不同饲养层对牛胚胎干细胞培养效果的影响

摘要

虽然围绕牛胚胎干细胞建系已进行了大量的研究，但迄今为止仍未建立适合牛胚胎干细胞的环境条件。探索一种适合其生长的饲养层保持未分化状态，对保证干细胞的全能性具有重要意义。本实验采用两种不同饲养层培养的牛胚胎干细胞，采用形态学鉴定、免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色、拟胚体形成OCT4、SOX2、NANOG的RT-PCR检测等方法对牛胚胎干细胞进行检测；进一步通过实时荧光定量方法检测以小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层培养的不同代次牛胚胎干细胞标志基因OCT4、SOX2、NANOG表达差异，并与两种饲养层培养的同一代次牛胚胎干细胞多潜能特征基因OCT4、SOX2、NANOG的表达量进行了比较，以求探索一种新的更适合牛胚胎干细胞生长的饲养层，为最终建立牛胚胎干细胞系提供实验依据。
　　 1.首次采用以小鼠胎儿成纤维细胞和同源的牛胎儿成纤维细胞按一定比例(5种)制成的混合饲养层培养牛胚胎干细胞。结果显示生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显；小鼠和牛胎儿成纤维细胞在1:1比例混合饲养层培养条件下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显著堆积且边缘轮廓清晰，优于其它比例组合；获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4、SSEA-1抗原表达均成阳性，分别在体外分化培养形成了拟胚体。结果表明小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1:1比例混合下制成的饲养层能更好的支持牛胚胎干细胞的体外生长，得到的克隆形态最好。
　　 2.采用国产丝裂霉素处理不同浓度的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞)作为饲养层培养牛胚胎干细胞，为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据。用10、15、20、30、40μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3、4h的STO细胞，随着传代次数的增加形态学观察STO细胞生长变化，并对生长在以STO细胞作为饲养层的牛胚胎干细胞进行OCT-4和SSEA-4免疫组化检测、碱性磷酸酶染色、体外分化形成拟胚体等实验。结果显示当丝裂霉素的浓度为15μg/mL处理3h可有效的抑制细胞分裂；STO细胞在5-10代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-4抗原表达均成阳性，且在体外培养可形成拟胚体。结果证明使用国产丝裂霉素能有效的处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能很好的保持其未分化状态。
　　 3.检测牛胚胎干细胞的多潜能特征基因-OCT-4、SOX2、NANOG表达情况，以此找到影响牛胚胎干细胞生长的主要原因。通过RT-qPCR检测以MEF为饲养层生长的第1代到第5代牛胚胎干细胞多潜能特征基因和相关因子表达差异，结果发现生长在以MEF作为饲养层上的牛胚胎干细胞随着传代的增加OCT-4、SOX2、NANOG三者表达量明显减少，导致牛胚胎干细胞自身维持多能性能力降低且促进相关分化基因的表达，这是以MEF作为饲养层培牛胚胎干细胞无法持续传代的根本原因。以两种新的饲养层即牛和小鼠胎儿成纤维混合饲养层和STO细胞培养的第五代牛胚胎干细胞进行RT-qPCR检测多潜能特征基因和相关因子表达。结果表明生长在混合饲养层和STO细胞作为饲养层上的牛胚胎干细胞的OCT-4、NANOG、SOX2的表达量相比于MEF作为饲养层获得的干细胞均有不同程度的提高，说明混合饲养层(1:1)和STO细胞饲养层在调控牛胚胎干细胞自我更新和分化过程等方面优于MEF饲养层，进一步证明了混合饲养层和STO细胞作为饲养层更适合牛胚胎干细胞的培养。