一种微生物复合添加剂及其在提高光合细菌产量中的应用

摘要

本发明公开了一种微生物复合添加剂及其在提高光合细菌产量中的应用。本发明所提供的微生物复合添加剂，由亚铁盐、镁盐、钴盐和芽孢杆菌组成；所述亚铁盐、所述镁盐、所述钴盐和所述芽孢杆菌的配比符合如下条件：所述亚铁盐中的亚铁离子、所述镁盐中的镁离子、所述钴盐中的钴离子和所述芽孢杆菌的配比为20mg：10mg：10mg：2.56×10

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种微生物复合添加剂及其在提高光合细菌产 量中的应用。

背景技术

光合细菌菌体无毒，其体内含60％以上的蛋白质，并富含例如B12、叶酸等多种 维生素，其体内的生物素含量是酵母的几千倍。另外，光合细菌体内还含有生长促进 因子，是一类营养价值高且成分较全的细菌。将光合细菌应用于养殖业中具有明显的 增产效果，所以发展光合细菌菌体作为养殖饲料添加剂有望带来巨大的经济效益。

光合细菌是一类以光作为能源的微生物，能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自 然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用。随着光合细菌的作 为养殖饲料带来的效益的研究和应用的不断深入，首要的问题是如何实现菌体的大量 培养，使光合细菌的研究更多地应用于生产，实现规模化的应用。目前关于光合细菌 的培养基有许多，RCVBN培养基是光合细菌培养中常用的基础培养基。针对不同的 菌种，该培养基在组成和浓度上有经过一定的改良，但光合细菌在其中生长仍然缓慢， 不利于光合细菌的大规模培养。

因此，如何提高培养过程中的光合细菌细胞生物产量成为光合细菌作为养殖饲料 产业化的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物复合添加剂及其应用。

本发明所提供的微生物复合添加剂，具体由亚铁盐、镁盐、钴盐和芽孢杆菌 (Bacillus sp.)组成；所述亚铁盐、所述镁盐、所述钴盐和所述芽孢杆菌的配比符合 如下条件：所述亚铁盐中的亚铁离子、所述镁盐中的镁离子、所述钴盐中的钴离子和 所述芽孢杆菌的配比为20mg：10mg：10mg：2.56×10⁶cfu。

在本发明的一个实施例中，所述亚铁盐具体为硫酸亚铁，所述镁盐具体为硫酸镁， 所述钴盐具体为氯化钴。相应的，所述微生物复合添加剂为由硫酸亚铁、硫酸镁、氯 化钴和所述芽孢杆菌按照54mg：50mg：10mg：2.56×10⁶cfu的比例混合而成。

所述微生物复合添加剂在制备用于培养光合细菌的培养基中的应用也属于本发 明的保护范围。

本发明还提供了一种用于培养光合细菌的改良培养基。

本发明所提供的用于培养光合细菌的改良培养基，为在用于光合细菌培养的基础 培养基中添加所述微生物复合添加剂后形成的培养基。

在所述改良培养基中，来源于所述微生物复合添加剂中的亚铁离子的终浓度为 20mg/L，来源于所述微生物复合添加剂中的镁离子的终浓度为10mg/L，来源于所述 微生物复合添加剂中的钴离子的终浓度为10mg/L，所述芽孢杆菌的终浓度为2.56×10⁶cfu/L(即所述芽孢杆菌在所述改良培养基中的含量为2.56×10⁶cfu/L)。

在本发明中，所述用于光合细菌培养的基础培养基具体为RCVBN培养基。

所述RCVBN培养基的组成如下：每1L所述RCVBN培养基中含有DL-苹果酸4 g，硫酸镁0.12g，硫酸铵1g，氯化钙0.075g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.3g， Na₂EDTA 0.02g，VB₁0.001g，尼克酸0.001g，生物素0.015g，T.M储备液1ml，余 量为水，pH6.8。

所述T.M储备液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：H₃BO₃0.7g/L、MnSO₄.H₂O 0.389g/L、NaMoO₄.2H₂O 0.188g/L、Cu(NO₃)₂·3H₂O 0.01g/L。

所述微生物复合添加剂或所述改良培养基在如下(a)-(c)任一中的应用也属于 本发明的保护范围：

(a)提高光合细菌产量；

(b)提高光合细菌代谢中ATP产量；

(c)促进光合细菌生长代谢的关键基因RSP_3419的表达。

本发明还提供一种提高光合细菌产量的方法。

本发明所提供的提高光合细菌产量的方法，具体包括如下步骤：将待培养的光合 细菌接种于所述改良培养基中，于温度25-35℃(如30℃)、光强2000-4000lux(如3000 lux)的厌氧环境中静置培养。

在本发明中，将所述待培养的光合细菌接种于所述改良培养基中时，所述待培养 的光合细菌的接种量为：接种后，所述待培养的光合细菌的含量为2.176×10¹⁰cfu/L。

所述提高，具体体现为：将待培养的光合细菌接种于所述改良培养基中，于温度 30℃、光强3000lux的厌氧环境中静置培养，所得光合细菌的量，显著高于采用所述 用于光合细菌培养的基础培养基(如所述RCVBN培养基)在相同条件下培养所得所 述光合细菌的量。

在本发明中，所述培养的时间具体为3天。

在本发明中，所述光合细菌为类球红细菌(Rhodopseudomonas spheroides)；具体 如类球红细菌(Rhodopseudomonas spheroides)ATCC 17023。

本发明的优点：

(1)通过使用本发明方法，即在基础培养基中加入一种促进光合细菌快速增殖 的由微量元素和微生物促进剂组成的微生物复合添加剂，在单位体积和单位时间内得 到了更大的生物量，为光合细菌在养殖饲料业的应用发展提供了一种可行的技术。

(2)本发明方法中，从蛋白质和基因两方面同时调控光合细菌的代谢水平，从 而提高光合细菌的产量。一方面，使用的Fe²⁺、Mg²⁺和Co²⁺有效地刺激了蛋白质的表 达，它直接影响光合细菌代谢的关键酶——总脱氢酶活性明显提高(该酶决定了细胞 代谢水平)，同时光合细菌生长代谢所需的能量ATP产量明显提高。另一方面，使用 的微生物促进剂芽孢杆菌有效地刺激了光合细菌生长代谢的关键基因RSP_3419的表 达，从基因方面加速了光合细菌的增殖。

附图说明

图1为微量元素对光合细菌菌体增殖的影响。图中，空白表示RCVBN培养基(不 加微量元素)的对照。

图2为微量元素Fe²⁺对光合细菌菌体增殖的影响。图中，空白表示RCVBN培养 基(不加微量元素)的对照。

图3为微量元素Mg²⁺对光合细菌菌体增殖的影响。图中，空白表示RCVBN培养 基(不加微量元素)的对照。

图4为微量元素Co²⁺对光合细菌菌体增殖的影响。图中，空白表示RCVBN培养 基(不加微量元素)的对照。

图5为Fe²⁺、Mg²⁺和Co²⁺对光合细菌代谢中ATP产量的影响。图中，空白表示 RCVBN培养基(不加微量元素)的对照。

图6为微生物促进剂对光合细菌菌体增殖的影响。图中，空白表示RCVBN培养 基(不加微量元素)的对照。

图7为Fe²⁺、Mg²⁺和Co²⁺对光合细菌代谢中的关键基因RSP_3419的表达的影响。 图中，空白表示RCVBN培养基(不加微量元素)的对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明采用的RCVBN培养基，其基本组成成分见表1，溶剂为水：

表1 RCVBN培养基

名称 含量(g/L) 名称 含量(g/L) 名称 含量(g/L) DL苹果酸 4 磷酸二氢钾 0.5 尼克酸 0.001 硫酸镁 0.12 磷酸氢二钾 0.3 生物素 0.015 硫酸铵 1 Na₂EDTA 0.020 T.M储备液 0.1％体积分数 氯化钙 0.075 VB₁0.001 pH 6.8

T.M储备液：溶剂为水，溶质及其浓度如下：H₃BO₃0.7g/L、MnSO₄.H₂O 0.389g/L、 NaMoO₄.2H₂O 0.188g/L、Cu(NO₃)₂·3H₂O 0.01g/L。

下述实施例中所用到的微生物促进剂：芽孢杆菌(Bacillus sp.)，记载于“翟亚楠, 郭昊,魏浩等.芽孢杆菌(Bacillus sp.)脂肽抗生素发酵工艺及分离纯化.中国生物工 程杂志,2011年11期”一文，公众可从中国人民大学获得。

下述实施例中所用到的光合细菌：类球红细菌(Rhodopseudomonas spheroides)， 为ATCC产品，菌种编号ATCC17023。

下述实施例中所用到的各微量元素的离子来源如下：Fe²⁺来源于硫酸亚铁；Mn²⁺来源于氯化锰；Zn²⁺来源于硫酸锌；Mg²⁺来源于硫酸镁；Co²⁺来源于氯化钴。

实施例1、用于提高光合细菌产量的微生物复合添加剂的制备

一、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和Co²⁺的初步筛选

采用RCVBN培养基，即按表1中培养基配方配制好培养基，额外分别添加Fe²⁺、 Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和Co²⁺，各离子的初始终浓度均为35mg/L。在1L培养基中接种 32mL光合细菌的液体菌液(液体菌液中菌含量为6.8×10⁸cfu/mL)。塞封口，放置于 厌氧培养箱(30℃，3000lux)内培养三天。实验后测定每个试样中细菌的干重，进而 计算发酵液中光合细菌的含量(mg/L)。重复测定三次，结果取平均值。实验同时设 置RCVBN培养基(不加微量元素)的对照。

光合细菌在含有不同种类微量元素的培养液中生长的效果，与不加微量元素的培 养基RCVBN的比较图如图1所示。

由图可以看出，不同种类的微量金属离子对光合细菌的生长表现出不同的促进作 用。其中，Fe²⁺、Mg²⁺和Co²⁺，其菌体生物量显著高于其他组(P<0.05)。

二、微量元素Fe²⁺对光合细菌生长的影响

采用RCVBN培养基，即按表1中培养基配方配制好培养基，额外添加Fe²⁺，初 始终浓度设置如下：0、5、10、20和40mg/L。在1L培养基中接种32mL光合细菌的 液体菌液(液体菌液中菌含量为6.8×10⁸cfu/mL)。塞封口，放置于厌氧培养箱(30℃， 3000lux)内培养三天。实验后，一方面，测定每个试样中细菌的干重，进而计算发酵 液中光合细菌的含量(mg/L)；另一方面，测定以细菌干重确定的最佳Fe²⁺浓度下发 酵液中细菌代谢产生的ATP含量(mg/L)(ATP测定方法的参考文献为：Effects of Fe²⁺concentration on biomass accumulation and energy metabolism in photosynthetic bacteria  wastewater treatment，Bioresource Technology 119(2012)55–59)。重复测定三次，结果 取平均值。

光合细菌在含有不同浓度微量元素Fe²⁺的培养液中生长的效果，与不加微量元素 的培养基RCVBN的比较图如图2所示。由图可以看出，不同浓度的微量元素Fe²⁺对 光合细菌的生长表现出不同的促进作用，5-40mg/L的Fe²⁺浓度对光合细菌生长均有促 进作用。其中，20mg/L Fe²⁺的浓度组，其菌体生物量显著高于其他组(P<0.05)。

光合细菌在含有20mg/L Fe²⁺的培养液中代谢产生ATP的产量，与不加微量元素的 培养基RCVBN的比较图如图5所示。由图可以看出，20mg/L Fe²⁺可以显著增加光合 细菌代谢产生的ATP含量(P<0.05)。

三、微量元素Mg²⁺对光合细菌生长的影响

采用RCVBN培养基，即按表1中培养基配方配制好培养基，额外添加Mg²⁺，初 始终浓度设置如下：0、5、10、20和40mg/L。在1L培养基中接种32mL光合细菌的 液体菌液(液体菌液中菌含量为6.8×10⁸cfu/mL)。塞封口，放置于厌氧培养箱(30℃， 3000lux)内培养三天。实验后，一方面，测定每个试样中细菌的干重，进而计算发酵 液中光合细菌的含量(mg/L)；另一方面，测定以细菌干重确定的最佳Mg²⁺浓度下发 酵液中细菌代谢产生的ATP含量(mg/L)。重复测定三次，结果取平均值。

光合细菌在含有不同浓度微量元素Mg²⁺的培养液中生长的效果，与不加微量元素 的培养基RCVBN的比较图如图3所示。由图可以看出，不同浓度的微量元素Mg²⁺对光合细菌的生长表现出不同的促进作用，5-40g/L的Mg²⁺浓度对光合细菌生长均 有促进作用。其中，10mg/L Mg²⁺的浓度组，其菌体生物量显著高于其他组(P<0.05)。

光合细菌在含有10mg/L Mg²⁺的培养液中代谢产生ATP的产量，与不加微量元素 的培养基RCVBN的比较图如图5所示。由图可以看出，10mg/L Mg²⁺可以显著增加 光合细菌代谢产生的ATP含量(P<0.05)。

四、微量元素Co²⁺对光合细菌生长的影响

采用RCVBN培养基，即按表1中培养基配方配制好培养基，额外添加Co²⁺，初 始终浓度设置如下：0、5、10、20和40mg/L。在1L培养基中接种32mL光合细菌的 液体菌液(液体菌液中菌含量为6.8×10⁸cfu/mL)。塞封口，放置于厌氧培养箱(30℃， 3000lux)内培养三天。实验后，一方面，测定每个试样中细菌的干重，进而计算发酵 液中光合细菌的含量(mg/L)；另一方面，测定以细菌干重确定的最佳Co²⁺浓度下发 酵液中细菌代谢产生的ATP含量(mg/L)。重复测定三次，结果取平均值。

光合细菌在含有不同浓度微量元素Co²⁺的培养液中生长的效果，与不加微量元素 的培养基RCVBN的比较图如图4所示。由图可以看出，不同浓度的微量元素Co²⁺对 光合细菌的生长表现出不同的促进作用，5-40mg/L的Co²⁺浓度对光合细菌生长均有 促进作用。其中，10mg/L Co²⁺的浓度组，其菌体生物量显著高于其他组(P<0.05)。

光合细菌在含有10mg/L Co²⁺的培养液中代谢产生ATP的产量，与不加微量元素 的培养基RCVBN的比较图如图5所示。由图可以看出，10mg/L Co²⁺可以显著增加光 合细菌代谢产生的ATP含量(P<0.05)。

五、微生物促进剂对光合细菌生长的影响

采用RCVBN培养基，即按表1中培养基配方配制好培养基，额外添加微生物促 进剂芽孢杆菌，使芽孢杆菌在培养基中的终浓度设置如下：3.2×10⁵，6.4×10⁵，1.28×10⁶， 2.56×10⁶和5.12×10⁶cfu/L。

向培养基中分别加入体积为20，40，80，160和320μL(原芽孢杆菌原液的浓 度为1.6×10⁷cfu/mL)的芽孢杆菌液原液(原芽孢杆菌原液的浓度为1.6×10⁷cfu/mL) 至体系总量为1L，再向其中接种32mL光合细菌的液体菌液(液体菌液中光合细菌含 量为6.8×10⁸cfu/mL)，以实现光合细菌与芽孢杆菌的体积配比分别为：1600，800，400， 200和100(对应的光合细菌与芽孢杆菌的cfu配比依次为：6.8×10⁴、3.4×10⁴、1.7×10⁴、 8.5×10³和4.25×10³)。塞封口，放置于厌氧培养箱(30℃，3000lux)内培养三天。实 验后，一方面，测定每个试样中细菌的干重，进而计算发酵液中光合细菌的含量 (mg/L)；另一方面，测定每个试样中光合细菌生长代谢的关键基因RSP_3419的相对 表达量，基因引物信息为：正向引物序列为5′-GGATATCTGGGACZTCGCCG-3′；反 向引物序列为5′-TGTCTGACAGAACGGCAACC-3′。基因定量的方法步骤：

(1)RNA提取：细菌总RNA提取试剂盒完成；

(2)反转录：通过反转录过程合成cDNA；

(3)qPCR过程：在ABI Stepone Real-Time PCR System中完成qPCR，反应条件 设置：95℃，2min；95℃，10s(40个循环)；60℃，40s；

(5)基因表达计算：采用相对表达计算方法获得基因表达量。实验重复三次，结 果取平均值。

光合细菌在含有不同浓度微生物促进剂的培养液中生长的效果，与不加微生物促 进剂的培养基RCVBN的比较图如图6所示。由图可以看出，不同浓度的微生物促进 剂对光合细菌的生长表现出不同的促进作用，芽孢杆菌接种量为 3.2×10⁵～5.12×10⁶cfu/L范围内的微生物促进剂浓度对光合细菌生长均有促进作用。其 中2.56×10⁶cfu/L的微生物促进剂组(光合细菌与芽孢杆菌的体积为200的组)，其菌 体生物量显著高于其他组(P<0.05)。

光合细菌在不同浓度微生物促进剂的作用下基因RSP_3419的表达量，与不加微 生物促进剂组的比较图如图7所示。由图可以看出，3.2×10⁵～5.12×10⁶cfu/L范围内的 微生物促进剂浓度对光合细菌基因RSP_3419的表达均具有显著的促进作用(P<0.05)。

六、用于提高光合细菌产量的微生物复合添加剂的配制

根据步骤一到五的结果(Fe²⁺、Mg²⁺和Co²⁺在培养基中浓度为20、10和10mg/L 最优，微生物促进剂的量为2.56×10⁶cfu/L时最优)，计算得到在每升用于培养光合细 菌的培养基中，除RCVBN培养基外，额外添加的亚铁盐(硫酸亚铁)的量为54mg， 镁盐(硫酸镁)的量为50mg，钴盐(氯化钴)的量为10mg，芽孢杆菌的量为2.56×10⁶cfu。

因而，得到用于提高光合细菌产量的微生物复合添加剂配方如下：铁盐(硫酸亚 铁)、镁盐(硫酸镁)、钴盐(氯化钴)和芽孢杆菌按54mg：50mg：10mg：2.56×10⁶cfu 的比例混合。

当然，将如上微生物复合添加剂中的特定铁盐、镁盐、钴盐替换为其他铁盐、镁 盐、钴盐也可以，只要保证微生物复合添加剂中的Fe²⁺、Mg²⁺、Co²⁺和芽孢杆菌的配 比符合20mg：10mg：10mg：2.56×10⁶cfu即可。

实施例2、用于提高光合细菌产量的改良培养基的配制及光合细菌的培养

一、用于提高光合细菌产量的改良培养基的配制

根据实施例1中的各微量元素和微生物促进剂的优化结果，通过向RCVBN培养 基中额外添加实施例1配制的微生物复合添加剂，得到用于提高光合细菌产量的改良 培养基，具体为：向表1中的RCVBN培养基中额外添加Fe²⁺、Mg²⁺、Co²⁺以及微生 物促进剂，使额外添加的所述Fe²⁺在所得培养基中的终浓度为20mg/L，额外添加的所 述Mg²⁺在所得培养基中的终浓度为10mg/L，额外添加的所述Co²⁺在所得培养基中的 终浓度为10mg/L，所述芽孢杆菌浓度为2.56×10⁶cfu/L。

二、采用用于提高光合细菌产量的改良培养基培养光合细菌

在步骤一所得的1L改良培养基中接种32mL光合细菌的液体菌液(液体菌液中菌 含量为6.8×10⁸cfu/mL)。塞封口，放置于厌氧培养箱(30℃，3000lux)内培养三天。 实验后测定每个试样中细菌的干重，进而计算发酵液中光合细菌的含量(mg/L)。重 复测定三次，结果取平均值。实验同时设置RCVBN培养基(不加微量元素和芽孢杆 菌促进剂)的对照。

结果如表2所示，可见与RCVBN培养基相比，采用本发明所提供的改良培养基 对光合细菌进行培养，可以极显著提高菌株的产量(P<0.01)。

表2改良培养基培养光合细菌产量(单位：mg/L)

  重复1 重复2 重复3 平均值±标准差 改良培养基 4010 3900 4120 4010±89 RCVBN培养基 1330 1280 1350 1320±29

注：本文研究采用HPLC法分析C_oQ₁₀的含量以表征废水中光合细菌菌体含量， 验证发现光合细菌量占菌体干重的比例为99％以上，因此可以排除芽孢杆菌的干扰， 具体方法依据论文《HPLC法定量分析水中光合细菌菌体含量》(2011年)。