F和sUCOE-13R为引物，使用LA Taq扩增sUCOE13序列。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增产物电泳结果见图16（A）），纯化回收的PCR产物。

用EcoRI限制性内切酶对pDrive5-GFP-2载体进行单酶切，纯化回收目的片段。

利用非酶连接试剂盒进行连接，构建p13号重组质粒。

用限制性内切酶SmaI鉴定重组质粒（酶切鉴定结果见图16（B）），鉴定正确的质粒命名为p13号质粒。

号质粒的构建

NotI与XbaI限制性内切酶分别对步骤③中PCR扩增纯化后的sUCOE产物及pDrive-GFP-2进行双酶切（相关酶切产物电泳结果见图17（A）），纯化回收目的片段，连接，构建p14号重组质粒。

限制性内切酶EcoRI鉴定重组质粒（酶切鉴定结果见图17（B）），鉴定正确的质粒命名为p14号质粒。

（2）将步骤（1）中筛选、构建的14个质粒进行细胞转染

细胞培养及转染过程简介如下。

细胞类型：人胚肾上皮细胞（HEK293T），购自上海川翔生物科技有限公司。

细胞培养液成分：90% 高糖型DMEM 培养基，10%胎牛血清，青霉素（100 IU/ml）、链霉素（100mg/ml）。

细胞培养条件：37°C，5%CO₂培养箱中培养。

细胞传代：首先倒掉细胞瓶中培养液，加入10mL PBS溶液清洗后弃去，再加入1mL0.25%胰酶消化2min后，取9mL细胞培养液加入细胞瓶中吹打混匀形成细胞悬浮液后放入CO₂培养箱中。

转染过程：转染前8h将处于对数生长期的HEK293T细胞以10⁵/孔的密度接种于6孔板，待细胞融合度达80%~85%时，按说明书要求使用脂质体转染试剂turbofect进行转染。以GFP2-hUCOE质粒（人的UCOE即hUCOE DNA片段与pDrive5-GFP-2质粒连接构建而成）作为对照组，以构建的猪的14个质粒作为试验组。转染12h后换新鲜的细胞培养液。转染24h后使用PBS清洗一次后收集细胞。

（3）实时荧光定量检测报告基因GFP的mRNA相对表达水平

①HEK293T细胞的总RNA的提取

步骤（2）中HEK293T细胞转染培养24 h后，用PBS液清洗，每孔加入1mL Trizol，静置5min，用枪头反复吹打直至Trizol澄清透亮。加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min。4°C，12000rpm，离心15min出现分层现象。将上清转移到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀5-10次，室温静置10min。4°C，12000rpm，离心10min，弃去上清，加入1mL 75%乙醇，重悬沉淀。4°C，12000rpm，离心5min，弃去上清，加入30μLDEPC水溶解， 用带滤芯的枪头上下吹打20次，58°C孵育10min。

微量分光光度计对提取的RNA进行纯度检验并测量浓度，结果发现提取RNA浓度范围在1000-2000ng/uL范围内，260/280比值平均为1.80，260/230比值平均为2.13，符合试验要求。

②反转录合成cDNA

采用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒把RNA反转录成cDNA。

③引物设计与合成

根据Genbank中人GAPDH基因以及水母GFP基因的mRNA序列，应用EXPRESS 3.0软件设计实时荧光定量PCR引物，引物序列设计如下表所示（设计的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成），然后在NCBI上进行比对，选取特异性较高的引物作为实时荧光定量PCR引物。

④荧光定量PCR

将试验组内不同的cDNA样品分别与引物、SYRB Mix混合后，在荧光定量PCR仪上进行反应。

反应体系为：cDNA 1.25μL，SYRB Mix 5μL，上下游引物各0.5μL。每个样品重复三次。PCR反应参数：95°C预变性2min，95°C变性15s，60°C退火20s，72°C延伸20s，共40个循环。

根据熔解曲线判断产物的特异性。用内参GAPDH的CT值使目标基因GFP的CT值标准化，计算出目标基因GFP的mRNA相对表达丰度。

⑤mRNA相对表达量的计算

以GAPDH看家基因为内参，以GFP2-hUCOE质粒的mRNA表达量作为对照组，通过公式对14个质粒的目的基因mRNA相对表达量进行计算：

Ratio=Etarget△Ct target(control-sample)/GEOMEAN(Ereference△Ct ref(control-sample)，

其中Ratio：mRNA相对表达量；Etarget：目的mRNA扩增效率；Ereference：内参mRNA扩增效率；Ct control：对照组的Ct值；Ct sample：样品组的Ct值。相对表达量数据采用GraphPad Prism6.0统计软件进行整理和统计作图。组间差异采用单因素方差分析F检验。p<0.05为有显著统计学差异，p<0.01表示有极显著统计学差异。

猪的14个重组质粒转染HEK293T细胞后GFP基因的相对mRNA表达水平图结果见图18。从图中可以看出，p6号质粒的GFP的mRNA相对表达丰度最高，是对照组的1.6倍（p<0.05）。

（4）Western blot法检测报告基因GFP的相对表达量

①蛋白提取以及蛋白定量

将步骤（2）中转染24 h后的HEK293T细胞，用PBS液清洗后，每孔加入RIPA（碧云天，含终浓度为2mmol的PMSF）裂解液350uL。冰上裂解30min。4°C，12000g离心30min，取上清至一新的EP管。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品浓度。首先将蛋白标准品按照0，1，2，4，6，8，10μL加入96孔板，三个重复。每个样品取10μL加入96孔板，2~3个重复平行。向样品和标准品孔中加入200μL BCA工作液混匀。37°C，孵育30min，冷却至室温，用酶标仪562nm波长测定样品吸光度。使用CurveExpert制作标准曲线，求出样品浓度。根据上样量的需求，取适量样品加入等体积的2×SDS loading Buffer，混匀，99°C孵育5~10min，迅速将样品插入冰中，冰浴10min。分装，-20°C保存备用。

②电泳

制胶：

根据说明书组装胶板，先配制14%的分离胶。配方为：纯水，1.8mL；1.5M Tris-cl(pH8.8)，2.5mL；10%SDS，0.1mL；50%Glycerol，2mL；40%Arcy:Bis(37.5:1)，3.5mL；                10%APS，80μL；TEMED，15μL。

将上述溶液混匀，向胶板中加入6.5~6.6mL 75%的酒精，覆盖一层，赶走气泡，室温放置30min，待胶凝固后，将酒精倒出，尽量吸干酒精。然后按以下配方配制浓缩胶：                超纯水，3.25mL；0.5M Tris-cl (pH6.8)，1.25mL；10%SDS，0.05mL； 40%Arcy:Bis (37.5:1)，0.375mL；10%APS，50μL；TEMED，10μ。

将浓缩胶迅速加入，插上梳子，避免气泡产生，室温放置1h左右，待胶完全凝固，将制胶板安装到电泳槽中。电泳内外槽中尽量注满1×SDS PAGE电泳缓冲液，垂直拔下梳子。

上样及电泳：

用微量进样器吸取相等蛋白量的样品（约6μg），上样。接通电源，浓缩胶以120V电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶时调电压至180V，直至溴酚蓝指示剂距离胶的底部约0.5-1cm，停止电泳。

转膜：

提前将NC膜与滤纸垫浸泡在新制1×Transfer Buffer中，待充分浸湿，进行转膜。在盛有转膜液的盒子中，按照滤纸-NC膜（天驰）-分离胶-滤纸的顺序固定。放入转膜电泳槽，加入1×Transfer Buffer，注意胶在负极，膜在正极。转膜条件：4°C，100V，70min。

封闭：

转膜结束，取出蛋白印迹膜，用剪刀修剪膜边缘多余部分，再用TBST清洗一次。加入封闭液5%的脱脂奶，封闭1h。

免疫反应：

封闭后加入用封闭液稀释的一抗。GFP一抗（兔源，Abbkine，货号#A02020）稀释度为1:5000，beta-actin一抗（兔源，博奥森，货号bs-0061）稀释度为1:3000，4°C，水平摇床过夜。孵育结束，用TBST充分清洗3次，5min/次。加入HRP标记山羊抗兔的二抗，稀释度为1:3000，室温水平摇床孵育2h。

发光，显影，曝光：

二抗孵育结束后，TBST洗膜3×5mins。在暗室，沥干TBST的蛋白印迹膜，加入适量混合的ECL发光底物，布满整张印迹膜。发光底物作用2min，用吸水纸吸取多余发光底物，将膜快速放入暗盒，放入X光胶片（天驰），曝光30s。然后放入显影液（DG公司），显影1min。在自来水中洗一下，放入定影液（DG公司），定影约2min，直到胶片透明结束，把胶片放入自来水中洗一下。胶片晾干即可。

Western blot结果如图19所示，从图中可以看出，采用兔抗GFP单克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG二抗对表达产物进行鉴定，被检测的泳道在26.4kD 处出现特异性条带，其大小与预期的一致。以兔抗β-actin单克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG二抗对表达产物进行鉴定，被检测的泳道在42kD 处出现特异性条带，其大小与预期的一致。通过Gel-Pro analyzer软件分析，结果认为p6号质粒GFP的相对蛋白表达量最高。

实施例2

为检验实施例1所筛选的猪最佳UCOE片段的技术效果，发明人做了进一步的实验验证，简介如下。

（1）pCpG-Mini-GFP-UCOE质粒的构建

①pCpG-Mini-GFP质粒构建

首先构建pCpG-GFP质粒

使用限制性内切酶NheI和NcoI分别对pDrive5-GFP-2载体与pCpGfree-mcs进行双酶切，酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化、回收目的片段。回收后的两个目的片段进行连接，转化，构建pCpG-GFP质粒。使用限制性内切酶PacI对重组质粒进行单酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为pCpG-GFP。

pDrive5-GFP-2和pCpGfree-mcs的双酶切体系如下：

NheI，1μL；

NcoI，1μL；

NEBuffer 2，4μL；

pDrive5-GFP-2或pCpGfree-mcs，4μg；

ddH₂O补足至40μL。

连接体系如下：

pCpGfree-mcs，1μL；

pDrive5-GFP-2，5.5μL；

T4 DNA连接酶，1μL；

10×T4 DNA Ligase Buffer，2.5μL。

其次PCR扩增Minicircle相关序列

根据Minicircle质粒的attP和attB位点设计Minicircle原核部分的引物，引物序列：

上游F:GCGATATCGAGCTCGCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGG；

下游R:CCTTAATTAAGTCGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCCCTGGCA。

以minicircle质粒为模板，LA Taq进行PCR扩增。

扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化、回收目的片段。

PCR扩增体系为：

上游引物F (20μM/L)，0.5μL；

下游引物R (20μM/L)，0.5μL；

LA Taq，0.5μL；

2xGCBuffer，25μL；

dNTP Mixture，8μL；

minicircle质粒，1-2ng；

ddH₂O补足至 50μL。

最后构建pCpG-Mini-GFP质粒

使用PacI和SacI限制性内切酶分别对质粒pCpG-GFP和PCR扩增回收的目的片段进行双酶切，回收酶切片段并进行连接，转化，构建质粒pCpG-Mini-GFP。使用限制性内切酶EcoRI鉴定重组质粒，鉴定正确的质粒命名为pCpG-Mini-GFP。

pCpG-GFP质粒和PCR扩增回收的目的片段的双酶切体系如下：

PacI，1μL；

SacI，1μL；

NEBuffer 1，4μL；

pCpG-GFP或PCR扩增回收的目的片段，4μg；

ddH₂O 补足至40μL。

连接体系如下：

酶切后的pCpG-GFP，1μL；

酶切后的PCR产物，5.5μL；

T4 DNA连接酶，1μL；

10×T4 DNA Ligase Buffer，2.5μL。

②引物设计

根据Clontech网站在线设计非酶连接引物，

引物的上游序列为，F：AAAGGAATTCCTGCAGGCCGCTAGGGGCGGGGG；

下游序列为，R：CCATTGACTCCTGCAAACCTTCCCCCCGACTAA。

扩增

以实施例1中构建的p6号质粒为模板，使用LA Taq扩增sUCOE6。

PCR反应体系及反应条件如下：

上游引物F (20μM/L)，0.5μL；

下游引物R (20μM/L)，0.5μL；

LA Taq，0.5μL；

2xGCBuffer，25μL；

dNTP Mixture，8μL；

p6号质粒，1-2ng；

ddH₂O补足至50μL。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶检测（PCR扩增sUCOE6序列产物的电泳结果见图20（A）），纯化回收sUCOE6。

③连接，构建重组质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE，酶切鉴定

SdaI限制性内切酶对pCpG-Mini-GFP载体进行单酶切（酶切产物电泳结果如图20（B）所示），纯化回收。

pCpG-Mini-GFP质粒的酶切体系如下：

                 PstI，1μL；

                 10×H Buffer ，2μL；

                 pCpG-Mini-GFP，200ng；

                 ddH₂O补足至20μL。

连接利用非酶连接试剂盒进行连接，酶切鉴定（酶切鉴定结果如图20（C）所示）。

连接体系为：

pCpG-Mini-GFP，1μL；

sUCOE6，5.5μL；

T4 DNA连接酶，1μL；

10×T4 DNA Ligase Buffer，2.5μL。

（2）重组质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE转化、L-arabinosep诱导表达

将步骤（1）中鉴定正确的pCpG-Mini-GFP-UCOE以及pCpG-Mini-GFP质粒分别转化入大肠杆菌ZYCY10P3S2T感受态细胞，涂布于含卡那霉素(浓度50μg/mL)的LB平板上37°C恒温培养12-16h。

挑取单克隆菌落接种于2mL LB（含卡那霉素50μg/mL）试管中，30°C下250rpm水浴振荡1-2h，测其OD值。

按照接种菌液体积=（10^-2×50mLTB）/OD值公式取菌液接种于50mL TB（含卡那霉素50μg/mL）锥形瓶中，30°C下250rpm振荡直至OD值达到4-5，pH大于6.5即可。

将事先混匀的诱导剂混合物（含50mL无抗生素的常温LB培养基、0.2mL 10N NaOH、50μL 20% L-arabinose）加入上述锥形瓶中，30°C下250 rpm振荡5.5h。

亲本质粒pCpG-Mini-GFP及pCpG-Mini-GFP-UCOE经L-arabinose诱导分别得到微环质粒pCpG-Mini-GFP及pCpG-Mini-GFP-UCOE。BglII单酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳检测亲本质粒pCpG-Mini-GFP在6485bp处出现一特异性条带，经诱导而得的微环质粒pCpG-Mini-GFP仅在2441bp处出现一特异性条带（图21A），说明诱导成功。同样对于质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE经BglII单酶切后，在7442bp处出现一特异性条带，经诱导而得的微环质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE仅在3398bp处出现一特异性条带（图21B），说明诱导成功。

（3）实时荧光定量检测报告基因GFP的mRNA相对表达水平

以诱导后的微环质粒pCpG-Mini-GFP作为对照组，微环质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE作为试验组转染293T细胞，处理方法同实施例1中的实时荧光定量PCR程序。

GFP基因的相对mRNA表达水平结果如图22所示。从图中可以看出，微环质粒pCpG-Mini-GFP-UCOE的GFP的相对表达丰度是对照组pCpG-Mini-GFP的2.37倍（p 0.05），此结果表明，sUCOE6片段，即本发明所请求保护的基因序列能够显著增强外源基因的表达。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南农业大学

 

<120>  一种增强外源基因表达的猪的UCOE调控元件片段

 

<130>  none

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  957

<212>  DNA

<213>  Pig UCOE

 

<400>  1

gggccgctag gggcgggggt gagcgcgcgc cccgcggggg ggaggggccg cgcgccgcgc       60

 

tttgcccgcc gggagcccga gcccgagccc gagccgaagg gtgggtgggg gaaggagggg      120

 

gtggtgacac cggcactcac cgttcggggc gtagcggctg gtggtcccca aaggggaggg      180

 

aaagagaggg aggagcgggg actgtgaccg gagtctcctc ggcggaggcg ttcctgcttt      240

 

gcagcagctg cactggcgcc aaaacaggac tccgcccact tcctagtccc tggggttggg      300

 

tgcctccaaa tgctggtggt gggtgtaaaa cttgggtggg aggactcaat taggaactaa      360

 

gagttagatt accctgtcca aagacctcct gaacccgaga ggttgacccc aaaagcgttg      420

 

tccaaggtta ggtaggtgag gcgtgaaatg taacttgttg accacaagtc gcttcgggtg      480

 

tttccggaag aggccgagtc tgtcctcaat tcagggagga ggagggaaag cgctgtagag      540

 

aaggctacaa agattttttt ttttagagac ggggggcggt gggtattggg attatcaaag      600

 

cgttgctcta aggaccacct tccgggttga ggggctggac ctgaaagctg aggattaagc      660

 

tcctccccac agtgttaatt tcaaactgcg cgaccgtttc tcacctgccc tgcgctaaag      720

 

ctgggcgggg ggcggggact ggacttaatt ccgagagaga aatacgcagg gctcgagcct      780

 

tccgcaattc acagagccct tttacgcaag tgacgtcaag caccactgtt ggctgcgagg      840

 

agggaggggc acgtacttgg cgcaaggagg tcgtagagcg ttcccgccat tggcggcggt      900

 

tagggcgttt acgcaacggc ctgacgtagg gcaggacgcg ttagtcgggg ggaaggt         957