利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法

摘要

本发明公开了一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1MEFs原代获取、CF-1MEFs传代培养和CF-1MEFFeeder制备等三个步骤；制备CF-1MEFFeeder时以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，转瓶机的搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；转瓶机专用培养瓶的容积是普通培养瓶/皿的几倍甚至上百倍，培养瓶能重复使用，可节省大量细胞培养瓶/皿，降低Feeder的制备成本，提高Feeder制备效率，节约大量实验时间；另外本方法是在悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液处理，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态。

说明书

技术领域

本发明涉及一种饲养层(Feeder)细胞的制备方法，具体涉及一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法，属于体外细胞培养技术领域。

背景技术

诱导型多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）很多特性与胚胎干细胞极为相似，能分化为几乎所有的成体细胞，由于其可通过细胞重编程技术从终末分化的成体细胞得到，因此可获得患者特异性或疾病特异性的iPSCs，促使其成为研究疾病发生机制、个体化药物治疗、药物筛选和细胞治疗的热点，进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。iPSCs在长期培养过程中容易发生分化和核型不稳定情况，在长期培养过程中维持iPSCs正常不分化状态和自我更新能力是一项极具挑战性的工作。而长期培养在饲养层体系中是维持iPSCs不分化状态和核型稳定最简单、直接和有效的方法，因此制备高质量的Feeder成为培养iPSCs的关键技术。

目前，Feeder制备方法主要有γ-射线照射法和丝裂霉素（Mitomycin C，MMC）处理法：γ射线法的优点是可大批量处理细胞，但是由于γ射线存在放射性污染及储存监管程序繁琐，费用昂贵等缺点，世界上很多地区已找不到放射源，因此多数实验研究仍采用MMC法来制备Feeder。小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs），是最常用的Feeder细胞来源；而CF-1 MEFs是培养人iPSCs（hiPSCs）最常用的Feeder细胞来源，具有增殖能力极强、可覆层生长、密度依赖性高、低密度时易发生老化等特点。

传统MMC法制备CF-1 MEF Feeder时，通常需要将MEFs以较低密度铺至细胞培养皿/瓶中，待其长至≤100%融合（保证细胞为单层存在）时，用MMC抑制其有丝分裂，存在以下问题：1)产量低，成本高：利用传统方法单个细胞培养皿/瓶处理的细胞数量较少，要想得到足够数量的Feeder就需要消耗大量的实验耗材，多批量处理必然产生昂贵的费用； 2）细胞增殖抑制不充分：若提高单个细胞培养皿/瓶处理细胞的密度，会出现细胞增殖不能被充分抑制的问题；3) MEFs的生物学行为易受影响：由于CF-1 MEFs低密度时易发生老化，分泌hiPSCs必需营养因子的能力就会下降，可能影响到hiPSCs的生长状态；4）处理时间受限：为了充分抑制细胞增殖，最好在细胞生长至80%~90%融合时用MMC处理，但CF-1 MEFs增殖速度很快，易出现覆层生长从而错过最佳处理时机。为了降低Feeder的制备成本，提高细胞处理效率，降低操作者工作强度，急需一种新方法，既可以单批处理大量细胞，又能保证细胞增殖被充分抑制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液消化，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态；细胞培养瓶的容积是普通培养瓶/皿的几倍甚至上百倍，短时间内可处理大量细胞，可提高Feeder的制备效率，降低Feeder的制备成本，操作更为灵活方便。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1 MEFs原代获取、CF-1 MEFs传代培养和CF-1 MEF Feeder制备等三个步骤，其特征在于，制备CF-1 MEF Feeder以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，具体包括以下步骤：

（1）CF-1 MEFs原代(P0)获取：

I、取孕12.5天的CF-1小鼠，脱颈处死、无菌条件下取出胚胎，用10ml PBS（即磷酸盐缓冲液）清洗后放于无菌培养皿中；去除胚胎头部和内脏，用10ml PBS 清洗2次；

II、将剩余组织移至新的无菌培养皿中，用无菌剪刀将组织剪碎，每个胚胎加入1ml消化液，同时吹打数次，放入培养箱中消化5min；加入与消化液等体积的培养液终止消化后充分吹打尽量分散为单细胞；

III、将上述细胞悬液混匀后，每个T75培养瓶添加2个胚胎的细胞悬液和13ml培养液，然后将培养瓶放到培养箱中培养，培养瓶上注明细胞名称、代次P0及日期。

（2）CF-1 MEFs传代培养：

①、P0代CF-1 MEFs培养3天后，倒置显微镜下观察MEFs长满培养瓶底时，吸弃培养液，用10ml PBS 清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液将其混至覆盖整个培养瓶底部；

②、培养瓶置于培养箱中孵育3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使MEFs细胞脱落；用2ml培养液终止消化，同时轻轻吹打形成单细胞悬液；

③、将上述细胞悬液均分到3个T75瓶中（即为1:3传代培养），用培养液补至15ml进行传代，放入培养箱中继续培养；

、用此方法，将细胞传至第3代。

（3）、CF-1 MEF Feeder制备： 

A：将搅拌式细胞培养转瓶机的磁力搅拌器消毒后置于培养箱内，磁力搅拌器通过控制线与培养箱外的控制箱相连；转瓶机的专用细胞培养瓶和搅拌锤高温、高压灭菌后冷却至室温待用；

B、CF-1 MEFs培养至第3代第4天后，吸弃培养液，用10ml PBS清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使细胞脱落，添加2ml培养液终止消化，将细胞收集到同一个离心管中后计数；

C、将步骤B中收集的细胞转移到专用细胞培养瓶中，依据细胞数添加培养液至25~1000ml，将细胞密度调整至0.5×10⁶~1.3×10⁶个/ml；然后避光条件下将MMC加至上述培养液中，将MMC浓度调整至10μg/ml，充分混匀后旋紧瓶盖；

D、立即将专用细胞培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，旋松瓶盖，将控制箱上转动模式设置为10~20转/分钟，连续旋转0.5~2小时；本发明专用细胞培养瓶的盖子悬松，既可以保证细胞的无菌培养条件，又可满足细胞生存必须的氧气需求，同时培养箱内的CO₂也可以进入到培养瓶中调节内部培养液的pH；

E、旋转结束后，立即将细胞转移至50ml离心管内，放入离心机中以1000转/分钟的速度离心5~15分钟，然后吸弃离心管中上清液，去除含MMC的培养液；

    F、用PBS重悬细胞，将细胞密度调整到2×10⁵~5×10⁵个/ml，以 1000转/分钟离心5~15分钟，离心结束后，吸弃上清液；

G、按步骤F所述方法重复3次，得到需要的细胞，细胞计数后，冻存备用。

优选的，步骤A中所述的搅拌式细胞培养转瓶机，为Cell Spin 比欧细胞培养转瓶机-搅拌式-4瓶位。

优选的，步骤C中，细胞密度调整至0.6×10⁶~1×10⁶个/ml；步骤F中，细胞密度调整至3×10⁵~4×10⁵个/ml。

优选的，步骤D中，将控制箱上转动模式设置为15转/分钟，连续旋转0.5~1.5小时；步骤E中，以1000转/分钟的速度离心10分钟，尽可能减少因离心而引起的细胞丢失，同时可避免因离心时间过长和/或转速过大影响细胞状态。

优选的，步骤G中，冻存液配方各成分体积比为培养液：胎牛血清（FBS）：二甲基亚砜（DMSO）=9:10:1。

优选的，本发明所述的培养液为：以高糖DMEM培养液为基本培养液，向基本培养液中添加体积分数为10%的胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1%的L-谷氨酰胺，充分混匀后用0.22μm滤器过滤除菌后备用；所述的消化液为0.25%胰酶+0.02%EDTA。

本发明所述的利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，该方法还可以应用于细胞培养领域其它细胞制备Feeder。

本发明方法，搅拌式细胞培养转瓶机的搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下，与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；转瓶机专用培养瓶的容积有100ml、250ml、500ml、1000ml不同规格，培养瓶能重复使用，可节省大量细胞培养瓶/皿，降低Feeder的制备成本；短时间内能处理大量细胞，可提高Feeder制备效率，节约大量实验时间，操作更为灵活方便，明显降低操作者的工作强度；另外本方法是在悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液消化，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态。

附图说明

图1：按照实施例1方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后得到的Feeder细胞的显微结构图；

图2：按照实施例1方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞随时间变化的增殖统计结果；

图3：按照实施例1方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞的复苏率统计结果；

图4：按照实施例1方法、MMC处理不同时间后制备的Feeder，接种hiPSCs后，Feeder细胞和培养其上的hiPSCs的显微结构图；

图5：按照实施例2方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后得到的Feeder细胞的显微结构图；

图6：按照实施例2方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞随时间变化的增殖统计结果；

图7：按照实施例2方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞的复苏率统计结果；

图8：按照实施例2方法、MMC处理不同时间后制备的Feeder，接种hiPSCs后，Feeder细胞和培养其上的hiPSCs的显微结构图；

其中：

图1、图4、图5、图8中：A、B、C、D分别代表 MMC处理0.5h、1h、1.5h、2h；

图2中: 代表第1天，代表第3天，代表第5天，代表第7天；

图6中:  代表第1天，代表第3天，代表第5天，代表第7天。

具体实施方式

下面结合具体实施例和实施方式对本发明进行具体描述。

实施例1： 

一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括以下步骤：

（1）CF-1 MEFs原代（P0）获取：

取孕12.5天的CF-1小鼠，脱颈处死、无菌条件下取出胚胎，用10ml PBS清洗后放于无菌培养皿中；去除胚胎的头部和内脏，用10ml PBS 清洗2次；将剩余组织转移至新的无菌培养皿中用无菌剪刀剪碎，按每个胚胎1ml加入消化液，同时吹打数次，放入37℃、5％CO₂细胞培养箱中消化5min；用与消化液等体积的培养液终止消化，充分吹打尽量分离为单细胞；将上述细胞悬液混匀后，每个T75培养瓶中加入2个胚胎的细胞悬液和13ml培养液，充分混匀后将培养瓶放到培养箱中对P0代细胞进行培养。

（2）CF-1 MEFs传代培养：

P0代MEFs培养3天后，倒置显微镜下观察MEFs长满培养瓶底，吸弃培养液，用10ml PBS 清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻拍侧壁使细胞脱落；用2ml培养液终止消化，同时轻轻吹打形成单细胞悬液；将细胞以1:3的比例进行传代培养至第3代。

（3）、CF-1 MEF Feeder制备： 

A：将搅拌式细胞培养转瓶机的磁力搅拌器消毒后置于培养箱内，磁力搅拌器通过控制线与培养箱外的控制箱相连；容积为100ml的转瓶机专用细胞培养瓶和搅拌锤高温、高压灭菌后冷却至室温待用；

B、步骤（2）中的CF-1 MEFs培养至第3代第4天后，吸弃培养液，用10ml PBS清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻拍侧壁使细胞脱落，用2ml培养液终止消化，将细胞收集到同一个离心管中后计数；

C、将步骤B所收集的细胞转移到专用细胞培养瓶中，依据细胞数添加培养液至50~100ml，将细胞密度调整至0.6×10⁶~1×10⁶个/ml；然后避光条件下将MMC加至上述培养液中，MMC浓度调整至10μg/ml，充分混匀后旋紧瓶盖；

D、立即将专用细胞培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，旋松瓶盖，将控制箱上转动模式设置为15转/分钟，分别在0.5h、1h、1.5h、2h后取下培养瓶； 

E、迅速将不同旋转时间获得的细胞分别转移至50ml离心管内，放入离心机中以1000转/分钟的速度离心10分钟，分别吸弃离心管中上清液，去除含MMC的培养液；

    F、用PBS重悬细胞，将细胞密度调整到3×10⁵个/ml，以 1000转/分钟离心10分钟，离心结束后，吸弃上清液；

G、按步骤F所述方法重复3次，得到需要的细胞，细胞计数后，冻存备用。

利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h（A）、1h（B）、1.5h（C）、2h（D）后得到的CF-1 MEF Feeder，以1×10⁴~1.5×10⁴/cm²的密度复苏后其显微结构图如图1所示。

G1-检测试验1：

将上述步骤G中冻存前的细胞按1×10⁵个/孔的密度接种至24孔板中，分别于第1、3、5、7天进行细胞计数，结果如图2所示： 0h组第1、3、5、7天细胞数明显增加，有显著统计学差异，说明未用MMC处理的CF-1 MEFs能够迅速增殖；MMC处理0.5h、1h、1.5h、2h后的CF-1 MEFs在第1、3、5、7天细胞数均无明显增减，说明利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h、1h、1.5h、2h后的CF-1 MEFs增殖被充分抑制，而且细胞能在至少7天内存活而不出现明显死亡，足以满足hiPSCs正常培养时5~7天传代一次的要求。

G2-检测试验2：

将上述步骤G中冻存第1、7、21、28天的细胞复苏至T25瓶中，估算利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h、1h、1.5h、2h制备的Feeder细胞的复苏率，结果如图3所示：利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h、1h、1.5h后得到的CF-1 MEF Feeder细胞复苏率均能达到91%~95%，而MMC处理2h得到的CF-1 MEF Feeder复苏率仅为80%~83%，说明利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h~1.5h得到的Feeder细胞要优于2h。

G3-检测试验3：

将上述步骤G中冻存的细胞以2.3×10⁴~3×10⁴个/cm²的密度复苏到直径10cm的培养皿中，待细胞贴壁后换为人胚胎干细胞培养液，然后将hiPSCs接种其上，结果如图4所示：利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h（A）、1h（B）、1.5h（C）、2h（D）后得到的CF-1 MEF Feeder能很好地支持hiPSCs的生长，并能维持hiPSCs不分化生长超过10代。

通过本发明方法，一个100ml的培养瓶一次便可处理CF-1 MEFs约1×10⁸个细胞，而按照传统MMC法处理细胞的密度计算，相当于16~24个直径10cm的细胞培养皿；本发明方法相对于现有技术，短时间内能处理大量细胞，可提高Feeder制备效率，节约大量实验时间，操作更为灵活方便，明显降低操作者的工作强度；在悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液消化，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态。

实施例2：

实施例2的操作方法与实施例1相似，所不同的是：

步骤A中，细胞培养瓶的容积为1000ml；

步骤C中，依据细胞数添加培养液至800ml，将细胞密度调整至1×10⁶个/ml；

步骤F中，细胞密度调整到3.5×10⁵个/ml;

利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h（A）、1h（B）、1.5h（C）、2h（D）后得到的CF-1 MEF Feeder，以1×10⁴~1.5×10⁴/cm²的密度复苏后其显微结构图如图5所示。

G1-检测试验1：

将上述步骤G中冻存前的细胞按1×10⁵个/孔的密度接种至24孔板中，分别于第1、3、5、7天进行细胞计数，结果如图6所示：0h组第1、3、5、7天细胞数明显增加，有显著统计学差异，说明未用MMC处理的CF-1 MEFs能够迅速增殖；MMC处理0.5h、1h、1.5h、2h后的CF-1 MEFs在第1、3、5、7天细胞数均无明显增减，说明利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h、1h、1.5h、2h后的CF-1 MEFs增殖被充分抑制，而且细胞能在至少7天内存活而不出现明显死亡，足以满足hiPSCs正常培养时5~7天传代一次的要求。

G2-检测试验2：

将上述步骤G中冻存第1、7、21、28天的细胞复苏至T25瓶中，估算利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h、1h、1.5h、2h制备的Feeder细胞的复苏率，结果如图7所示：利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h、1h、1.5h后得到的CF-1 MEF Feeder细胞复苏率均能达到91%~95%，而MMC处理2h得到的CF-1 MEF Feeder复苏率仅为80%~83%，说明利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h~1.5h得到的Feeder细胞要优于2h。

G3-检测试验3：

将上述步骤G中冻存的细胞以2.3×10⁴~3×10⁴个/cm²的密度复苏到直径10cm的培养皿中，待细胞贴壁后换为人胚胎干细胞培养液，然后将hiPSCs接种其上，结果如图8所示：利用搅拌式细胞培养转瓶机MMC处理0.5h（A）、1h（B）、1.5h（C）、2h（D）后得到的CF-1 MEF Feeder能很好地支持hiPSCs的生长，并能维持hiPSCs不分化生长超过10代。

通过本发明方法，一个容积1000ml的培养瓶一次最多能处理MEFs约为1×10⁹个细胞，而按照传统MMC法处理细胞的密度计算，相当于160~240个直径10cm的细胞培养皿，可极大地提高Feeder制备效率，节约大量实验时间，明显降低操作者的工作强度。

上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。