一种基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合

摘要

本发明公开了一种基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，它是由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁5味中药配制而成。本发明利用桂枝茯苓丸所具有的多种药理活性，通过改变桂枝茯苓丸原方的组成比例，成为一种基于桂枝茯苓丸的中药组合，制备该中药组合的浓缩液，以及根据该浓缩液制备含药血清，通过实验证明该浓缩液及含药血清都可以有效地逆转高度耐药的卵巢癌细胞的耐药性，具有安全性高、毒性低、疗效持久、治疗成本低的特点，可以有效地逆转高度耐药的卵巢癌细胞的耐药性。

说明书

技术领域

本发明属于中医中药技术领域，具体涉及一种基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性

的中药组合。

背景技术

卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤，其中90%为上皮性卵巢癌。由于卵巢癌发病隐匿，约70%患者确诊时已为晚期(FIGO分期：Ⅲ期和Ⅳ期)。外科手术之后进行紫杉醇/铂类为基础的化疗是目前晚期卵巢癌的标准治疗方案。在化疗初期，紫杉醇/铂类联合化疗方案对卵巢癌非常有效，但80%的患者最终都会复发，并对紫杉醇/铂类耐药，致使晚期卵巢癌患者的5年生存率仅为18%～30%。肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药，也会对其他作用机制和化学结构不同的药物产生耐药，这就是多药耐药性（multidrug resistance, MDR）。肿瘤细胞在耐药的同时，其内部的基因也会发生变化，例如肿瘤细胞在耐药前无P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表达，但其发生耐药后，P-gp往往表达增高。P-gp是一种“泵药”蛋白，肿瘤细胞中P-gp表达增高后，泵出抗肿瘤药物的能力增强。以卵巢癌为例，紫杉醇/铂类抗肿瘤药物可以杀死正常卵巢肿瘤细胞，其原因是正常肿瘤细胞无P-gp表达，抗肿瘤药物可以进入肿瘤细胞内，达到能够杀灭肿瘤细胞的浓度。但是卵巢癌肿瘤细胞P-gp表达增高后，被P-gp泵出肿瘤细胞的抗肿瘤药物增多，肿瘤细胞内的抗肿瘤药物浓度下降，达不到能够杀死肿瘤细胞的浓度，这就导致了化疗失败。另有研究发现，肿瘤细胞P-gp表达增高后，其浸润能力和转移能力增强，且肿瘤组织的病理类型也会发生改变。

目前国内外逆转MDR的研究主要是化学合成的药物和中药单体。一些化学合成的MDR逆转剂已经进行了Ⅰ/Ⅱ期临床试验，但这些MDR逆转剂均由于毒性过大或者在临床试验中的逆转耐药作用并不明显而终止了研究，如环孢菌素A及其同类化合物伐司朴达（Valspodar）等，其原因可能是这些MDR逆转剂只是单靶点作用于肿瘤耐药细胞，导致其临床疗效并不明显。一些研究人员转而从包括中药在内的天然产物中提取分离MDR逆转剂，天然来源的MDR逆转剂通常具有毒性较低，人体耐受性良好的特点，但这些研究大多还停留在实验室阶段，目前并无太大的进展。因此，目前尚无可用于临床的MDR逆转剂。

桂枝茯苓丸是张仲景《金匮要略》所载经方，原方用于癥病，由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁等量组成，已有上千年的应用历史，具有安全性高、毒性低的特点。现代药理研究表明，桂枝茯苓丸水煎液具有微弱的抑瘤作用，不能作为抗肿瘤药物在临床上使用。目前已经发现茯苓和赤芍中含有逆转MDR作用的成分，但尚未有文献报道桂枝茯苓丸作为一个完整的经方是否能发挥逆转肿瘤MDR的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，该中药组合符合中医方剂配伍的整体观念，能更好地从多靶点、多途径、多环节逆转肿瘤MDR，具有安全性高、疗效持久、治疗成本低的特点，从而达到提高化疗效果、改

善病人预后，并产生经济和社会效益。

为实现上述目的，本发明技术方案是：一种基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，由下述重量配比原料制成：桂枝9-12份、茯苓10-15 份、牡丹皮9-12 份、赤芍 10-15份、桃仁9-12份。

进一步的，所述基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，由下述重量配比原料制成：桂枝9份、茯苓15 份、牡丹皮9 份、赤芍 15份、桃仁9份。

本发明利用桂枝茯苓丸所具有的多种药理活性，通过改变桂枝茯苓丸原方的组成比例，成为一种基于桂枝茯苓丸的中药组合，制备该中药组合的浓缩液，以及根据该浓缩液制备含药血清，通过实验证明该浓缩液及含药血清都可以有效地逆转高度耐药的卵巢癌细胞的耐药性，具有安全性高、毒性低、疗效持久、治疗成本低的特点，可以有效地逆转高度耐药的卵巢癌细胞的耐药性。

具体实施方式

本发明基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，由下述重量份配比原料制成：桂枝9-12份、茯苓10-15 份、牡丹皮9-12 份、赤芍 10-15份、桃仁9-12份。

实施例1

本发明基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，其各组分原料的述重量份配比可以是：桂枝9份、茯苓10 份、牡丹皮9 份、赤芍 10份、桃仁9份。

实施例2

本发明基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，其各组分原料的述重量份配比也可以是：桂枝10份、茯苓13 份、牡丹皮10 份、赤芍 13份、桃仁10份。

实施例3

本发明基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，其各组分原料的述重量份配比也可以是：桂枝12份、茯苓15 份、牡丹皮12 份、赤芍 15份、桃仁12份。

实施例4

本发明基于桂枝茯苓丸逆转卵巢癌多药耐药性的中药组合，其各组分原料的述重量份配比还可以是：桂枝9份、茯苓15 份、牡丹皮9 份、赤芍 15份、桃仁9份。

实验例1：

实验方法：

按所述配比取桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁，牡丹皮用水蒸汽蒸馏，收集蒸馏液，分取挥发性成分备用；牡丹皮药渣与桂枝、赤芍、桃仁及茯苓用90% 乙醇提取二次，合并提取液，回收乙醇至无醇味，减压浓缩至适量；桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁及牡丹皮药渣再加水煎煮二次，滤过，合并滤液，减压浓缩至适量，与上述浓缩液及所述挥发性成分合并混合，达到1 ml药液中含生药1.5 g的标准（以下简称浓缩液）。

细胞株SKOV3是人卵巢癌敏感细胞株，SKOV3/DDP是用顺铂（DDP）诱导的耐药细胞株。按照上述方法制备的浓缩液，给Wistar大鼠灌胃给药后制备桂枝茯苓丸含药血清（以下简称含药血清），采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测含药血清联合顺铂/紫杉醇分别在人卵巢癌敏感细胞株SKOV3及其耐顺铂细胞SKOV3/DDP中的半数抑制浓度（IC₅₀），计算耐药倍数和耐药逆转倍数。采用流式细胞术测定经耐药性P-gp糖蛋白转运的荧光染料罗丹明123（Rhodamine123）在上述敏感株、耐药株细胞中的积累，及经含药血清处理后，耐药株细胞内罗丹明123蓄积的改变。采用Western blot和RT-PCR技术检测SKOV3/DDP细胞用含药血清处理后，P-gp表达及其编码基因MDR1 mRNA的表达变化，明确含药血清对P-gp表达和功能及其编码基因MDR1的作用。

结果：SKOV3/DDP细胞耐药倍数的测定

顺铂对SKOV3/DDP细胞的IC₅₀值为：14.79±0.41 mgL^-1（n=3），顺铂对其敏感株细胞SKOV3的IC₅₀值为：3.58±0.12 mgL^-1（n=3），SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药倍数为4.13倍。

SKOV3/DDP细胞对紫杉醇的IC₅₀值为： 6.86±0.22 mgL^-1（n=3），其敏感株细胞SKOV3对紫杉醇的IC₅₀值为：1.78±0.31 mgL^-1（n=3），SKOV3/DDP细胞对紫杉醇的耐药倍数为3.85倍。

含药血清对SKOV3/DDP细胞和SKOV3细胞的细胞毒作用：

浓缩液以16 g·kg^-1·d^-1（高）、8 g·kg^-1·d^-1（中）、4 g·kg^-1·d^-1（低）剂量分别给大鼠灌胃，制得高、中、低三种浓度的含药血清，其对SKOV3细胞的抑制率分别为（20.4±4.0）%、（11.5±1.1）%和（4.7±1.4）%，对SKOV3/DDP细胞的抑制率分别为（14.9±2.4）%、（6.3±2.0）%和（3.3±0.7）%，其中低浓度含药血清对两种细胞的抑制率都低于5%，基本无细胞毒作用。中、高浓度含药血清对两种细胞的细胞毒作用较弱。

含药血清对SKOV3/DDP细胞的耐药逆转作用：

无细胞毒作用的低浓度含药血清与顺铂联用后对SKOV3细胞的IC₅₀值为：（3.22±0.08）mgL^-1（n=3），对SKOV3/DDP细胞的IC₅₀值为：（4.39±0.17）mgL^-1（n=3）。低浓度含药血清对对SKOV3/DDP细胞的逆转倍数为3.04倍

含药血清对SKOV3/DDP细胞罗丹明 123 蓄积的影响：

随着含药血清中药物浓度增加，细胞内的罗丹明123的蓄积增加，其荧光强度逐渐增强，说明SKOV3/DDP耐药细胞株的P-gp功能受到抑制。

含药血清对SKOV3/DDP细胞P-gp表达的影响：

敏感细胞株SKOV3无P-gp表达，耐药细胞株SKOV3/DDP的P-gp表达明显增加，但随着含药血清药物浓度的增加，SKOV3/DDP细胞的P-gp表达逐渐下降，说明含药血清对P-gp具有抑制作用。

含药血清对SKOV3/DDP细胞MDR1 mRNA表达的影响：

耐药细胞株SKOV3/DDP的MDR1 mRNA表达较高，但随着含药血清药物浓度的增加，SKOV3/DDP细胞的MDR1 mRNA表达逐渐下降，说明含药血清对编码P-gp的MDR1 具有抑制作用。

实验结果提示：

基于桂枝茯苓丸的中药组合制备的含药血清在较高浓度时对卵巢癌耐药株SKOV3/DDP和敏感株细胞SKOV3都有一定程度细胞毒作用，但在无细胞毒浓度作用下，能有效逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性。该含药血清可抑制耐药株SKOV3/DDP的泵药蛋白P-gp的功能，同时抑制P-gp及其编码基因MDR1 mRNA 的表达，从而发挥其逆转肿瘤MDR的作用。

实验例2：

取6周龄雌性BALB/c裸鼠，于小鼠两侧肩胛区皮下对称位置分别注射1×10⁷~1×10⁸个SKOV3/DDP细胞，建立皮下种植瘤模型。肿瘤生长至3 cm 左右时，处死小鼠，剖取肿瘤组织。另取6 周龄雌性BALB/c裸鼠行原位植入术：无菌条件下，选取新鲜的皮下瘤组织浸入无菌生理盐水中漂洗，将瘤组织切成1 mm³小条待用；将待移植鼠用巴比妥钠全身麻醉，作腹部正中纵切口，暴露一侧卵巢，剪开卵巢包膜，将条状瘤组织缝入卵巢表面，缝合包膜，逐层关腹，建立BALB/c裸鼠原位耐药性移植瘤模型（以下简称耐药模型）。另外采用同样方法，用SKOV3细胞建立裸鼠原位敏感性移植瘤模型（以下简称敏感模型）。

将上述两种裸鼠原位移植瘤模型各分为6组，分别为6 g·kg^-1·d^-1（高）、3 g·kg^-1·d^-1（中）、1.5 g·kg^-1·d^-1（低）剂量浓缩液组（中药组；灌胃给药）、顺铂/紫杉醇组（西药化疗组；静脉注射给药，顺铂剂量2.8 mg/kg，紫杉醇剂量6.0 mg/kg）、低剂量浓缩液与西药化疗联用组以及空白对照组，每组10只耐药性原位移植瘤模型动物。各组动物给药10天后，处死，剖取卵巢肿瘤组织，称重，计算抑瘤率，考察桂枝茯苓丸浓缩液在体内逆转卵巢癌耐药的作用。抑瘤率的计算公式为：

实验结果：

在敏感模型动物中，高、中、低剂量浓缩液组、西药化疗组、低剂量浓缩液与西药化疗联用组的抑瘤率分别为31.6%、18.5%、6.1%、66.8%、86.5%。

在耐药模型动物中，高、中、低剂量浓缩液组、西药化疗组、低剂量浓缩液与西药化疗联用组的抑瘤率分别为29.6%、16.5%、4.1%、46.8%、82.5%。

实验结果提示：在两种模型中，随着浓缩液剂量的增加，其抑瘤作用增强，但即使是高剂量浓缩液，其抑瘤作用也较弱，且不同剂量浓缩液的抑瘤率经统计学分析，在两种模型中无统计学差异（P > 0.05），说明浓缩液在两种模型中的抑瘤作用无差异。西药化疗组在耐药模型动物中的抑瘤效果弱于敏感模型动物，经统计学分析，差异具有显著性（P < 0.05），说明耐药模型动物对西药化疗产生了耐药性，使化疗效果下降。

为了减小浓缩液对肿瘤抑制的影响，我们选取基本无抑瘤作用的低剂量浓缩液与西药化疗联用，我们发现中西药联用后，在耐药模型动物中，其抑瘤率由联用前的46.8%恢复到了82.5%，说明浓缩液可以逆转耐药模型动物对化疗药物的多药耐药性。

上述实验表明：本发明提供的基于桂枝茯苓丸的中药组合可以逆转卵巢癌多药耐药模型对化疗药物的多药耐药性。通过细胞实验发现，这种中药组合通过抑制P-gp的功能和表达及其编码基因MDR1 mRNA 的表达，发挥其逆转卵巢癌多药耐药性的作用。