miR-127抑制剂在制抗炎和肺损伤保护药物的应用

摘要

本发明公开miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用。抑制miR-127能够有效预防肺损伤导致的肺部炎症和损伤。miR-127抑制剂可减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。本发明揭露了miR-127抑制剂可用于制备预防急性肺损伤及其并发症药物，以及miR-127抑制剂用于预防急性肺损伤及其并发症的作用机制。miR-127抑制剂以Bcl6为靶标，通过调节Bcl6/Dusp1/JNK通路而抑制LPS诱导的炎症反应。

说明书

技术领域

本发明属生物医学类技术领域，涉及miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用。

背景技术

急性肺损伤以肺间质中大量炎症因子的释放，炎症细胞的聚集，纤维素沉积和肺水肿为病理生理特征。失调的炎症反应引起组织的严重损伤和肺功能的持续恶化。现在科学界对于急性肺损伤及其并发症的起因还未有深入研究，也没有开发出有效的治疗方法。因此，急性肺损伤的死亡率至今高达40％。

microRNAs(miRNAs,小RNA)是一类长度在18-25个核甘酸的单链小RNA分子，它主要通过与相关蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，抑制其靶基因的翻译或者促进靶基因mRNA的降解，以实现对目标基因的转录后调控。这类小RNA分子的表达具有空间和时间上的特异性，对于细胞的增殖，凋亡，分化以及器官的形成具有重要的调控意义。目前，miRNA的研究发展十分迅速，随着研究手段和方法的不断进步，已有成百上千种miRNA被发现(Murray PJ,Wynn TA.Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.Nat Rev Immunol 2011；11:723-737；Wynn TA,Chawla A,Pollard JW.Macrophage biology in development,homeostasis and disease.Nature 2013；496:445-455；Sindrilaru A,Peters T,Wieschalka S et al.An unrestrained proinflammatory M1 macrophage population induced by iron impairs wound healing in humans and mice.J Clin Invest 2011；121:985-997)。miR-127是一具有重叠基因结构的非编码小RNA。研究显示，miR-127在肺部发育、胚胎形成等方面具有一定的调控作用(Martinez FO,Helming L,Gordon S.Alternative activation of macrophages:an immunologic functional perspective.Annu Rev Immunol 2009；27:451-483)，抑制miR-127的表达能促进肝癌发生(Gautier EL,Shay T,Miller J et al.Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.Nat Immunol 2012；13:1118-1128)，并与弥漫性大B细胞淋巴瘤发生密切相关(Foster SL,Hargreaves DC,Medzhitov R.Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin  modifications.Nature 2007；447:972-978)。

固有免疫是物种进化和个体发育过程中形成的一系列防御体系，它作用无针对性,与生俱来，因此又被称为非特异性免疫应答。天然免疫应答是由能够识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular Patterns,PAMPs)的受体所介导的，这些受体统称为模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)。主要表达于树突状细胞(dendritic cells，DC)和巨噬细胞表面的Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)正是这一类重要的PRRs。此类受体最早是从果蝇体内分离得到的，主要是与果蝇胚胎背、腹侧的发育和非特异性免疫反应有关(Ivashkiv LB.Epigenetic regulation of macrophage polarization and function.Trends Immunol 2013；34:216-223)。所有的TLRs均属于I型跨膜蛋白，胞外区由18-31个氨基酸组成的富含亮氨酸的重复序列LRR(leucine rich repeats)组成，胞内区约有200个氨基酸，与白介素-1(interleukin-1,IL-1)受体胞内区相似，称为TIR(Toll/IL-1 receptor)区。它们可直接识别某些病原体或其产物所共有的PAMPs，包括细菌细胞壁脂质组分如脂多糖、脂肽，病原微生物蛋白组分如鞭毛蛋白，核酸如单链或双链RNA(核糖核苷酸)以及非甲基化CpG(胞嘧啶磷酸鸟苷)DNA(脱氧核糖核苷酸)基序等。然后，激活下游髓样分化因子(myeloid differentiation factor88,MyD88)和Toll样受体相关的干扰素活化子(Toll/IL-1R homology domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)依赖信号通路，进而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核转录因子κB抑制蛋白(IκB,inhibitor of NF-κB)等信号，最终激活免疫细胞并产生炎症因子和I型干扰素，成为机体免疫系统中抵御病原体入侵的首道屏障(Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions.Cell2009；136:215-233)。

目前大量的研究已经显示，miRNA在免疫反应中发挥极其重要的作用。miRNA不仅参与了免疫细胞的发育和分化，而且还对免疫反应的起着调控作用。例如miR-181a在造血干细胞的异位表达可增加B淋巴细胞的生成，减少T淋巴细胞的生成，miR-181a调节着T、B淋巴细胞的分化(O'Connell RM,Rao DS,Chaudhuri AA,Baltimore D.Physiological and pathological roles for microRNAs in the immune system.Nat Rev Immunol 2010；10:111-122)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可诱导上调人类单核细胞中miR-146的表达，而表达升高的miR-146可通过其靶基因白介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK-1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)负调节 TLR4诱导的炎症反应(Lodish HF,Zhou B,Liu G,Chen CZ.Micromanagement of the immune system by microRNAs.Nat Rev Immunol 2008；8:120-130)。miR-147与miR-146相似，可诱导表达于小鼠的巨噬细胞中，对TLRs诱导的炎症反应起着负调节作用(Chaudhuri AA,So AY,Sinha N et al.MicroRNA-125b potentiates macrophage activation.J Immunol2011；187:5062-5068)。miR-155作为一个重要的诱导性miRNA，能够作用于其靶基因SHIP1(SH2-containing phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate5-phosphatase 1,SH2结构域的I型肌醇5磷酸酶)，从而抑制LPS诱导的MAPK信号通路的活化(O'Connell RM,Taganov KD,Boldin MP,Cheng G,Baltimore D.MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response.Proc Natl Acad Sci U S A 2007；104:1604-1609)。虽然目前已经发现不少miRNA与免疫反应相关，但是miRNA对免疫反应的调节机制的研究很多并不明确，也不够完善，有关miR-127在炎症反应中的调控作用更是未见报道。在本专利中我们首次发现了miR-127参与调控LPS诱导的炎症应答，揭示了miR-127对TLR介导的天然免疫应答的调控功能及其作用机制，证明了抑制miR-127在抗炎和抑制肺损伤中的作用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用。

所述的miR-127的核苷酸序列如下：

CCAGCCTGCTGAAGCTCAGAGGGCTCTGATTCAGAAAGATCATCGGATCCGTCTGAGCTTGGCTGGTCGG，如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，所述的miR-127抑制剂为anti-miR-127，可通过购买取得。

抑制miR-127的anti-miR-127的有效用量为2 mg/kg，药物配成溶剂，以气道灌注方式给药。

miR-127在不同TLR配体的刺激下呈现出不同的时间依赖性，但都在16个小时表达最高；miR-127随LPS刺激表达上调主要是受到NF-κB(核因子κB，Nuclear Factor-κB)的调控，同时，miR-127能够增强由LPS诱导的NF-κB和JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase)信号通路的活化。在巨噬细胞中过表达miR-127后，IL-6(白介素6，interleukin-6)、TNF-α(肿瘤坏死因子α，tumor necrosis factorα)、IL-1β(白介素1β，interleukin-1β)等M1型炎症因子表达显著上调，IL-10(白介素10，interleukin-10)等M2型炎症因子表达显著下调。通过小鼠气道灌注LPS建立小鼠急性肺损伤模型，通过对炎症因子表达、组织病理学切片等多项指 标检测，证明符合小鼠急性肺损伤表现，造模成功。我们发现通过气道灌注anti-miR-127来抑制miR-127可以显著减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。除此之外，我们发现miR-127对Bcl6(B细胞淋巴瘤6，B-cell lymphoma 6 protein)具有靶向作用，通过调节Bcl6/Dusp1(双特异性磷酸酶1，Dual specificity protein phosphatase 1)/JNK通路来增强巨噬细胞向M1型的极化和炎症反应。以上实验结果揭示了miR-127在肺部炎症疾病中的作用及机理,证明了通过抑制miR-127的表达可以有效控制炎症和肺部损伤。

本发明的有益效果是抑制miR-127能够有效预防肺损伤导致的肺部炎症和损伤。miR-127抑制剂可减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。本发明揭露了miR-127抑制剂可用于制备预防急性肺损伤及其并发症药物，以及miR-127抑制剂用于预防急性肺损伤及其并发症的作用机制。miR-127抑制剂以Bcl6为靶标，通过调节Bcl6/Dusp1/JNK通路而抑制LPS诱导的炎症反应。

附图说明

图1为miR-127在不同TLR配体刺激下的表达；其中(a)为LPS，(b)为Pam3CSK，(c)为S.aureus,(d)为poly(I:C)，(e)为CpG；

图2为LPS诱导的miR-127的上调表达依赖于NF-κB途径；其中(a)为PDTC处理，(b)为U0126处理，(c)为Wortmannin处理；

图3为miR-127对LPS活化的巨噬细胞IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10产生的影响；其中(a)为miR-127过表达细胞中IL-6的表达，(b)为miR-127过表达细胞中TNF-α的表达，(c)为miR-127过表达细胞中IL-1β的表达，(d)为miR-127过表达细胞中IL-10的表达，(e)为miR-127抑制细胞中IL-6的表达，(f)为miR-127抑制细胞中TNF-α的表达，(g)为miR-127抑制细胞中IL-1β的表达，(h)为miR-127抑制细胞中IL-10的表达；

图4为miR-127对LPS诱导的巨噬细胞中炎症因子分泌的影响；其中(a)为miR-127过表达细胞中IL-6的分泌，(b)为miR-127过表达细胞中TNF-α的分泌，(c)为miR-127过表达细胞中IL-10的分泌，(d)为miR-127抑制细胞中IL-6的分泌，(e)为miR-127抑制细胞中TNF-α的分泌，(f)为miR-127抑制细胞中IL-10的分泌；

图5为miR-127能促进M1型巨噬细胞的极化并抑制M2型；其中(a)为miR-127过表达细胞中KC的表达，(b)为miR-127过表达细胞中Mrc1的表达，(c)为miR-127过表达细胞中Mrc2的表达，(d)为miR-127过表达细胞中Mgl1的表达，(e)为miR-127过表达细胞中Mgl2的表达，(f) 为miR-127抑制细胞中KC的表达，(g)为miR-127抑制细胞中Mrc1的表达，(h)为miR-127抑制细胞中Mrc1的表达，(i)为miR-127抑制细胞中Mgl1的表达，(j)为miR-127抑制细胞中Mgl2的表达；

图6为抑制JNK通路促进巨噬细胞向M2型转化；其中(a)为IL-6的蛋白浓度，(b)为TNF-α的蛋白浓度，(c)为IL-10mRNA的表达，(d)为Mrc1mRNA的表达，(e)为Mrc2mRNA的表达，(f)为Mgl1mRNA的表达；

图7为HEK293细胞中miR-127对Bcl-63’UTR荧光素酶活性检测；

图8为RAW264.7细胞中Bcl6对Dusp1荧光素酶活性检测；

图9为miR-127影响了Bcl6与Dusp1的结合；

图10为过表达Bcl6或Dusp1抑制了miR-127过表达RAW264.7细胞中促炎因子的分泌并促进了M2型基因的表达；其中(a)为Dusp1过表达细胞中IL-6的表达，(b)为Dusp1过表达细胞中TNF-α的表达，(c)为Bcl6过表达细胞中IL-6的表达，(d)为Bcl6过表达细胞中TNF-α的表达，(e)为Dusp1过表达细胞中Mrc1的表达，(f)为Dusp1过表达细胞中Mgl2的表达，(g)为Bcl6过表达细胞中Mrc1的表达，(h)为Bcl6过表达细胞中Mgl2的表达；

图11为抑制Bcl6或Dusp1促进了miR-127受抑制的RAW264.7细胞中促炎因子的分泌并抑制了M2型基因的表达；其中(a)为Dusp1敲减细胞中IL-6的表达，(b)为Dusp1敲减细胞中TNF-α的表达，(c)为Bcl6敲减细胞中IL-6的表达，(d)为Bcl6敲减细胞中TNF-α的表达，(e)为Dusp1敲减细胞中Mrc1的表达，(f)为Dusp1敲减细胞中Mgl2的表达，(g)为Bcl6敲减细胞中Mrc1的表达，(h)为Bcl6敲减细胞中Mgl2的表达；

图12为LPS刺激增加了小鼠肺组织中miR-127的表达；

图13为miR-127对LPS诱导的小鼠肺组织中炎症因子mRNA水平的影响；其中(a)为miR-127过表达细胞中IL-6的mRNA水平，(b)为miR-127过表达细胞中TNF-α的mRNA水平，(c)为miR-127抑制细胞中IL-6的的mRNA水平，(d)为miR-127抑制细胞中TNF-α的mRNA水平；

图14为miR-127对LPS诱导的小鼠肺灌洗液中炎症因子分泌的影响；其中(a)为miR-127过表达细胞中IL-6的分泌，(b)为miR-127过表达细胞中TNF-α的分泌，(c)为miR-127过表达细胞中IL-10的分泌，(d)为miR-127抑制细胞中IL-6的分泌，(e)为miR-127抑制细胞中TNF-α的分泌，(f)为miR-127抑制细胞中IL-10的分泌；

图15为miR-127能促进小鼠肺组织中M1型巨噬细胞的极化并抑制M2型；其中(a)为miR-127灌注小鼠中KC的表达，(b)为miR-127灌注小鼠中Mrc1的表达，(c)为miR-127灌注小鼠中Mrc2的表达，(d)为miR-127灌注小鼠中Mgl1的表达，(e)为miR-127灌注小鼠中Mgl2的表达，(f)为anti-miR-127灌注小鼠中KC的表达，(g)为anti-miR-127灌注小鼠中Mrc1的表达，(h)为anti-miR-127灌注小鼠中Mrc1的表达，(i)为anti-miR-127灌注小鼠中Mgl1的表达，(j)为anti-miR-127灌注小鼠中Mgl2的表达；

图16为miR-127对小鼠肺灌洗液中细胞总数和中性粒细胞数的影响；其中(a)为miR-127灌注小鼠；(b)为anti-miR-127灌注小鼠；

图17为抑制小鼠肺组织中miR-127降低了肺灌洗液中蛋白浓度；

图18为抑制miR-127的表达提高了LPS引起的内毒素休克小鼠的存活率；其中(a)为低剂量LPS，(b)为高剂量LPS。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，而非限定本发明。

小鼠巨噬细胞株RAW264.7，人胚胎肾细胞系HEK293均购自ATCC(American type culture collection)，宿主菌大肠杆菌E.coli DH5α由本试验室常规保存。T4 DNA连接酶，限制性内切酶,Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)，dNTP Mixture(引物),DNA Maker(DNA分子量标准品)以及RNA提取液,PrimerScriptⅡ单链cDNA合成试剂盒,SYBR Premix Ex TaqTM均购自Takara公司。磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，琼脂糖，考马斯亮蓝染液，4％多聚甲醛均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；特异性磷酸化抗体均购自cell signaling公司；预染蛋白分子标志购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒均购自QIAGEN公司。瑞士染色液购自青岛海博生物技术有限公司；聚偏氟乙烯膜，增强化学发光试剂(enhanced chemiluminescence)均购于Millipore公司；细胞培养基、胎牛血清均购于Hyclone公司；LPS标准品，多聚赖氨酸，巯基乙醇酸盐，磷酸酶抑制剂，ERK抑制剂U0126(1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-aminophenylmercapto)butadiene)，NF-κB抑制剂PDTC(Pyrrolidine dithiocarbamic acid，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)，沃氏篮酶素Wortmannin均购自美国Sigma公司；miR-127mimic﹑anti-miR-127以及对照均购自Ambion公司；ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验)试剂盒购自R&D公司；蛋白提取裂解液均购自碧云天；转染试剂siPORT TM siRNA Transfection Agent购 自Ambion公司；转染试剂购自Roche；报告基因试剂盒购自promega公司；2％戊巴比妥钠为本校生理学课题组提供；其他无特殊说明的试剂均为国产分析纯试剂。清洁级C57BL/6小鼠购自Jackson Lab,饲养于杭州师范大学实验动物中心清洁级动物房，小鼠均为雄性，实验时小鼠为6-8周龄。在整个体内实验过程中，所有操作均遵守国家及杭州师范大学伦理委员会制定的《实验动物使用条例》。所有实验结果均是由独立的三次重复实验得到，采用不配对的t检验分析数据，均用士sEM表示。P值<0.05为显著性差异标准(*<0.05，**<0.01)。

实施例一：miR-127可以被LPS-TLR4-NF-κB信号通路激活

(1)miR-127在不同TLR配体刺激下的表达

首先，我们用TLR4的配体LPS(100ng/mL)刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞，在刺激后的0、2、4、8、16、24小时收集细胞，抽提RNA并反转录，采用定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检测巨噬细胞中miR-127表达水平的动态变化。结果表明TLR4的活化能够激活miR-127的表达。miR-127的表达量在LPS刺激2小时首先降低，下降至基础值的10-20％；后迅速升高，在刺激16小时后miR-127的表达量最高，升高至基础值的7倍左右；之后又开始下降(图1a)。

上述结果从细胞水平证明了miR-127可以被LPS-TLR4信号通路激活。

同时，我们也检测了TLRs家族的其他成员。用TLR3的配体poly(I:C)(10μg/mL)，TLR1/2的配体三酰脂肽Pam3CSK4(100ng/mL)，TLR9的配体CpG(10μM)，TLR2/4激动剂金黄色葡萄球菌(S.aureus,MOI＝10)刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞，在刺激后的0、2、4、8、16、24小时收集细胞，抽提RNA并反转录，采用定量PCR方法检测巨噬细胞中miR-127表达水平的动态变化。结果发现TLR3、TLR1/2和TLR9的活化均能够激活miR-127的表达，在刺激后的16小时达到峰值，之后开始下降。miR-127的表达量在Pam3CSK4和S.aureus刺激前8小时都较为平缓，在刺激16小时后达到最高(Pam3CSK4刺激后升高至基础值15-20倍，S.aureus升高了15倍左右)，24小时均有所下降(图1b，图1c)；而miR-127的表达量在Poly(I:C)、CpG刺激2小时首先降低，其中Poly(I:C)在刺激8小时达到最低(下降至基础值10-20％)，CpG则在2小时达到最低(下降至基础值的10-20％)，后迅速升高，三者均在刺激16小时miR-127的表达量最高(Poly(I:C)升高3-4倍，CpG升高10-15倍)，之后开始有所下降(图1d，图1e)。这些提示我们miR-127可能是多条信号通路的终端，可能对多种免疫反应具有重要的作用。

(2)LPS诱导的miR-127的上调表达依赖于NF-κB途径

为进一步探明miR-127的激活的内在机理，我们又深入研究TLR4下游的NF-κB、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)和AKT(也被称为蛋白激酶B，protein kinase B,PKB)信号通路。小鼠巨噬细胞分别用100μM的NF-κB抑制剂PDTC、10μM的ERK抑制剂U0126和AKT抑制剂2μM的Wortmannin预处理30分钟，然后加入100ng/mL LPS刺激，刺激0、2、16小时收集细胞，抽提RNA并反转录，用定量PCR检测miR-127的表达变化。结果显示只有PDTC处理的可以抑制LPS刺激引起的巨噬细胞中miR-127的上调表达，抑制率达到75％(图2a)。而U0126和Wortmannin都不能下调LPS对miR-127的上调表达(图2b，图2c)。这说明LPS诱导的巨噬细胞miR-127表达的上调依赖于NF-κB途径，而不通过ERK和AKT信号通路。

实施例二：miR-127调控炎症因子表达和巨噬细胞的极性转化

(1)miR-127对LPS活化的巨噬细胞IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10产生的影响

我们对TLR4触发的巨噬细胞产生的炎症性和效应性细胞因子进行了mRNA水平和蛋白水平的检测。小鼠原代巨噬细胞转染miR-127 mimic和anti-miR-12724小时后，用LPS(100ng/mL)刺激，在刺激后的0、3、6、12小时收集细胞，抽提RNA并反转录，用定量PCR方法检测IL-6和TNF-α基因转录水平。结果显示对照组TLR4活化后巨噬细胞的IL-6、TNF-α的基因转录水平在6小时达到最高峰，较对照相比，过表达miR-127能够在6小时和12小时明显上调IL-6基因转录水平(图3a)，TNF-α和IL-1β的基因转录水平也出现了一定的上升趋势(图3b,c)，IL-10则在3、6、12小时显著抑制(图3d)；而抑制miR-127的表达之后，TLR4活化的巨噬细胞IL-6基因转录水平在LPS刺激3小时，6小时和12小时下调约20％(图3e)，TNF-α和IL-1β的基因转录水平降低(图3f，g)，IL-10在3、6、12小时显著上调(图3h)。

我们用同样方法处理巨噬细胞，分别在LPS刺激后的0、6、12、24小时收集细胞培养上清，进行IL-6、TNF-α和IL-10的ELISA检测。结果发现，miR-127的过表达能上调IL-6和TNF-α表达量(图4a，b)，同时在下调IL-10表达量(图4c)；而miR-127受抑制状态下，LPS处理后，IL-6和TNF-α的表达降低(图4d,e)，诱导活化的巨噬细胞IL-10表达上升约40％(图4f)。由此可见，miR-127在mRNA水平和蛋白水平能显著增强TNF-α和IL-6这类炎症因子的表达，并抑制IL-10的表达。

根据上述实验结果，我们从细胞模型证明了miR-127可以调控炎症因子IL-6、TNF-α和IL-10的表达，其中miR-127正向调控IL-6和TNF-a的表达，负调控IL-10的表达。

(2)miR-127能促进M1型巨噬细胞的极化并抑制M2型

M1型炎症因子和趋化因子有IL-6、TNF-α和KC(趋化因子,keratinocyte chemoattractant)的表达，其高表达往往代表巨噬细胞向M1型转化。M2型炎症因子有IL-10、Mgl1(半乳糖凝集素I型，macrophage galactose-type C-type lectin 1)、Mgl2(半乳糖凝集素II型，macrophage galactose-type C-type lectin 2)、Mrc1(C型甘露糖受体1，mannose receptor C type 1)和Mrc2(C型甘露糖受体2，mannose receptor C type 2)，其表达受到抑制则表示巨噬细胞向M2型转化受到抑制。我们进一步分析miR-127对巨噬细胞极性转化的调控作用。

小鼠原代巨噬细胞转染miR-127 mimic和anti-miR-12724小时，用LPS(100ng/mL)刺激，在刺激后的0、3、6、12小时收集细胞，抽提RNA并反转录，用定量PCR方法检测KC、Mgl1、Mgl2、Mrc1和Mrc2的mRNA的表达水平。结果显示，KC的表达水平随LPS的刺激逐渐升高，在6小时达到最高峰，而Mgl1、Mgl2、Mrc1和Mrc2表达水平随LPS的刺激逐渐下降；较对照相比，高表达miR-127能够促进KC的表达(图5a)，但Mgl1、Mgl2、Mrc1和Mrc2的表达却受到抑制(图5b,c,d,e)。而抑制miR-127之后，与对照相比，KC在LPS刺激下表达下降(图5f)，而Mgl1、Mgl2、Mrc1和Mrc2的表达水平升高(图5g,h,i,j)。

结合前面的结果，证明了miR-127可以抑制IL-10、Mgl1、Mgl2、Mrc1和Mrc2等这类M2型炎症因子的表达。我们推测miR-127很可能参与调控了巨噬细胞的极性转化，通过促进M1型炎症因子和趋化因子如IL-6、IL-1β、TNF-α和KC的表达，抑制M2型炎症因子如IL-10、Mgl1、Mgl2、Mrc1和Mrc2的表达，最终调控巨噬细胞向M1型转化。

(3)miR-127对LPS诱导的NF-κB和MAPK信号通路的影响

为进一步探讨miR-127调控炎症因子的内在分子机制，我们检测了miR-127过表达情况下LPS诱导的ERK、p38、JNK和p65的磷酸化水平。小鼠腹腔巨噬细胞瞬转miR-127 mimic 24小时后，加入LPS(100ng/mL)刺激，分别在刺激后的0、15、30和60分钟收集细胞，按照方法部分所述制备蛋白样本，进行Western blot检测p-ERK1/2、p-p38、p-JNK以及p-p65蛋白水平变化。如图所示，miR-127过表达情况下LPS诱导的ERK和p38激酶的磷酸化水平较对照组明显下降，而p-JNK和p-p65较对照组明显上 升。

使用JNK抑制剂后，我们发现巨噬细胞中受miR-127调控升高的IL-6和TNF-α受到抑制(图6a,b)，同时，被miR-127抑制的IL-10、Mgl1、Mgl2、Mrc1和Mrc2的转录水平表达升高(图6c,d,e,f)。这些数据提示JNK可能参与了miR-127介导的巨噬细胞的分型。

实施例三：Bcl6是miR-127的靶基因

(1)Bcl6在LPS刺激的巨噬细胞中表达规律

通过生物信息学分析，我们发现Bcl6的3’UTR区可能存在和miR-127种子序列区相互配对的特异靶位点。随后，我们用LPS(100ng/mL)刺激小鼠腹腔巨噬细胞，分别在刺激后的0、1、2、3、4、12小时收集细胞，按照方法部分描述制备蛋白样品，用Western blot检测Bcl6的蛋白表达变化。结果显示Bcl6随着LPS的刺激表达升高，并在2小时表达最高，随后随刺激的时间增强而逐渐减弱。对比前面的实验结果，表明LPS诱导的Bcl6的蛋白变化与miR-127的表达恰好呈现了相反的表达规律，这就提示了我们miR-127可能参与了Bcl6的表达调控，推测Bcl6很可能是miR-127的一个靶基因。

(2)HEK293细胞中Bcl63’UTR荧光素酶活性检测

我们构建了pMIR-Bcl-63’UTR报告基因质粒。在HEK293细胞中先转染miR-127 mimic和anti-miR-12724小时，再转染pMIR-Bcl63’UTR，转染24小时后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果可见，miR-127过表达能显著抑制pMIR-Bcl63’UTR的荧光素酶活性，大约在50％左右，而miR-127抑制之后，pMIR-Bcl63’UTR荧光素酶活性显著升高(图7)。这些结果说明，miR-127通过作用于Bcl6的3’UTR特异靶位点，从而在转录后水平抑制其靶基因的表达。

(3)miR-127对LPS诱导的Bcl6表达的影响

我们在小鼠原代腹腔巨噬细胞中过表达和抑制miR-127，然后在LPS刺激后的2小时收集细胞，用Western blot检测Bcl6蛋白表达变化。结果显示，在LPS刺激2小时之后，miR-127过表达能明显抑制Bcl6的表达，而抑制miR-127的表达之后，Bcl6的表达明显上调。

实施例四miR-127通过调节Bcl6/Dusp1/JNK通路来调节巨噬细胞的活性和极化

(1)Dusp1参与了miR-127调节JNK的通路

有文献报导磷酸酶Dusp1可以抑制JNK的磷酸化，从而对急性肺损伤起到保护作用(Zhao Q,Wang X,Nelin LD et al.MAP kinase phosphatase 1 controls innate immune responses and suppresses endotoxic shock.J Exp Med2006；203:131-140；Park MS,He Q,Edwards MG et al.Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 modulates regional effects of injurious mechanical ventilation in rodent lungs.Am J Respir Crit Care Med 2012；186:72-81)。miR-127转染后降低了经LPS活化后巨噬细胞中Dusp1的表达，而anti-miR-127增强了Dusp1的表达，证明miR-127可以负调控Dusp1。在RAW264.7中沉默Dusp1后增强了JNK的磷酸化，反之，过表达Dusp1后JNK的磷酸化减弱。这表明miR-127可能通过负调控磷酸酶Dusp1来调控JNK的活性，从而来调控巨噬细胞的活化和分型。

(2)miR-127通过作用于Bcl6来调节Dusp1的转录

通过序列分析可知Dusp1不是miR-127的直接靶基因。有论文报导转录调控因子Bcl6受miR-127的直接调控(Saito Y,Liang G,Egger G et al.Specific activation of microRNA-127 with downregulation of the proto-oncogene BCL6 by chromatin-modifying drugs in human cancer cells.Cancer Cell 2006；9:435-443)，所以，我们推测miR-127可能通过直接作用于Bcl6来调节LPS引起的炎症反应。我们发现在LPS刺激的巨噬细胞中转染miR-127后，Bcl6的蛋白水平降低；转染anti-miR-127后，Bcl6的表达升高,显示了miR-127和Bcl6之间的负相关性。

作为转录因子，Bcl6可以结合到Dusp1的两段启动子序列，所以我们推测miR-127可能是通过调节Bcl6来调节Dusp1。实验证实在Bcl6过表达的巨噬细胞中Dusp1的表达也增高。相应的，干扰Bcl6后Dusp1的表达降低。在RAW264.7细胞中先转染Dusp1的5’UTR，再转染Bcl6或Bcl6的突变序列，转染24小时后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果可见，过表达Bcl6后可以使Dusp1的5’UTR的荧光素酶活性显著升高，而Bcl6锌指结构区域3或者5发生突变时，Dusp1的5’UTR的荧光素酶活性受到影响(图8)。使用ChIP(Chromatin immunoprecipitation，染色质免疫共沉淀技术)方法，我们发现Bcl6结合到Dusp1启动子区域受miR-127的调节，与miR-127负调控Dusp1的数据相符(图9)。Bcl6参与了miR-127调节Dusp1的过程，Bcl6沉默后引起JNK的活化和巨噬细胞的活化。敲减Bcl6后，受LPS刺激的巨噬细胞中JNK的磷酸化增强，在miR-127过表达的巨噬细胞中转入Bcl6后，JNK的磷酸化水平降低。

(3)miR-127可能通过调节Bcl6/Dusp1/JNK通路来调节巨噬细胞的活性和极化

我们进一步检测了是否过表达Bcl6或者Dusp1可以阻止miR-127介导 的巨噬细胞向M1型的转变。在miR-127过表达的细胞中转入Bcl6或Dusp1后，IL-6或TNF-α的表达减弱，而M2型巨噬细胞相关分子Mrc1和Mgl2的表达增强(图10)。同时，在转有anti-miR-127的巨噬细胞中敲减Dusp1或Bcl6后，减弱了anti-miR-127引起的抑炎效应，M2型巨噬细胞相关基因表达降低(图11)。以上结果说明Bcl6/Dusp1在miR-127介导的M1/M2型基因转录过程中起到重要的作用。

实施例五动物水平实验

(1)miR-127可以被LPS-TLR4信号通路激活 

我们建立小鼠肺炎模型。每组3只野生型C57BL/6小鼠气管灌注LPS(400μg/kg)，在刺激后的0、6、12、24小时取肺组织，研磨后抽提RNA并反转录，定量PCR检测小鼠肺组织中miR-127的动态表达变化。结果显示，miR-127的表达随着LPS刺激时间的增加而表达增加，24小时的时间点升高至基础值的2倍左右(图12)。上述结果从动物水平证明了miR-127可以被LPS-TLR4信号通路激活。

(2)miR-127对LPS诱导的小鼠肺组织中炎症因子的影响

我们又进一步采用小鼠肺炎模型来分析miR-127对炎症因子的调控作用。我们向野生型小鼠气管灌注50μg的miR-127mimic和anti-miR-127，处理24小时之后，气管灌注LPS(400μg/kg)，在刺激后的0、12、24小时抽提肺组织中的RNA，用定量PCR检测IL-6和TNF-α的表达水平。结果显示，miR-127过表达的小鼠IL-6和TNF-α的表达要明显高于对照组(图13a，b)。相反的，miR-127抑制后IL-6，TNF-α的表达要明显低于对照组(图13c,d)。

我们再用相同方法建立小鼠肺炎模型。在气管灌注LPS的6和12小时，收集肺灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，用ELISA检测BALF中TNF-α、IL-6、IL-10的表达水平。结果显示，气管灌注miR-127mimic的小鼠的BALF中，IL-6和TNF-α与对照组相比都升高了2-3倍(图14a，b)，而IL-10的表达则下降了20％左右(图14c)。相反的，气管灌注anti-miR-127的小鼠的BALF中，IL-6在LPS刺激12小时的表达与对照相比在12小时明显下调(下降30％左右)(图14d)。TNF-α在6小时有明显下降(图14e)，而IL-10的表达在12小时与对照相比升高了近1倍(图14f)。因此动物实验的结果和细胞实验结果相一致，共同证明了miR-127能显著增强TNF-α和IL-6这类炎症因子的表达，并抑制IL-10的表达。根据上述实验结果，我们从动物模型证明了miR-127可以调控炎症因子IL-6、TNF-α和IL-10的表达，其中miR-127正向调控IL-6和TNF-a的表达，负调控IL-10 的表达。

我们又用小鼠炎症模型来检测KC、Mrc1、Mrc2、Mgl1、Mgl2的mRNA的表达水平。向小鼠气管灌注miR-127 mimic和anti-miR-127，处理24小时之后，气管灌注LPS(400μg/kg)，在刺激0、12、24小时后抽提肺组织中的RNA，用定量PCR检测KC、Mrc1、Mrc2、Mgl1、Mgl2的mRNA的表达水平。结果显示，miR-127过表达的小鼠KC的mRNA表达水平明显升高(图15a)，Mrc1、Mrc2、Mgl1、Mgl2的表达则相反(图15b,c,d,e)，Mrc2和Mgl2的mRNA表达水平在12小时时，与对照组相比下降了近1倍。抑制miR-127之后，KC在LPS刺激12小时和24小时时表达分别下降了50％和70％(图15f)，而Mrc1、Mrc2、Mgl1和Mgl2的表达水平在LPS刺激24小时升高了2倍及以上(图15g,h,i,j)。

(3)小鼠肺组织常规病理切片

我们对分离得到的经LPS刺激24小时的小鼠肺组织，进行石蜡包埋，经过常规切片，苏木素伊红染色，检测肺组织病理改变。结果显示，miR-127过表达的小鼠肺部炎症细胞的浸润与对照组相比更加明显。而miR-127抑制之后的小鼠肺部的炎症细胞的浸润则明显降低。我们认为不同处理的小鼠肺组织的炎症反应变化主要是因为miR-127对IL-6和TNF-α的调控的结果。

(4)miR-127通过调节Bcl6/Dusp1/JNK通路来调节巨噬细胞的活性和极化

同样我们建立小鼠肺炎模型，每组三只野生型小鼠气管灌注miR-127mimic 24小时之后，再气管灌注LPS(400μg/kg)，24小时后收集肺组织蛋白，用Western blot检测肺组织中Bcl6的表达变化。结果显示，在LPS刺激之后，miR-127过表达的小鼠的肺组织中Bcl6的表达与对照组比明显下调，证明miR-127可能通过作用于Bcl63’UTR特异靶位点，从而在转录后水平抑制Bcl6的表达。向小鼠气管中灌注miR-127，后经LPS刺激，发现肺组织中Dusp1的表达降低；灌注anti-miR127后发现增强了Dusp1的表达。在小鼠气管内灌注miR-127后，肺组织中Bcl6的表达也显著降低。

我们在细胞水平上证明了miR-127可以调节巨噬细胞向M1型转变，我们在动物水平上检测了抑制miR-127是否可以降低LPS引起的肺部炎症和损伤。在小鼠气管内灌注anti-miR-127或者对照siRNA后接受LPS刺激，然后检测肺部的炎症反应。实验结果显示，使用miR-127抑制剂后，LPS刺激引起的肺损伤减弱，肺间质水肿减少。我们收集LPS处理的0、6、12、24小时的BALF，并用细胞计数仪进行细胞计数。结果显示，与对照组相 比，过表达miR-127小鼠的BALF中细胞总数和中性粒细胞数明显升高(图16a)，而将miR-127抑制之后小鼠的BALF中细胞总数和中性粒细胞数则明显下降(图16b)。anti-miR-127处理后BALF中蛋白含量减少(图17)。使用低剂量的LPS(6mg/kg)处理对照小鼠和miR-127灌注的小鼠，持续观察6天，对照小鼠存活率维持为100％，miR-127灌注小鼠的存活率在第六天时只有60％；使用高剂量的LPS(12mg/kg)处理对照小鼠和miR-127灌注的小鼠，持续观察6天，6天内对照小鼠存活率下降为30％，miR-127灌注小鼠一天内全部死亡(图18)。本发明从细胞水平和动物水平上证明了可以通过抑制miR-127来抑制M1型巨噬细胞的转化，从而抑制肺部炎症的发生。

上述实施例中使用实时定量PCR的体系如下(表1)：

表1 PCR反应体系及反应过程

所用的IL-6，TNF-α和IL-1β等引物序列如下(表2)：

表2基因引物序列

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州师范大学

 

<120>  miR-127抑制剂在制抗炎和肺损伤保护药物的应用

 

<130>  1

 

<160>  23   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  70

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

ccagcctgct gaagctcaga gggctctgat tcagaaagat catcggatcc gtctgagctt     60

 

ggctggtcgg                                                            70

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

ctcatgaaga tcctgaccga g                                               21

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

agtctagagc aacatagcac ag                                              22

 

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

ccacttcaca agtcggaggc tta                                             23

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

agtgcatcat cgttgttcat ac                                              22

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

aaggccgggg tgtcctggag                                                 20

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  7

aggccaggtg gggacagctc                                                 20

 

 

<210>  8

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  8

aacctcacct acagggcgga cttca                                           25

 

 

<210>  9

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  9

tgtaatgaaa gacggcacac c                                               21

 

 

<210>  10

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  10

cttactgact ggcatgagga tca                                             23

 

 

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  11

gcagctctag gagcatgtgg                                                 20

 

 

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  12

gcaaatggag ccgtctgtgc                                                 20

 

 

<210>  13

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  13

ctcgtggatc tccgtgacac                                                 20

 

 

<210>  14

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  14

tacagctcca cgctatggat t                                               21

 

 

<210>  15

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  15

cactctccca gttgaggtac t                                               21

 

 

<210>  16

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  16

tgagaaaggc tttaagaact ggg                                             23

 

 

<210>  17

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  17

gaccacctgt agtgatgtgg g                                               21

 

 

<210>  18

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  18

ttagccaatg tgcttagctg g                                               21

 

 

<210>  19

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  19

ggcctccaat tcttgaaacc t                                               21

 

 

<210>  20

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  20

gcggctcgga tccgtctgag ct                                              22

 

 

<210>  21

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  21

gtgcagggtc cgaggt                                                     16

 

 

<210>  22

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  22

cgcgctccac tcaagtcttc                                                 20

 

 

<210>  23

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  23

gccgaaaacg cttcatatcc t                                               21