植物药提取物灯盏花乙素中的相关物质的检测方法

摘要

本发明提供了一种植物药提取物灯盏花乙素中的相关物质及其检测方法，通过该方法可得到准确的检测结果，避免其他杂质干扰，达到事半功倍效果，鉴定结果更客观准确，更精确稳定。

说明书

技术领域

本发明提供了一种植物药提取物灯盏花乙素中的相关物质的检测方法。

背景技术

植物药中往往含有多种化学成分,这些固有的化学成分是植物药发挥药效作 用的物质基础,随着中药现代化、国际化的深入发展,迫切需要建立一种对中药 提取物进行质量控制以及对其复杂成分检出的方法,指纹图谱应运而生。

“指纹”(finger printing)鉴定来源于法医学，每个人的指纹在微小的细节 构造中各有不同。依据这些差异，通过“比对”方式，可以确定鉴别每个人的 特征。随着现代生物技术的发展，出现了DNA指纹图谱。通过DNA指纹图谱 分析，能对人、动物、植物等生物体进行鉴别鉴定。

植物药在质量控制方面使用指纹图谱(尤其是色谱指纹图谱)起源于20世 纪70年代。当前的中药指纹图谱(fringerprinting)借用DNA指纹图谱发展而来， 是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段。最先发展起来的是中药化学成分色谱 指纹图谱，而本领域一般所述的指纹图谱若无特别提示均指的是高效液相色谱 (HPLC)指纹图谱。其是利用HPLC具有的很高的分离度，把复杂的化学成分 进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图，这些色谱峰的高度和峰面积分 别代表了各种不同化学成分和其含量，和药效研究结果联系就会产生中药谱效 学。目前普遍利用的HPLC技术建立指纹图谱所需要的总时间较长,而且分离度 难以达到较理想的状况。

植物药提取物灯盏花素(主要成分为灯盏花乙素)作为药典中的原料药单 独成药，归在2010版药典一部植物油脂和提取物章节。相关物质仅做了有关物 质峰面积的要求，但至今无文献报道相关物质到底是什么物质。而相关物质与 药品的药效及不良反应有密切关系，所以药典标准中化学药品均需要详细分析 有关物质的种类及含量。虽然灯盏花素现在作为中药原料药入药，但其制剂已 经为单一化合物入药，尤其还作为注射剂及冻干粉针，例如灯盏花素片，灯盏 花素注射液，注射用灯盏花素，没有具体的物质指认，因而也就没有相关物质 的含量限度测定，这与国外化学药品中有关物质的清楚辨析及含量限度测定要 求有较大距离。灯盏花乙素的相关物质的指认及检测方法的确定，对于分辨是 否是从灯盏细辛中得到也具有一定意义。现今，灯盏花素的化学合成也有专利 CN101941999B报道，化学合成的灯盏花素与从灯盏细辛草中提取分离的灯盏花 素在有关物质上有着很大区别，因而将其以化学药品原料药评价十分有价值和 深远的意义。

发明内容

针对现有技术在植物药提取成分检测方面存在的缺陷。发明人经过分离纯 化灯盏花素的有关物质及大量的实验，通过测定不同厂家的原料药及灯盏花素 片，得到了本发明的灯盏花乙素中相关物质的检测方法。

本发明目的是提供一种植物药提取物灯盏花乙素的相关物质及其检测方 法，通过该方法可得到准确的检测结果，避免其他杂质干扰，达到事半功倍效 果，鉴定结果更客观准确。

本发明提供一种植物药提取物灯盏花乙素中的相关物质的检测方法，该检 测方法包括：

(1).供试品溶液的制备，取供试品20mg,加入N,N-二甲基甲酰胺5ml溶 解，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品的溶液，所述供试品溶液的浓度为每 ml相当于供试品4mg；

(2).对照品溶液的制备，取6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸 (6-hydroxykaempferol-7-O-B-D-glucuronopyranoside,CAS NO:1258314-70-3)，灯 盏花甲素(Apigenin-7-O-glucronide,CAS NO:29741-09-1)，野黄芩素 (Scutellarein，CAS NO.：529-53-3)，芹菜素(Apigenin，CAS NO:520-36-5) 加N,N-二甲基甲酰胺分别制成每1ml含6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸 0.5mg，灯盏花甲素0.5mg，野黄芩素0.5mg，芹菜素0.5mg的五个对照品溶液；

(3).高效液相的色谱条件，色谱柱为十八烷基硅烷为填料；采用梯度洗脱， 流动相A为甲醇，流动相B为含0.01～1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，流动 相A的浓度递增,流动相B的浓度递减；流速0.1～2.0mL/min；检测波长 270-350nm；

(4)灯盏花乙素有关物质的测定，吸取上述供试品和对照品溶液各10μl,注 入液相色谱测定仪，测定；

(5).结果检测，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、 野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间分别为0.8～0.95、1.2～1.45、 1.55～2.10，2.0～3.0。

上述供试品即“从植物(灯盏细辛)中提取的灯盏花乙素原料药或片剂”， 市售的商品名“灯盏花素原料药”或。“灯盏花素片”本申请将保护主题限定 为“植物药提取物灯盏花乙素中的相关物质”是因为，如果是合成的灯盏花乙 素，相关物质不是本申请检测的这些成分。

在上述检测方法中，所述高效液相的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷 为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.05～0.5％的磷酸水 溶液；梯度洗脱程序，流动性A的浓度从30％-65％,流动相B的浓度从70％-35％； 流速0.5～1.5mL/min；检测波长320-340nm；柱温20-40。℃

在本发明优选实施例中，检测步骤如上(1)-(5)所述，其中，高效液相 的色谱条件为：色谱柱十八烷基硅烷为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲醇， 流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流动性A,70％ 流动相B；40分钟时，55％流动性A,45％流动相B；50分钟时，65％流动性A, 35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃；检测得到的图谱 中的相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、野黄芩素，芹菜 素，其与灯盏花乙素的平均相对保留时间分别为0.90、1.32、1.64、2.35。

上述检测方法中得到的图谱为图1所示图谱。

在本发明的另一优选实施例中，检测步骤如上(1)-(5)所述，其中，高 效液相的色谱条件为：色谱柱十八烷基硅烷为填料；采用梯度洗脱，流动相A 为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流 动性A,70％流动相B；50分钟时，50％流动性A,50％流动相B；60分钟时，65％ 流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃；进样 量：10ul；检测得到的图谱中的相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、 灯盏甲素、野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的平均相对保留时间分别为0.88、 1.37、1.75、2.53。

上述检测方法中得到的图谱为图2所示图谱。

在本发明的又一优选实施例中，检测步骤如上(1)-(5)所述，其中，高 效液相的色谱条件为：色谱柱十八烷基硅烷为填料；采用梯度洗脱，流动相A 为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流 动性A,70％流动相B；30分钟时，50％流动性A,50％流动相B；40分钟时，65％ 流动性A,35％流动相B；45分钟时，65％流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min； 检测波长335nm；柱温30℃；进样量：10ul；检测得到的图谱中的相关物质为 6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花 乙素的相对保留时间分别为0.90、1.31、1.82、1.61，2.14。

上述检测方法中得到的图谱为图3所示图谱。

本发明提供一种灯盏花乙素中相关物质的检测方法，该检测方法包括以下 步骤：

(1).供试品溶液的制备，取供试品20mg,加入N,N-二甲基甲酰胺5ml溶 解，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品的溶液，所述供试品溶液的浓度为每 ml相当于供试品4mg制成供试品的溶液，-

(2).取6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素，芹菜 素，加N,N-二甲基甲酰胺分别制成每1ml含6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸 0.5mg，灯盏花甲素0.5mg，野黄芩素0.5mg,芹菜素0.5mg的四个对照品溶液。

(3).高效液相的色谱条件，色谱柱为十八烷基硅烷为填料；采用梯度洗脱， 流动相A为甲醇，流动相B为含0.01～1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，流动 性A的浓度递增,流动相B的浓度递减；流速0.1～2.0mL/min；检测波长270-340 nm；

方法一：流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程 序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；40分钟时，55％流动性A,45％流 动相B；50分钟时，65％流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长 335nm；柱温30℃。得到的图谱如图1所示，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β- 葡萄糖醛酸、灯盏甲素、野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间 分别为0.90、1.32、1.64、2.35。

方法二：流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程 序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；50分钟时，50％流动性A,50％流 动相B；60分钟时，65％流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长 335nm；柱温30℃。进样量：10ul；得到的图谱如图2所示，相关物质为6-羟基 山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的 平均相对保留时间分别为0.88、1.37、1.75、2.53。

方法三：流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程 序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；30分钟时，50％流动性A,50％流 动相B；40分钟时，65％流动性A,35％流动相B；45分钟时，65％流动性A,35％ 流动相B。流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。进样量：10ul；得到 的图谱如图3所示，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、 野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间分别为0.90、1.31、1.82、 1.61，2.14。

从峰的分离度以及快捷来说，方法三为最优选方法，方法二次之，方法一中 灯盏花乙素的峰干扰灯盏花甲素，使灯盏花甲素的峰对称性不好，在两者之间 的小峰未得到充分分离。因而方法三优于方法二，方法二优于方法一。

(4).测定：吸取供试品和对照品溶液各10μl,注入液相色谱测定仪，测定；

(5).结果检测，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、 野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间在方法一中分别为0.90、 1.32、1.64、2.35。方法二中分别为0.88、1.37、1.75、2.53，方法三中分别为0.90、 1.31、1.82、1.61，2.14。

由本发明的上述检测方法可知，本发明所指认的四个杂质峰占了灯盏花素原 料药中相对面积的2.6-6.4％，灯盏花素片中2.4-14.7％(方法一)；四个杂质峰占 了灯盏花素原料药中相对面积的2.4-5.3％，灯盏花素片中2.1-13.5％(方法二)； 四个杂质峰占了灯盏花素原料药中相对面积的2.5-5.2％，灯盏花素片中 2.3-13.5％(方法三)；此四个杂质峰为灯盏花素原料及片剂中主要杂质成分。在 这四个峰中，杂质峰1和杂质峰2为所有测的7家原料药厂提供的原料药和11 家药企提供的片剂中均含有。杂质峰1在原料药中的相对峰面积为1.2-4.1％，片 剂中的相对峰面积为0.9-5.4％(方法一)；杂质峰1在原料药中的相对峰面积为 1.1-3.2％，片剂中的相对峰面积为0.7-4.9％(方法二)；杂质峰1在原料药中的 相对峰面积为1.1-3.2％，片剂中的相对峰面积为0.8-5.0％(方法三)。杂质峰2 在原料药中的相对峰面积为0.8-2.3％，片剂中的相对峰面积为1.2％-6.9％(方法 一)；杂质峰2在原料药中的相对峰面积为0.9-2.2％，片剂中的相对峰面积为 1.0％-6.7％(方法二)；杂质峰2在原料药中的相对峰面积为0.9-2.2％，片剂中的 相对峰面积为1.1％-6.9％(方法三)。杂质峰3在原料药中的相对峰面积为0-1.1％， 片剂中的相对峰面积为0.2％-1.9％(方法一)；杂质峰3在原料药中的相对峰面 积为0.1-0.9％，片剂中的相对峰面积为0.2％-1.4％(方法二)；杂质峰3在原料 药中的相对峰面积为0.1-1.0％，片剂中的相对峰面积为0.2％-1.5％(方法三)。 杂质峰4在原料药中几乎看不到，片剂中的相对峰面积为0％-0.53％(方法一)； 杂质峰4在原料药中几乎看不到，片剂中的相对峰面积为0.03％-0.5％(方法二)。 杂质峰4在原料药中几乎看不到，片剂中的相对峰面积为0.07％-0.5％(方法三)。 因此，如果原料药或者片剂中有此四个峰中的一个(峰3除外)或多个峰存在， 尤其是峰1和峰2存在，基本能肯定是从灯盏细辛草中获得的原料，而非合成 原料。而杂质峰3由于是灯盏花乙素的葡萄糖醛酸脱葡萄糖醛酸后的产物，在 分离纯化过程中有酸或强碱存在时灯盏花乙素都容易降解成为野黄芩素。因而 单独存在不能说明是否是合成品或植物提取品。

(6)用高效液相色谱法对比灯盏细辛地上部分水提液与四个相关物质，发 现四个相关物质为灯盏细辛地上部分固有物质，而非降解产物或化学反应产物。

在本发明的检测方法中，高效液相的色谱条件优选，色谱柱为十八烷基硅 烷为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.05～0.5％的磷酸 水溶液；梯度洗脱程序，流动性A的浓度从30％-65％,流动相B的浓度从 70％-35％；流速0.5～1.5mL/min；检测波长333-337nm；柱温20-40。℃

在本发明的优选实施例中，上述高效液相的色谱条件优选，色谱柱为十八烷 基硅烷为填料；250mm，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％ 的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；40分 钟时，55％流动性A,45％流动相B；50分钟时，65％流动性A,35％流动相B； 流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。得到的图谱如图1所示，相关物 质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、野黄芩素，芹菜素，其与灯 盏花乙素的相对保留时间分别为0.90、1.32、1.64、2.35。

本发明另一优选实施例中，上述高效液相的色谱条件，色谱柱为十八烷基硅 烷为填料，250mm,采用梯度洗脱方法：流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％ 的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；50分 钟时，50％流动性A,50％流动相B；60分钟时，65％流动性A,35％流动相B； 流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。进样量：10ul；得到的图谱如图 2所示，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸、灯盏甲素、野黄芩素， 芹菜素，其与灯盏花乙素的平均相对保留时间分别为0.88、1.37、1.75、2.53。

在本发明另一优选实施例中，上述高效液相的色谱条件，色谱柱为十八烷基 硅烷为填料，250mm,采用梯度洗脱方法：流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％ 的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；30分 钟时，50％流动性A,50％流动相B；40分钟时，65％流动性A,35％流动相B； 45分钟时，65％流动性A,35％流动相B。流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱 温30℃。进样量：10ul；得到的图谱如图3所示，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β- 葡萄糖醛酸、灯盏甲素、野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间 分别为0.90、1.31、1.82、1.61，2.14。

灯盏花乙素的相关物质的指认及检测方法的确定，对于分辨是否是从灯盏 细辛草中得到也具有一定意义：因为现在灯盏花乙素也有合成品，并且野黄芩 苷也存在于别的植物中[例如唇形科植物高黄芩(Scutellaria altissima L.)的叶，黄 芩[S.baicalensis Georgi]的茎、叶以及半枝莲(S.Barbara D.Don)全草等]。而不 同的相关物质对于制剂的质量也有相当影响。其中指认的6-羟基山奈素 -7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸为从灯盏细辛植物中首次分离，以往仅从矢车菊属 (Centaurea)的两个种里面分离得到过。

灯盏花乙素的相关物质的分离方法为将灯盏花乙素原料中相关物质通过制 备型高效液相富集,分离得到纯品后,用各种波谱学方法鉴定化合物的结构。然 后将得到的相关物质与灯盏花乙素原料进行高效液相比对保留时间及DAD图谱, 最后添加少量纯化合物到灯盏花乙素原料溶液中进行高效液相比对。只有当保 留时间重合,DAD图谱峰纯度达到90％以上,才确定此化合物为相关物质。

本发明的贡献在于：用高效液相的方法，指认了从灯盏细辛里分离纯化的灯 盏花素的有关物质，并且用高效液相的方法将有关物质进行定量检测，为植物 药提取物中相关物质的指纹图谱分析提供新的思路，尤其是植物提取物以单一 成分入药的物质。从而为研究与杂质有关的不良反应奠定了物质基础。

分析检测方法的建立和影响因素的考察。

1.色谱柱及色谱洗脱溶剂的选择

色谱的洗脱溶剂选择的原则一般要结合三个指标，极性参数，检测化 合物的偶极矩以及溶解度参数等。在分离灯盏花素的有关物质时，考虑到 灯盏花素的有关物质大多为黄酮类的酚性成分，偏酸性，因而选择中性及 偏酸性的色谱柱，和(或者)在洗脱剂中加入磷酸或者有机酸(例如甲酸 或者乙酸)，对峰型的对称性及分离度有较好的表现。故选择十八烷基硅烷 为填料，甲醇，乙腈，水加酸一种，两种或者三种溶剂作为洗脱剂进行分离。

2.检测波长的选择：上述色谱条件下，在200～400nm范围内对供试 品溶液进行光谱扫描，根据样品3D色谱图，以选取能给出最多色谱峰信 息的检测波长。而经试验发现单一波长下难于保留该复方的色谱指纹图谱 所有主要指纹峰。在330～350nm处色谱峰信息多、较为集中，基线比较平稳， 且此波长下图谱保留了所预期的主要指纹峰。故最优选取335nm波长作为检测 波长，也可以选择330-340nm的波长作为检测波长。

3方法学考察：

3.1精密度实验：连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间稳定，以及各 共有峰相对峰面积的RSD小于3％。符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要 求(暂行)》中精密度试验的有关规定。

3.2重复性试验：各共有峰相对保留时间稳定，各共有峰相对峰面积的RSD 小于3％，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中重复性试验 的有关规定。

3.3稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，20，24h进 样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积。供试品在24h内稳定。

本发明的突出的实质性特点在于通过高效液相色谱的检测方法将从植物来 源提取分离出来的灯盏花乙素的有关物质进行定性定量测定，从而使得有关物 质得到明确的指认以及定量测定，为以灯盏花素为原料药的制剂的安全性，稳 定性，一致性提供坚实的物质基础。并且证明了四个有关物质是灯盏细辛植物 中固有物质，而非在提取纯化时变异而来的物质。同时此检验方法能够达到一 测多评的效果，能够在同一液相条件下高效地定性定量检测出四个灯盏花乙素 的相关物质，此方法所得到的结果更精确，稳定，具有较好的一致性。此发明 的意义还在于将中药中以单一成分入药的原料药及各种剂型制剂以国际上化学 药品的质量标准看齐，为中药的质量标准发展奠定了物质基础。

附图说明

图1为方法一测定的灯盏花素及有关物质高效液相图谱；

其中，流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程 序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；40分钟时，55％流动性A,45％流 动相B；50分钟时，65％流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长 335nm；柱温30℃，进样量：10ul。

图2为方法二测定的灯盏花素及有关物质高效液相图谱；

其中，流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序， 0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；50分钟时，50％流动性A,50％流动相 B；60分钟时，65％流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长335nm； 柱温30℃。进样量：10ul。

图3为方法三测定的灯盏花素及有关物质高效液相图谱；

其中流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序， 0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；30分钟时，50％流动性A,50％流动相 B；40分钟时，65％流动性A,35％流动相B；45分钟时，65％流动性A,35％流 动相B；流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃；进样量：10ul。

图1-3中，横坐标均为保留时间(min)，纵坐标均为信号强度(mAU)；

其中，1号峰是6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸；2号峰是灯盏甲素；3号 峰是野黄芩素；4号峰是芹菜素。

具体实施方式

以下结合附图和实施例详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。

实施例一.四种有关物质的分离鉴定：

取7家提供的灯盏花素原料药及11家提供的灯盏花素片进行高效液相色谱 检测，选取有关物质含量较高的原料药进行有关物质的分离，鉴定。取20g灯 盏花素原料药，用DMF溶解，用高效制备液相色谱分离，色谱柱为岛津Hedera  ODS-P 30×250mm,50ml/min,检测波长335nm。以26％甲醇-0.05％甲酸水溶液为 洗脱剂，根据紫外分别接收四个有关物质。分离得到化合物1，2，3,4。分别将 化合物1，2，3及4做核磁共振图谱及高分辨质谱。化合物1，2，3及4经过 图谱分析鉴定为：6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素， 芹菜素。

灯盏花素原料药有关物质的测定方法：精密称取20mg灯盏花素原料药，加 入N,N-二甲基甲酰胺5ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品的溶液， 所述供试品溶液的浓度为每ml相当于供试品4mg制成供试品的溶液。取6-羟 基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素，芹菜素，加N,N-二甲基 甲酰胺分别制成每1ml含6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸0.5mg，灯盏花甲素 0.5mg，野黄芩素0.5mg，芹菜素0.5mg的四个对照品溶液，将供试品及4个对 照品分别注入高效液相色谱仪。色谱柱为十八烷基硅烷为填料；250mm；流动 相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％ 流动性A,70％流动相B；40分钟时，55％流动性A,45％流动相B；50分钟时， 65％流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。对 比对照品与供试品的保留时间及DAD色谱图，当对照品的DAD与供试品中峰 的保留时间及DAD图谱一致时，确定供试品中化合物种类并标记。

供试品高效液相图谱如图1所示，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖 醛酸、灯盏甲素、野黄芩素、芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间分别为 0.90、1.32、1.64、2.35。所指认的四个杂质峰占了灯盏花素原料药中相对面积 的2.6-6.4％，灯盏花素片中2.4-14.7％，杂质峰1和杂质峰2为所有测的7家原 料药厂提供的原料药和11家药企提供的片剂中均含有。杂质峰1在原料药中的 相对峰面积为1.2-4.1％，片剂中的相对峰面积为0.9-5.4％；杂质峰2在原料药中 的相对峰面积为0.8-2.3％，片剂中的相对峰面积为1.2％-6.9％；杂质峰3在原料 药中的相对峰面积为0-1.1％，片剂中的相对峰面积为0.2％-1.9％；杂质峰4在原 料药中几乎看不到，片剂中的相对峰面积为0％-0.53％。

实施例二.四种有关物质的分离鉴定：

取7家提供的灯盏花素原料药及11家提供的灯盏花素片进行高效液相色谱 检测，选取有关物质含量较高的原料药进行有关物质的分离，鉴定。取20g灯 盏花素原料药，用DMF溶解，用高效制备液相色谱分离，色谱柱为岛津Hedera  ODS-P 30×250mm,50ml/min,检测波长335nm。以12％乙腈-0.05％甲酸水溶液为 洗脱剂，根据紫外分别接收四个有关物质。分离得到化合物1，2，3,4。分别将 化合物1，2，3及4做核磁共振图谱及高分辨质谱。化合物1，2，3及4经过 图谱分析鉴定为：6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素， 芹菜素。

灯盏花素原料药有关物质的测定方法：精密称取20mg灯盏花素原料药，加 入N,N-二甲基甲酰胺5ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品的溶液， 所述供试品溶液的浓度为每ml相当于供试品4mg制成供试品的溶液。取6-羟基 山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素，芹菜素，加N,N-二甲基甲 酰胺分别制成每1ml含6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸0.5mg，灯盏花甲素 0.5mg，野黄芩素0.5mg，芹菜素0.5mg的四个对照品溶液，将供试品及4个对 照品分别注入高效液相色谱仪。色谱柱为十八烷基硅烷为填料；250mm；流动相 A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流 动性A,70％流动相B；50分钟时，50％流动性A,50％流动相B；60分钟时，65％ 流动性A,35％流动相B；流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。进样 量：10ul；对比对照品与供试品的保留时间及DAD色谱图，当对照品的DAD与 供试品中峰的保留时间及DAD图谱一致时，确定供试品中化合物种类并标记。

供试品高效液相图谱如图2所示，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖 醛酸、灯盏甲素、野黄芩素、芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间分别为 0.88、1.37、1.75、2.53。本发明所指认的四个杂质峰占了灯盏花素原料药中相 对面积的2.4-5.3％，灯盏花素片中2.1-13.5％；此四个杂质峰为灯盏花素原料及 片剂中主要杂质成分。在这四个峰中，杂质峰1和杂质峰2为所有测的7家原 料药厂提供的原料药和11家药企提供的片剂中均含有。杂质峰1在原料药中的 相对峰面积为1.1-3.2％，片剂中的相对峰面积为0.7-4.9％；杂质峰2在原料药中 的相对峰面积为0.9-2.2％，片剂中的相对峰面积为1.0％-6.7％；杂质峰3在原料 药中的相对峰面积为0.1-0.9％，片剂中的相对峰面积为0.2％-1.4％；杂质峰4在 原料药中几乎看不到，片剂中的相对峰面积为0.03％-0.5％。

实施例三.四种有关物质的分离鉴定：

取7家提供的灯盏花素原料药及11家提供的灯盏花素片进行高效液相色谱 检测，选取有关物质含量较高的原料药进行有关物质的分离，鉴定。取20g灯 盏花素原料药，用DMF溶解，用高效制备液相色谱分离，色谱柱为岛津Hedera  ODS-P 30×250mm,50ml/min,检测波长335nm。以26％甲醇-0.05％甲酸水溶液为 洗脱剂，根据紫外分别接收四个有关物质。再经过半制备高效液相色谱纯化， 分离得到化合物1，2，3,4。分别将化合物1，2，3及4做核磁共振图谱及高分 辨质谱。化合物1，2，3及4经过图谱分析鉴定为：6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄 糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素，芹菜素。

灯盏花素原料药有关物质的测定方法：精密称取20mg灯盏花素原料药，加 入N,N-二甲基甲酰胺5ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品的溶液， 所述供试品溶液的浓度为每ml相当于供试品4mg制成供试品的溶液。取6-羟基 山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素，芹菜素，加N,N-二甲基甲 酰胺分别制成每1ml含6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸0.5mg，灯盏花甲素 0.5mg，野黄芩素0.5mg，芹菜素0.5mg的四个对照品溶液，将供试品及4个对 照品分别注入高效液相色谱仪。色谱柱为十八烷基硅烷为填料；250mm；

流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序，0分 钟时，30％流动性A,70％流动相B；30分钟时，50％流动性A,50％流动相B； 40分钟时，65％流动性A,35％流动相B；45分钟时，65％流动性A,35％流动相 B。流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。进样量：10ul；对比对照品 与供试品的保留时间及DAD色谱图，当对照品的DAD与供试品中峰的保留时间 及DAD图谱一致时，确定供试品中化合物种类并标记。

供试品高效液相图谱如图3所示，相关物质为6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖 醛酸、灯盏甲素、野黄芩素，芹菜素，其与灯盏花乙素的相对保留时间分别为 0.90、1.31、1.82、1.61，2.14。所指认的四个杂质峰占了灯盏花素原料药中相对 面积的2.5-5.2％，灯盏花素片中2.3-13.5％；此四个杂质峰为灯盏花素原料及片 剂中主要杂质成分。在这四个峰中，杂质峰1和杂质峰2为所有测的7家原料 药厂提供的原料药和11家药企提供的片剂中均含有。杂质峰1在原料药中的相 对峰面积为1.1-3.2％，片剂中的相对峰面积为0.8-5.0％；杂质峰2在原料药中的 相对峰面积为0.9-2.2％，片剂中的相对峰面积为1.1％-6.9％；杂质峰3在原料药 中的相对峰面积为0.1-1.0％，片剂中的相对峰面积为0.2％-1.5％；杂质峰4在原 料药中几乎看不到，片剂中的相对峰面积为0.07％-0.5％。

将灯盏细辛地上部分用纯水加热回流半小时，取水提液过滤，取续滤液配 成供试品，取6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸，灯盏花甲素，野黄芩素，芹菜 素，加N,N-二甲基甲酰胺分别制成每1ml含6-羟基山奈素-7-O-β-葡萄糖醛酸 0.5mg，灯盏花甲素0.5mg，野黄芩素0.5mg，芹菜素0.5mg的四个对照品溶液， 将供试品及4个对照品分别注入高效液相色谱仪注入高效液相色谱仪，色谱柱 为十八烷基硅烷为填料；250mm，流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％的磷酸水 溶液；梯度洗脱程序，0分钟时，30％流动性A,70％流动相B；30分钟时，50％ 流动性A,50％流动相B；40分钟时，65％流动性A,35％流动相B；45分钟时， 65％流动性A,35％流动相B。流速1.0mL/min；检测波长335nm；柱温30℃。进 样量：100ul。对比对照品与供试品的保留时间及DAD色谱图，当对照品的DAD 与供试品中峰的保留时间及DAD图谱一致时，确定供试品中化合物种类并标记。 发现四个供试品为灯盏细辛地上部分固有的，而非提取纯化过程中转变而得。