溴代去甲斑蝥素单酸甲酯及其合成方法和应用

摘要

本发明公开了一种溴代去甲斑蝥素单酸甲酯，结构式为式I。本发明提供的一种溴代去甲斑蝥素单酸甲酯，即开环的5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯，经活性测试证明其具有很好的抗肝癌效果，可作为一种高效低毒的斑蝥素抗肿瘤药物。本发明的合成工艺选择性好，原料易得，成本低廉，合成路线简单，便于操作实施，并且合成所得产物毒性小，得率高，产物纯度高。因而该工艺具有高效、便捷、低成本的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及溴代去甲斑蝥素单酸甲酯及其合成方法和应用，属于斑蝥素衍生物领域。

背景技术

斑蝥是一种昆虫体，是我国一种民间传统的中药。在斑蝥体内提取出的一种叫做斑蝥素(cantharidin，C₁₀H₁₂O₄)的物质对一些癌症有非常特别的抑制作用，针对腹水肝癌或者是原发性肝癌有特殊的抑制作用，具很高的药用价值。

斑蝥素还可以经过结构的修饰，从而合成得到很多的斑蝥素衍生物，使其毒副作用大大降低，并且还能更好地抑制癌症。比如说去甲基斑蝥素或者羟基斑蝥亚安等具有和斑蝥素类似的抗击癌症的活性，甚至斑蝥素的活性相较而言更低。在科技发展的今天，斑蝥素被广泛认识应用，优化后的斑蝥素类的衍生物不但保持了斑蝥素的抗癌活性而且使其毒性大大降低，开始被科学界所重视并研究，并且进一步成为重要的抗癌药物之一。

因为斑蝥素的毒性比较大，会对临床治疗有一定的副作用。因此当前许多的科学研究都采用去除1，2位甲基的方法合成去甲斑蝥素。又因为去甲斑鳌素是抗癌效果较好的中药，因此可以用于肝癌内注射。并且去甲斑蝥素是我国较早以前就合成的药物之一。

李太华(李太华，两种去甲基斑蝥素衍生物的合成、¹²⁵I标记及其动物体内分布，同位素，1998,11(2)，95-99)第一次通过溴加成方法将溴原子引入去甲斑蝥素并进行酰化衍生。所得衍生物以体外试管法，用MTT法筛选模型检测上述多种衍生物对口腔上皮癌细胞(KB)、结肠直肠细胞(HCT)、肝癌细胞(Bel)三种癌细胞的抑制率和IC50值，结果发现该化合物对癌细胞均有一定的抑制作用，同时在小白鼠的心、肝、肺、肾和脾中均有较高的浓集。

目前已经用于临床治疗的斑蝥素药物中(如斑蝥素钠，去甲斑蝥素钠等)，均以开环的方式存在，从化学结构上看，开环的化合物其相应的溶解度较大，其体内生物利用度也高。因此对斑蝥素的结构进行修饰，寻找高效低毒的斑蝥素抗肿瘤药物，具有重要的工业应用价值和广泛的市场前景。ZL201410163619.4、ZL201410163711.0、ZL201410163705.5等公开了制备去甲基斑蝥素酸盐的方法，现有技术还公开了通过溴加成反应合成5,6-二溴去甲斑蝥素的方法，但尚未有报道合成开环的5,6-二溴去甲斑蝥单酯。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种溴代去甲斑蝥素单酸甲酯及其合成方法和应用，所得到的溴代去甲斑蝥素单酸甲酯具有很好的抗肝癌效果。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

溴代去甲斑蝥素单酸甲酯，即5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯，结构式为式I：

溴代去甲斑蝥素单酸甲酯的合成方法，按照如下合成路线进行：以呋喃为原料，与顺丁烯二酸酐在有机溶剂中反应得到5,6-二氢去甲斑蝥素，5,6-二氢去甲斑蝥素在三氯甲烷中与液溴反应得到5,6-二溴去甲斑蝥素，5,6-二溴去甲斑蝥素与甲醇反应得到5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯I，

前述合成方法，具体包括以下步骤：

(1)取顺丁烯二酸酐，研细，加入有机溶剂溶解，待完全溶解后滴加呋喃，于35℃～45℃反应24h，抽滤，得白色固体产物5,6-二氢去甲斑蝥素，干燥备用；

(2)室温下，取步骤(1)中的白色固体产物，加入三氯甲烷搅拌成悬浮状，随后边搅拌边滴入三氯甲烷与液溴的混合液，再缓慢加入三氯甲烷润洗液，搅拌反应，反应结束后抽滤，用四氯化碳洗涤，得白色固体5,6-二溴去甲斑蝥素，干燥备用；

(3)取5,6-二溴去甲斑蝥素，先加入部分无水甲醇，开始搅拌，再在搅拌下继续缓慢加入无水甲醇，反应5h后抽滤，得白色固体，干燥即得5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯。

前述合成方法，也可以包括以下步骤：

(1)取顺丁烯二酸酐，研细，加入有机溶剂溶解，待完全溶解后滴加呋喃，于35℃～45℃反应24h，抽滤，得白色固体产物5,6-二氢去甲斑蝥素，干燥备用；

(2)室温下，取步骤(1)中的白色固体产物，加入三氯甲烷搅拌成悬浮状，随后边搅拌边滴入三氯甲烷与液溴的混合液，再缓慢加入三氯甲烷润洗液，搅拌反应，反应结束后抽滤， 用四氯化碳洗涤，得白色固体5,6-二溴去甲斑蝥素，干燥备用；

(3)取5,6-二溴去甲斑蝥素，加入无水甲醇、有机碱和有机溶剂，加热回流反应，TLC监测反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，剩余物经柱层析得5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯。

前述合成方法中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃或乙醚。

前述合成方法中，所述步骤(3)中的有机碱为三乙胺或吡啶。

溴代去甲斑蝥素单酸甲酯在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明的有益之处在于：本发明提供的一种溴代去甲斑蝥素单酸甲酯，即开环的5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯，经活性测试证明其具有很好的抗肝癌效果，可作为一种高效低毒的斑蝥素抗肿瘤药物。本发明的合成工艺选择性好，原料易得，成本低廉，合成路线简单，便于操作实施，并且合成所得产物毒性小，得率高，产物纯度高，因而该工艺具有高效、便捷、低成本的特点。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。

本发明中使用的呋喃，顺丁烯二酸酐，液溴均来自上海国药集团。所用溶剂来自遵义双巨化工有限公司。除特别说明外，所用试剂均为化学纯。

实施例1中间体A、即5,6-二氢去甲斑蝥素的制备：反应式如下所示：

从试剂瓶中取出一定量的顺丁烯二酸酐，置于干燥的研体中研细，再用电子天平称取研细的顺丁烯二酸酐12.021g，置于干燥的三口烧瓶中，塞上塞子，再加乙醚搅拌，在乙醚量为90mL时顺丁烯二酸酐完全溶解。待顺丁烯二酸酐完全溶解后，用滴液漏斗缓慢加入13mL呋喃，用时13min。控制温度在38℃开始反应。反应1h后溶液出现白色固体，且时间越长白色固体越多。反应至24h后抽滤，得白色固体中间体A，即5,6-二氢去甲斑蝥素。干燥称重为17.459g，收率85.75％。熔点：122～123℃，Rf：0.52(展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)； ¹HNMR(CDCl₃)δ:3.18(s，2H)，5.47(s，2H)，6.58(s，2H)。

上述实施例1中用于溶解顺丁烯二酸酐的有机溶剂除了乙醚外，还可用N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃中的任一种代替；所述反应温度可在35℃～45℃之间。

实施例2中间体B、即5,6-二溴去甲斑蝥素的制备：反应式如下所示：

称取实施例1中得到的中间体A 5g，置于250mL的两口烧瓶中，加入20mL三氯甲烷在室温下开始搅拌，直至反应体系中反应溶液搅拌成悬浮状。此时在室温搅拌下，用滴液漏斗滴加2.5mL三氯甲烷与0.5mL液溴的混合液，滴加完毕后用2.5mL三氯甲烷润洗滴液漏斗，并将润洗液缓慢加入，加入混合液与润洗液总计用时20min，观察现象。待反应结束后，抽滤，用四氯化碳洗涤三次，得白色固体中间体B，即5,6-二溴去甲斑蝥素。干燥称重为8.330g，收率85.35％。熔点：157～159℃，Rf：0.65(展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)。¹HNMR(DMSO-d6)δ:5.18(d，1H)，4.49-4.54(m，2H)，3.86(s，2H)。

实施例35,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯的制备：反应式如下所示：

称取实施例2中得到的中间体B 0.5g，置于圆底烧瓶中，加入5mL无水甲醇，边加热至45℃边开始搅拌，在搅拌过程中继续缓慢加入无水甲醇5mL。反应开始变浑浊，5h后，抽滤，得白色固体，即5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯。干燥称重为472mg，收率86％。熔点：>240℃。Rf：0.62(展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)。¹HNMR(DMSO-d6)δ:12.61(br，1H)，4.76(d，2H)，4.68(s，2H)，3.51(s，3H)，3.12(s，2H)。

实施例45,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯的制备：反应式如下所示：

称取实施例2中得到的中间体B 0.5g，置于圆底烧瓶中，加入1mL无水甲醇，1mL三乙胺和5mL二氯甲烷，加热回流。TLC(薄层色谱)监控反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，剩余物经柱层析，得到产品，即5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯。干燥称重为460mg，收率82％。熔点：>240℃。Rf：0.62(展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)。 ¹HNMR(DMSO-d6)δ:12.61(br，1H)，4.76(d，2H)，4.68(s，2H)，3.51(s，3H)，3.12(s，2H)。

上述实施例4中所用的有机碱、即三乙胺可用吡啶代替；所用的有机溶剂二氯甲烷可用N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿、乙腈、四氢呋喃、乙醚中的任一种代替。TLC(薄层色谱)还可用气相色谱法或液相色谱法代替。

实验例15,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯的抗肝癌活性测试

磺酰罗丹明(sulforhodamineB，SRB)染色法

接种细胞时，每种细胞平行接种两块96孔板，一块为对照板(T0)，另一块为实验板。CO₂培养箱中培养20h后，将对照板(T0)取出，用50％三氯乙酸(TCA)固定，待测。实验板中加入待测化合物(终浓度分别为5μg·mL^-1、2.5μg·mL^-1、1.25μg·mL^-1、0.625μg·mL^-1、0.313μg·mL^-1)，并设阴性对照组(C)，实验组(T)，溶剂对照组。每组设5个复孔，继续培养48h后取出培养板，以预冷50％TCA固定(终浓度为10％)，于4℃冰箱放置1h后，以去离子水冲洗，自然晾干，用100μL0.4％的SRB染色，10min后用0.1％乙酸冲洗、晾干，最后用200μL10mmol·L^-1的缓冲Tris碱液(pH＝10.5)溶解，在酶标仪上选择530nm处测吸光度值(OD值)，按照下列公式计算生长抑制率(Inhibitionratio，IR)。

本试验按照SRB方法，以斑蟊素、斑蝥素钠为阳性对照，进行了5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯对人肝癌细胞HepG2的抑制活性测试，结果如表1所示：

表1

样品 C(测试浓度) 抑制率(Inhibitionratio) IC50 斑蟊素 14.36μmol/L 72％ 8.07μmol/L 斑蟊素钠 14.36μmol/L 68％ 9.12μmol/L 化合物I 14.36μmol/L 96％ 5.31μmol/L

由表1可知，5,6-二溴去甲斑蝥素单酸甲酯对人肝癌细胞Hep G2具有很好的抑制效果，可将其用于制备抗肝癌的药物。