一种通过未受精胚珠培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法

摘要

本发明涉及一种通过未受精胚珠离体培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法，其方法包括如下步骤：取黄瓜雌花开花前的完整子房接种在以MS培养基为基础添加TDZ的预培养培养基上进行初步诱导；初步诱导后将完整子房沿中心线纵切，剥离未受精胚珠接种在含有KT和BA的IM3诱导培养基上；待胚状体分化出子叶和胚根后，转入MS培养基中继续生长、发育，获得完整的再生植株；采用根尖细胞染色体计数和流式细胞仪鉴定其倍性，成功获得单倍体和二倍体植株。本发明不仅奠定了黄瓜单倍体育种的研究基础，更为杂交选育、分子标记、遗传图谱构建和基因定位提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及黄瓜的组织培养和植株再生方法。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国重要的保护地蔬菜作物，随着栽培面积逐年扩大， 市场对黄瓜品种抗病性、耐逆性、产量和商品性的要求也日渐提高，但常规育种技术对黄 瓜品质和抗病性选择效率不高，选育一个新品种一般需要6-8年时间。单倍体培养为缩短 育种年限、提高育种效率提供了可能。由于获得的单倍体植株常常发生染色体自身加倍的 现象进而形成双单倍体(DH)植株，因此不存在等位基因位点的显隐性作用，使隐性基 因控制的性状也能获得充分体现，极大降低了筛选育种材料时的误选概率。利用单倍体诱 导技术还能迅速获得个体完全纯合同质的DH群体，为遗传分析、分子标记和数量性状研 究提供理想材料。虽然单倍体在育种和分子生物学基础研究及应用上都具有重要意义，但 黄瓜自发产生单倍体的概率极低(Savin et al.,1988)，不能满足科研工作需要，所以研究 者们往往通过雄核和雌核发育两个途径诱导单倍体发生，获得DH材料。

在瓜类作物上，国内外学者多利用辐射花粉处理、延迟授粉和添加激素等方法诱导单 倍体的发生进而获得DH材料，尽管有个别成功的报道，但胚发生频率仍然极低，且重复 性差。在南瓜的雌核发育研究中就曾发现，尽管未授粉子房可以诱导发生胚状体，但其在 分化过程中畸形率较高，不容易获得完整再生植株(孙守如等，2009)。目前，在黄瓜上 多通过离体或活体雌核发育途径进行诱导，且采用的均是未授粉子房离体培养以及辐射花 粉授粉诱导的孤雌生殖，但再生效果也都不甚理想，且在人工诱导过程中存在较严重的发 育障碍。

Gémes-Juhúsz(2002)首次通过雌核发育途径获得黄瓜单倍体植株，但胚诱导再生频 率较低，方法繁琐，且没有报道植株再生频率和再生植株的倍性情况。魏爱民等(2007) 研究了栽培方式和栽培季节对黄瓜未受精子房发育的影响，并证明保护地种植的供体材料 单倍体发生率和成苗率均明显高于露地。杜胜利等(2001,2003)通过对黄瓜离体雌核发 育过程的研究发现，外植体中的多种酶活性在诱导前期便产生了明显变化，同时进行解剖 学观察，显示雌核发育已启动。此外，陈小鹏(2005)、王璐(2008)、刁卫平(2008)、 王烨(2008)、裴晓利(2011a,2011b)和Li(2013)等还对基因型、培养基添加物、预 处理等影响黄瓜单倍体发育的诱导条件和技术环节进行了研究和优化。但目前黄瓜雌核发 育诱导植株再生研究仍然存在较多不足：首先，试验材料均为华北密刺类型和欧洲温室类 型黄瓜的常规种和自交系，而对育种研究极为重要的欧亚杂交类型黄瓜尚未见到任何相关 研究报道，因此给单倍体育种在黄瓜上的应用带来较大的局限性；其次，目前国内外黄瓜 雌核发育相关研究虽然开展的较多，但均以未授粉子房为外植体，如前所述，胚在发育过 程中容易受到子房壁组织等对其发育的影响，因此畸形率较高且不易获得完整再生植株； 最后，由于当前的雌核发育多经过的是愈伤途径，少有直接成苗的胚状体途径，因此极易 出现再生植株染色体倍性混杂等问题。而雌核发育的最终目的是获得纯合的双单倍体材 料，倍性混杂的材料无法应用于育种和研究，因此也限制了单倍体研究的发展。至今尚未 见到以欧亚杂交类型黄瓜为材料通过诱导未受精胚珠雌核发育获得胚状体和再生植株的 研究报道。

参考文献

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发明内容

针对现有技术的不足，创新的通过对欧亚杂交类型黄瓜未受精胚珠进行离体培养， 通过对培养基成分和相关技术环节的研究，经雌核发育诱导植株成功再生。

本发明提供的技术方案是：一种通过未受精胚珠离体培养诱导雌核发育获得黄瓜再 生植株的方法，其包括如下步骤：

1、取黄瓜开花前雌花的完整子房接种在以MS培养基为基础添加TDZ的预培养培 养基上进行初步诱导；

2、初步诱导完成后，取出完整子房并沿中心线纵切，剥离未受精胚珠接种在含有 KT和BA的IM3诱导培养基上，其中添加0.5-1.0mg·L^-1的KT和1.0-4.0mg·L^-1的BA； 优选为在培养基中添加0.75mg·L^-1的KT和2.0mg·L^-1的BA；

3、待胚状体分化出子叶和胚根后，转入MS培养基中继续生长、发育，获得完整的 再生植株；

4、采用根尖细胞染色体计数和流式细胞仪鉴定再生植株的倍性。

优选地，所述开花前的雌花是开花前的1-2天，预培养为7天。

进一步地，所述添加TDZ的预培养培养基中添加TDZ浓度为0.01-0.1mg·L^-1，优选 为0.01-0.05mg·L^-1，更优选为0.02mg·L^-1，培养基pH为5.8至6.0，优选为5.8。

其中，初步诱导阶段，进一步包括同时2-8℃，优选4℃的低温预处理。

所述诱导培养基为IM3，pH 5.5到5.7，优选为5.6，其成分如下：

上述诱导培养基上的培养条件为25±2℃，LD16:8。

优选地，所述继代生长的培养基pH为5.8至6.0，优选为5.8。

优选地，上述所有培养基中，蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.5g·L^-1。

所述黄瓜为欧亚杂交类型黄瓜。

本发明首次通过欧亚杂交类型黄瓜的未受精胚珠进行离体雌核发育诱导，并成功获得 单倍体和二倍体再生植株。由于以往的黄瓜离体雌核发育研究集中在华北密刺类型和欧洲 温室类型黄瓜材料上，因此这些方法在应用上也存在较大的局限性，应用范围相对狭窄， 本发明打破了黄瓜雌核发育研究在基因型上的限制，成功获得了欧亚杂交类型黄瓜的再生 植株，为单倍体应用和研究提供了更为宽广的发展空间。其次，以往的研究都是通过未授 粉子房开展的雌核诱导，幼胚常常受到子房壁组织等影响而妨碍其正常发育，使得再生植 株畸形率较高且成苗率低。而本发明是以胚珠为诱导对象，在胚珠剥离前先对整个子房进 行预培养，使胚珠由活体状态缓和过渡到半离体状态，同时利用添加TDZ的培养基进行 初步诱导来激发胚珠中的雌核离体发育，初步诱导后再从子房中剥离胚珠，彻底转为离体 培养。这种逐步过渡的胚珠培养方式不仅有助于雌核启动发育机制同时逐步适应离体状态 的营养条件和激素水平，还摆脱了子房壁对其发育的影响和束缚。剥离后的胚珠虽然处于 裸露状态，对外界培养条件要求也更严格，却能够更直接地接触到培养基中的营养成分和 激素，且不易受到子房其他组织对其发育的阻碍。此外，现有的黄瓜雌核发育研究多是通 过愈伤组织再分化途径获得再生植株的，在愈伤组织诱导成苗过程中，染色体倍性混杂的 问题较为普遍，而本发明中胚状体发生过程并未经过愈伤组织。形态学观察中发现，利用 黄瓜未受精胚珠进行诱导是通过胚状体途径直接形成的再生植株，经历了类似合子胚的发 育阶段。这样既能有效地避免脱分化和再分化过程中引起的染色体倍性混杂问题，又保持 了材料的遗传稳定性，再生植株中的二倍体率达到了81.8％。综上所述，本发明利用黄瓜 胚珠离体培养诱导雌核发育，胚诱导频率最高可达35.3％，植株再生频率为23.3％，是一 种更为高效的黄瓜雌核发育途径。

在黄瓜胚珠离体培养过程中，培养基对雌核发育至关重要，其影响涉及培养基中大量 元素、微量元素、有机成分、碳源和外源激素的种类和含量等因素，目前对植物未受精子 房进行培养的常用培养基有N6、B5、NB、Miller、White、MS、CBM和H等。培养基 中的大量元素之一氮素作为蛋白质的主要成分，是植物生长过程中的必需元素，其中铵态 氮可直接与光合作用产物有机酸结合形成氨基酸，而硝态氮则需要还原为铵态氮后才能为 植物体所利用。对基本诱导培养基成分进行改良研究时发现，硝态氮(NO^3-)和铵态氮(NH⁴⁺) 含量较接近的IM3和IM4中未受精胚珠的胚发生率较高，但随着硝态氮(NO^3-)和铵态氮 (NH⁴⁺)浓度差逐步增大，胚发生率呈现下降趋势，说明无机氮的存在形式、浓度和比例在 黄瓜雌核诱导和发育过程中发挥着重要的调节作用，这一现象在以往的研究中未见报道。

总之，本发明通过未受精胚珠诱导雌核发育，并成功获得了黄瓜再生植株，不仅奠定 了黄瓜雌核发育的研究基础，拓宽了单倍体育种研究的应用范围，更为杂交选育、分子标 记、遗传图谱构建和基因定位提供了技术支撑。

附图说明

图1黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生，其中，a：未受精子房的预培养；b： 培养7d后的未受精子房；c：剥离的胚珠；d：胚珠上形成突起，发育为球形胚；e：心形 胚；f：幼胚；g：发育出子叶和胚根的胚；h：单倍体再生植株；i：移植田间。

图2TDZ浓度、预处理温度、诱导培养基、KT和BA浓度对黄瓜雌核发育成胚率的影响， 其中，a：TDZ浓度对出胚率的影响；b：预处理温度对出胚率的影响；c:诱导培养基对出 胚率的影响；d：KT浓度对出胚率的影响；e：BA浓度对出胚率的影响。

图3黄瓜单倍体和二倍体植株的根尖细胞染色体倍性鉴定和DNA含量分布图，其中，a： 单倍体植株(源于65G×228)的根尖染色体(n＝7)；b:单倍体；c:二倍体对照的根尖 染色体(2n＝14)；d：二倍体

具体实施方式

材料与方法

1.1试验材料

本研究采用的试验材料是以欧洲温室类型黄瓜65G为母本、华北密刺类型黄瓜228 为父本配制的F1代，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组提供。

1.2诱导培养

选取开花前1—2d的雌花，流水清洗并去除子房表面的刺瘤，在超净工作台上用75％ 乙醇消毒30s，然后在6.5％的次氯酸钠溶液中消毒15min，无菌水反复冲洗4—5次，用 无菌滤纸吸干表面水分，不对子房进行切割，将完整子房接种在以Murashige and Skoog’s 培养基(Murashige T.and Skoog F.，1962)为基础添加TDZ的预培养培养基上进行初步 诱导，其中蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.5g·L^-1，pH5.8。

在添加TDZ的预培养培养基上诱导7d后，取出完整子房并沿中心线纵切，剥离胚珠 和胎座组织接种在含有KT和BA的诱导培养基上，培养条件为25±2℃，LD16:8。所有 诱导培养基均添加30g·L^-1蔗糖和2.5g·L^-1植物凝胶，pH为5.6，置于高压灭菌锅中121℃ 灭菌20min，用10mm培养皿分装培养基，Parafilm石蜡膜封口，每皿接种外植体4—5 个。

胚诱导全过程采用6因素5水平的L25(5⁶)正交试验设计(表1)，对包括预培养培养 基中的TDZ浓度、预处理温度、诱导培养基(包括大量元素、微量元素和有机物成份， 配方见表2)、诱导培养基中的KT浓度和BA浓度在内的五个因素进行研究，设一列空 白作为误差项，共25个处理，每个处理三次重复。

胚发生频率＝有胚状体发生的外植体数/外植体总数×100％

试验数据采用Excel和SAS软件进行统计分析。

表1 L25(56)正交试验设计

表2 诱导培养基配方

1.3植株再生

待胚状体分化出子叶和胚根后，转入MS培养基(30g·L^-1蔗糖和2.5g·L^-1植物凝胶， pH为5.8)中继续生长、发育，获得完整的再生植株。

1.4倍性鉴定

染色体计数法：取2—3mm的再生植株幼嫩根尖进行染色体计数。经卡诺固定液处 理过夜后，切取根尖部分，用卡宝染液染色，覆上盖玻片，然后用镊子轻轻敲片，以便根 尖组织散开，即可在显微镜下观察。选取染色体分散较好的体细胞进行拍照，统计染色体 数

流式细胞仪测定法：取少量新鲜叶片，置于冰浴的培养皿中，加入细胞裂解液，并用 解剖刀将材料切碎。将样品提取液通过微孔膜过滤而后离心到测试管中，上样于流式细胞 仪测定植株细胞DNA的相对含量。

1.5田间性状调查

瓜长：当果实长度达到正常商品瓜大小时，测量从瓜蒂至瓜顶的长度，单位(cm)。

瓜横径：当果实长度达到正常商品瓜大小时，测量距离瓜顶约1/3瓜长处的横径， 单位(mm)。

雌花率：当植株长到25节后，调查主蔓上每一个节位的花性，计算有雌花发生的节 位占总节位数的比例。

2结果与分析

2.1黄瓜离体胚珠雌核发育的形态学观察及再生植株的获得

完整的黄瓜子房(图1，a)在添加TDZ的预培养培养基上经过7d的初步诱导，外观 形态上没有明显变化，但颜色由绿色转为黄色(图1，b)。将子房纵切后剥离胚珠接种在 添加KT和BA的诱导培养基中，此时的胚珠为圆形、乳白色(图1，c)。培养约一周后， 便可观察到浅绿色胚珠上出现突起(图1，d)。经过约20d的诱导培养，球形胚发育为 心形胚(图1，e)。40-45d后即可获得较完整的幼胚(图1，f)，并逐步发育出子叶和 胚根(图1，g)。将幼胚转移到MS培养基中继续生长，可形成正常的叶片和根系(图1， h)。再生植株在7d左右的短期驯化后移植田间(图1，i)。

2.2胚诱导正交试验的直观分析

将胚珠接种于诱导培养基中60d后，胚的诱导和分化基本完成。此时调查各组试验有 胚状体发生的子房数，统计胚诱导率(表3)，其中处理6的胚诱导率最高，达到了35.3％， 而植株再生频率为23.3％。

表3 不同处理因素对黄瓜未受精胚珠诱导胚状体的影响

其中，预处理过程即把完整子房连同培养瓶一起放到冰箱或恒温箱中黑暗培养，温度 就是设置好的预处理温度。

利用Excel软件对65G×228未受精胚珠的胚发生率数据进行直观分析(表4)，五因 素对胚发生的诱导效应表现为TDZ＞KT＞诱导培养基＞预处理温度＞BA。预培养培养基 中TDZ浓度的极差最大，达到16.92，是影响胚发生的最主要因素；其次，诱导培养基和 KT浓度对试验结果也有显著地影响，两个因素的极差分别达到9.9和10.12；诱导培养基 中的BA浓度的极差仅为3.26，对胚状体发生率影响最小。

表4 65G×228胚诱导正交试验的直观分析

为各水平的平均值；R为极差。

根据直观分析结果，TDZ的第2水平最好，预处理温度的第1水平最好，诱导培养 基配方的第3水平最好，KT的第3水平最好，BA的第4水平最好。可初步选择有利于 提高胚发生频率的因素水平搭配，即65G×228的子房外植体首先利用TDZ浓度为0.02 mg·L^-1预培养培养基进行初步诱导，同时4℃低温预处理，而后将未受精胚珠接种在IM3 诱导培养基上，培养基中添加0.75mg·L^-1的KT和2.0mg·L^-1的BA。

2.3胚诱导正交试验的方差分析

为了准确判断五因素对胚发生率的影响程度，通过SAS软件对65×228雌核胚发生率 的数据进行方差分析，各因素对成胚率的影响程度依次为TDZ浓度、诱导培养基、KT 浓度、预处理温度。由于BA的均方较误差项小，故修正误差为17.381，整理为方差分析 表5。数据结果表明，TDZ浓度对胚发生率的影响已达到极显著水平，是影响胚状体发生 的主要因素；诱导培养基和KT浓度可显著提高65G×228的胚发生率；而预处理温度和 BA浓度的F值较小，对试验结果影响不显著。方差分析结果和极差分析结果一致，TDZ 浓度是影响黄瓜未授粉胚珠雌核发育的最主要因素。

表5 65G×228不定胚诱导正交试验的方差分析

*、**分别表示达到5％、1％水平显著性差异。

2.4五因素各水平对胚发生率的影响趋势

由图2a可见，在预培养培养基中的TDZ浓度从0增加到0.02mg·L^-1后，胚发生率由 8.72％提高到25.64％，但随着TDZ浓度的继续增长，胚发生率却呈现下降趋势。预处理 温度在4℃时65G×228的胚发生率最高，达到了19.54％，随后处理温度越高胚发生频率 反而越低，35℃预处理后胚发生率再次升高，但仍未超过4℃预处理水平(图2b)。IM3 作为诱导培养基时的胚状体诱导率最高，其次是IM4，而后是IM2和IM5，IM1的胚发 生率最低(图2c)。本次正交试验中，诱导培养基添加0.75mg·L^-1的KT可使胚发生率提 高到19.7％，1.0mg·L^-1KT的诱导率降低到18.32％，不添加KT的诱导培养基中胚状体 发生率仅9.58％(图2d)。在BA的浓度由0提高到4.0mg·L^-1的过程中，胚发生频率先 降低后升高，浓度为1.0mg·L^-1时达到峰值19.1％，而后再次下降(图2e)。

2.5预培养培养及TDZ浓度对胚状体发生的影响

直观分析和方差分析均证明预培养培养基中的TDZ浓度是影响黄瓜雌核发育的最主 要因素，利用邓肯新复极差法对TDZ浓度的5个水平进行多重比较(表6)。将开花前 1～2d的黄瓜子房消毒后完整接种在TDZ含量为0.02mg·L^-1的诱导培养基中，胚状体的诱 导率最高，与其他浓度相比达到极显著水平。0.05mg·L^-1TDZ的诱导效果次之，且胚发生 率与0.10mg·L^-1TDZ之间没有显著差异，但畸形胚率有显著提高。经0.50mg·L^-1TDZ诱 导后，胚发生率较0.02、0.05和0.10mg·L^-1处理有显著降低，与不添加TDZ的诱导处理 间差异不显著。

表6 TDZ浓度5水平的邓肯新复极差法多重比较

小写字母表示p＜0.05水平，大写字母表示p＜0.01水平，不同字母代表 显著差异。

2.6诱导培养基中无机氮形式及含量对胚状体发生的影响

对诱导培养基五个水平的试验数据进行邓肯新复极差法分析(表7)，诱导培养基IM3 的胚发生率最高，IM4的结果略低于IM3，但并无显著差异，两个培养基中的硝态氮(NO^3-) 和铵态氮(NH⁴⁺)的含量分别为600mg·L^-1/500mg·L^-1和300mg·L^-1/400mg·L^-1，比例均较接近 1:1。当IM2和IM5中硝态氮和铵态氮的含量比例增大到4:1和5:1时，IM2的胚发生率 较IM3和IM4有所降低，但未达显著水平，而IM5则出现了显著降低。诱导频率最低的 是IM1，两种无机氮化合物的含量比达到7.5:1，与IM2、IM3和IM4间的差异均达到了 极显著水平。由此可见，在黄瓜雌核诱导和发育过程中，无机氮的存在形式、浓度和比例 都发挥着重要的调节作用。

表7 培养基成份5水平的邓肯新复极差法多重比较

小写字母表示p＜0.05水平，大写字母表示p＜0.01水平，不同字母代表显著差 异。

2.7再生植株倍性鉴定

将幼胚转移到MS培养基上可诱导生根，生根率均达100％。以正常二倍体(2n＝14) 黄瓜(图3c)为对照，对再生植株进行根尖细胞染色体数分析，发现了体细胞含有7条 染色体的单倍体植株(图3a)。同时以正常黄瓜二倍体植株叶片为对照，利用流式细胞仪 进行倍性鉴定。结果发现，二倍体对照的分离峰出现在荧光强度约220(图3c)，由此推 断分离峰出现在荧光强度为110的为单倍体(图3b)，再生植株中单倍体率为18.2％，二 倍体率为70.7％。

2.8再生植株群体的田间性状调查

对再生植株群体进行田间调查(表8)，发现瓜长和雌花率在两个亲本之间差异显著， F1在瓜长和瓜横径上均介于亲本之间，而花性上与母本同为雌性系。且三个性状在再生 植株群体中均表现出连续的分布和广泛的变异，尤其是雌花率的变异幅度为0—100.0。瓜 粗和雌花率的偏度大于0，表明两个性状的调查数据中大于均值的数据更为分散。瓜粗的 峰度也大于0，说明数据分布较标准正态分布更陡峭。

表8 黄瓜65G、228、F1和再生植株群体的瓜长、瓜粗、雌花率的遗传参数