一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方法

摘要

本发明公开了一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方法，该方法色谱条件：C18或C8反相色谱柱，柱温：37℃，检测波长248nm，流速0.8ml/min梯度洗脱，流动相A为5.0mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟乙酸水溶液，流动相B为60%乙腈水溶液，洗脱液流速为0min100%A，0.5min98.5%A,10min90%A,15min67%A,20min20%A,25min0%A；对照品溶液及供试品溶液的配制；精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入反相液相色谱仪，进行反相液相色谱测定分析。该测定方法操作简单快速，无需衍生剂，且稳定性强、重现性好，能更好地对地龙注射液的有效成分及质量进行控制的反相高效液相色谱测定方法。

说明书

技术领域

本发明涉及仪器分析技术领域，具体涉及一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方法。 

背景技术

地龙注射液，平喘止咳。用于支气管哮喘所致的咳嗽、喘息。 

早期对于地龙注射液含量测定由3部分组成，分别为氮测定法测总氮量、滴定法测氨基氮及薄层色谱法测缬氨酸含量，但该测定方法专属性不强、且重现性不高，无法对地龙注射液的有效成分及质量进行控制。 

黄璐敏在《中国药师》2010年第13卷第11期的“HPLC法测定地龙注射液中主要氨基酸的含量”公开了一种建立测定地龙注射液中主要氨基酸含量的方法，该方法以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生剂，与地龙注射液中的游离氨基酸柱前定量颜色，用HPLC法测定衍生物含量。虽然丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸在各自浓度范围内线性关系良好，平均回收率102.6~104.9%，RSD 0.3~0.9%，但其需要使用到衍生剂进行衍生测定，操作复杂。 

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种操作简单快速，无需衍生剂，且其稳定性强、重现性好，能更好地对地龙注射液的有效成分及质量进行控制的反相高效液相色谱测定方法。 

本发明提供了一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC（反相高效液相色谱法）测定方法，包含如下步骤： 

S1、色谱条件：C18或C8反相色谱柱，柱温：37℃，检测波长248nm，流速0.8ml/min梯度洗脱，流动相A为5.0mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟乙酸水溶液，流动相B为60%乙腈水溶液，洗脱液流速为0min 100%A，0.5min 98.5%A, 10min 90%A,15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A；

S2、对照品溶液的配制：精密称取丙氨酸对照品90.79mg、缬氨酸对照品39.94mg、盐酸赖氨酸对照品32.53mg、异亮氨酸对照品30.87mg、亮氨酸对照品60.28mg，另取酪氨酸1.3g，加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，用水定容于容量瓶，得对照品溶液；

S3、供试品溶液的配制：取地龙注射液五支，混匀，用水定容于容量瓶，得供试品溶液；

S4、测定：精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入反相液相色谱仪，进行反相液相色谱测定分析。

优选地，步骤S2具体包括：精密称取105℃干燥3h的丙氨酸对照品90.79mg、缬氨酸对照品39.94mg、盐酸赖氨酸对照品32.53mg、异亮氨酸对照品30.87mg、亮氨酸对照品60.28mg，另取酪氨酸1.3g，置于同一100ml量瓶中加少量0.1mol/L盐酸溶液溶解，加水稀释至刻度，且再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。 

更优选地，步骤S3具体包括：取地龙注射液五支，混匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。 

与现有技术相比，本发明的有益效果如下： 

（1）操作分析步骤简单快速，无需采用衍生剂进行衍生，减少试剂的使用，有利于环保节约；

（2）专属性强，地龙注射液广地龙阴性制剂色谱在相应氨基酸对照品色谱相应位置上无干扰；

（3）回收率高，加入氨基酸母液，丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的平均回收率分别为106.7%，105.0%，108.7%，104.6%，105.4%；

（4）重复性高、精密度好，对同一批号地龙注射液制备6份供试品溶液测定，其RSD均小于1.5%，对同一批号地龙注射液连续5次测定，其RSD均小于0.7%。

具体实施方式

下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。 

仪器与试药 

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2489UV/Visible检测器，Empowe 3工作站；瑞士METTLER AE-240电子天平。色谱柱：Waters Symmetry C18或C8反相色谱柱，5μm，4.6×150mm（优选C18反相色谱柱：No：WAT045905，No：WAT054448）

试药：地龙注射液（博罗先锋药业有限公司生产批号060501等20批）；地龙注射液广地龙阴性制剂（自制）；丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸对照品（中国药品生物制品检定所，624-200104）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

实施例1 地龙注射液氨基酸含量测定 

测定地龙注射液中五种氨基酸的含量，五种氨基酸分别为丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸。

测定步骤为： 

S1、色谱条件：C18反相色谱柱，柱温：37℃，检测波长248nm，流速0.8ml/min梯度洗脱，流动相A为5.0mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟乙酸水溶液，流动相B为60%乙腈水溶液，洗脱液流速为0min 100%A，0.5min 98.5%A, 10min 90%A,15min 67%A, 20min 20%A, 25min 0%A；

S2、对照品溶液的配制：精密称取105℃干燥3h的丙氨酸对照品90.79mg、缬氨酸对照品39.94mg、盐酸赖氨酸对照品32.53mg、异亮氨酸对照品30.87mg、亮氨酸对照品60.28mg，另取酪氨酸1.3g，置于同一100ml量瓶中加少量0.1mol/L盐酸溶液溶解，加水稀释至刻度，且再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；

S3、供试品溶液的配制：取地龙注射液五支，混匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

S4、测定：精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入反相液相色谱仪，进行反相液相色谱测定分析。

取批号060501等20批进行地龙注射液中五种氨基酸含量的测定，测定结果见表1。 

表1 地龙注射液的五种氨基酸含量测定结果 

结果：20批地龙注射液中丙氨酸的平均含量为1.5415mg，缬氨酸的平均含量为0.991mg，盐酸赖氨酸的平均含量为0.551mg，异亮氨酸的平均含量为0.7615mg，亮氨酸的平均含量为1.6345mg。

实施例2 线性关系考察 

取上述对照品溶液，分别精密量取1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、 10.0μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积积分值，以对照品浓度为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，并以峰面积积分值Y对对照品浓度（进样量）X进行线性回归计算，其中丙氨酸回归方程为y=2921.3x-16.4，r=0.99978（n=7）、缬氨酸回归方程y=2598x+1.94，r=0.99998（n=7）、盐酸赖氨酸回归方程y=2743.6x+0.87，r=0.99997（n=7）、异亮氨酸回归方程y=2391.8x+1.6，r=0.99998（n=7）、亮氨酸回归方程y=2406x-3.6，r=0.99997（n=7）。结果表明丙氨酸在0.045395~0.453950μg范围内，缬氨酸在0.01997~0.1997μg范围内，盐酸赖氨酸在0.016265~0.16265μg范围内，异亮氨酸在0.015435~0.15435μg范围内，亮氨酸在0.03014~0.3014μg范围内均具有良好的线性关系，结果见表2。

表2 氨基酸线性关系结果考察表 

实施例3 重复性试验

取同一批号的地龙注射液（批号060703）依法制备6份供试品溶液，精密量取5.0μl进样测定，结果如表3所示，丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸含量的RSD分别为0.92%、0.73%、0.97%、0.75%、0.89%。

表3 重复性试验结果 

实施例4 精密度试验

精密量取同一批号的地龙注射液（批号060703）5μl，连续进样5次，测定各氨基酸含量，其RSD为0.47~0.68%，结果见表4。

表4精密度试验结果 

实施例5 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8小时进样5μl，测定其峰面积稳定，结果见表5。

表5 供试品溶液稳定性试验结果（n=4） 

实施例6 耐用性试验

另取两根色谱柱Waters Symmetry C18反相色谱柱（No：WAT045905，No：WAT054448）按相同条件测定同一批号（060703），结果见表6。

表6耐用性试验结果 

实施例7 准确度试验

回收用氨基酸母液的配制：精密称取105℃干燥3h的丙氨酸对照品16.51mg、缬氨酸对照品11.41mg、盐酸赖氨酸对照品9.38mg、异亮氨酸对照品9.40mg、亮氨酸对照品17.51mg，分别置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得回收用氨基酸母液。

回收供试品溶液的配制：精密量取地龙注射液（批号060703）样品6份，分别至100ml量瓶中，每份均精密加入上述回收用氨基酸母液（详见表7）加水稀释至刻度，摇匀，即得回收供试品溶液。 

按上述色谱条件进行氨基酸含量测定，并按以下计算公式计算回收率，结果见表8。 

计算公式：

表7回收供试品溶液的制备

 表8回收率试验测定结果

结果：丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的平均回收率分别是106.7%、105.0%、108.7%、104.6%、105.4%；及RSD分别是0.3%、0.4%、0.4%、0.2%、0.4%；则五种氨基酸含量之和平均回收率为106.08%。RSD为0.34%，本测定方法回收率较好。

以上对本发明实施例所提供的一种同时测定地龙注射剂中五种氨基酸含量的PR-HPLC测定方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。