DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法

摘要

本发明涉及一种DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法，属于DNA微阵列芯片技术领域。本发明提供的方法利用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子作为标记物，结合筛选出的6条用于Ⅱ型糖尿病检测的寡核苷酸探针研制了一种可以同时检测6个与Ⅱ型糖尿病相关突变位点的微阵列芯片检测方法，实现了对模拟Ⅱ型糖尿病的DNA样品和Ⅱ型糖尿病的实际样品的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性 的方法，属于DNA微阵列芯片技术领域。

背景技术

Ⅱ型糖尿病是由遗传和环境因素共同作用而引起的一种多基因遗传异质性 疾病。从遗传学角度研究其发病机制对糖尿病前期的筛查、诊断和干预非常重 要(A genome-wide association study identified novel risk loci for type 2 diabetes.Nature.2007,445,881-885；Genome-Wide Association Analysis Identifies  Loci for Type 2Diabetes and Triglyceride Levels.Science,2007,316,1331-1336.)。 在复杂疾病的遗传机制研究中，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析能为复杂性状的遗传机制研究提供一条便捷、有效的途径。筛选能应 用于与Ⅱ型糖尿病发病有关SNPs检测的寡核苷酸探针，对Ⅱ型糖尿病的预防和 个体化治疗等具有重要的意义。

微阵列生物芯片具有样品用量少和高通量的特性，能对生命科学与医学中 的各种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体及抗原等生物活性 物质乃至细胞、组织进行高效快捷的测试和分析。例如DNA微阵列芯片已被广 泛应用到基因组学研究、药物筛选和临床检测中(Resolving Individuals  Contributing Trace Amounts of DNA to Highly Complex Mixtures Using  High-Density SNP Genotyping Microarrays.PLoS Genet,2008,4,1-9；Technology  Insight:microarrays—research and clinical applications.Nature Rev. Endocrinol.,2007,3,594-605.)。

金纳米粒子具有优良的化学稳定性和独特的光学性质。通过在金纳米粒子 表面修饰不同的生物分子(如DNA、抗体和凝集素等)作为微阵列生物芯片的 标记探针，根据其共振光散射性质，可以建立高灵敏度的生物样品检测体系。 基于微阵列芯片的共振光散射法比传统的荧光检测法具有更高的灵敏度和更好 的稳定性(Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes.Science, 2000,289,1757-1760；Nanoparticle-Based Bio–Bar Codes for the Ultrasensitive  Detection of Proteins.Science,2003,301,1884-1886.)。目前，一种金纳米粒子标 记物通常只能针对一种生物分子进行检测，因此，制备一种可以同时对多种待 测物进行检测的金纳米粒子标记物对简化微阵列生物芯片的检测方法具有重要 的意义。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供一种DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病 相关的单核苷酸多态性的方法，该方法利用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子作为 标记物，及筛选出6条用于Ⅱ型糖尿病检测的寡核苷酸探针研制了一种可以同时 检测多个与Ⅱ型糖尿病相关突变位点的微阵列芯片检测方法，实现了对模拟Ⅱ 型糖尿病的DNA样品和Ⅱ型糖尿病的实际样品的检测。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：

一种DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法，包 括以下步骤：

(1)合成6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物；

(2)筛选出用于Ⅱ型糖尿病6个突变位点检测的6条特定寡核苷酸探针；

(3)利用标准制作方法将所述特定寡核苷酸探针点样液点样到芯片上制备 得到DNA微阵列芯片；

(4)用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标和Ⅱ型糖 尿病实际样品进行检测，再用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物对检测结果 进行标记。

在上述技术方案中，步骤(1)的具体步骤如下：

6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的合成：将6条100μM巯基修饰的 寡核苷酸以SP₁:SP₂:SP₃:SP₄:SP₅:SP₆＝1.2:1.2:0.6:1:1.6:1.6的比例混合；取5μl该 寡核苷酸混合溶液与300μl 8nM的金纳米粒子混合均匀，室温静置反应10h， 再加入等体积的PBS缓冲溶液，混合均匀后反应过夜；将反应后的溶液真空离 心浓缩至100μl，通过离心提纯反应产物，获得6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子 标记物；

其中所述寡核苷酸序列分别为：

SP₁：(T₁₀)CTCTCTTACATA，SP₂：(T₁₀)ATTTAAACCTTC，

SP₃：(T₁₀)TTCCTGGTTTCA，SP₄：(T₁₀)ACTTGATGCAAT，

SP₅：(T₁₀)ATAGACTTACTG，SP₆：(T₁₀)GGCAATTAAATT。

在上述技术方案中，所述6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的平均粒径 为13nm。

在上述技术方案中，步骤(2)中所述的6个突变位点分别为：rs11196205， rs11196218，rs6585205，rs10946398，rs10811661，rs7903146；

所述的6条特定寡核苷酸探针序列分别为：

P₁：CTGCTCGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P_1A：CTGCTGGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P₂：TCGGGTGCTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P_2A：TCGGGTGTTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P₃：TCTAAGTCGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P_3A：TCTAAGTAGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P₄：GACAGCATAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P_4A：GACAGCAGAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P₅：TCATGAGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P_5A：TCATGGGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P₆：ATATAGTATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂，

P_6A：ATATAATATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂。

在上述技术方案中，步骤(3)中所述特定寡核苷酸探针点样液的点样浓度 为30μM。

在上述技术方案中，步骤(4)中所述的模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标的 浓度为500nM，所述的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的浓度为3nM。

在上述技术方案中，步骤(4)中用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖 尿病的寡核苷酸靶标和Ⅱ型糖尿病实际样品进行检测、及再用6条寡核苷酸修 饰的金纳米粒子标记物对检测结果进行标记的反应温度均为30℃。

在上述技术方案中，步骤(4)中所述的模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标序 列分别为：

T₁：TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,

T_1A:TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG，

T₂：TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T₂A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T₃：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA，

T_3A：TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA，

T₄：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T_4A：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T₅：TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT，

T_5A：TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT，

T₆：TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC，

T_6A：TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。

在上述技术方案中，步骤(4)中所述：

用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标进行检测时， 所述模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标T₁、T₂、T₃、T₄、T₅、T₆、T_1A、T_2A、 T_3A、T_4A、T_5A和T_6A的浓度分别为：0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、 50、100、500和1000nM，寡核苷酸探针P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、P_1A、 P_2A、P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的点样浓度均为30μM；

用所述DNA微阵列芯片对Ⅱ型糖尿病实际样品进行检测时，实际样品的浓 度分别为：0.5、1、5和10nM，寡核苷酸探针P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、 P_1A、P_2A、P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的点样浓度均为30μM。

在上述技术方案中，在步骤(4)之后还包括如下步骤：

将所述DNA微阵列芯片与1mL银增强溶液反应8min；

所述银增强溶液为硝酸银溶液与氢醌溶液的混合溶液，硝酸银溶液与氢醌 溶液的体积比为1:1。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的方法是以6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子作为标记物结 合筛选出来的探针制作DNA微阵列芯片，对模拟样品和实际样品进行检测(模 拟样品和实际样品即为寡核苷酸靶标)。应用本方法可实现对与Ⅱ型糖尿病相关 的模拟DNA样品和实际样品的单核苷酸多态性进行检测。

(2)本发明用于合成多条寡核苷酸修饰的金纳米粒子的方法，具有简单， 稳定，快速的特点。使用该方法合成的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物可 以同时对多个与Ⅱ型糖尿病相关的突变位点进行检测。

(3)本发明的方法筛选出多个能用于Ⅱ型糖尿病检测的特定寡核苷酸探 针，通过对单核苷酸多态性和等位基因频率的分析证明，这些特定寡核苷酸探 针对靶标寡核苷酸检测具有高特异性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1为本发明提供的方法的过程示意图。

图2用本发明的方法合成的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物与未修 饰的金纳米粒子的对比图；

其中图2a为未修饰的金纳米粒子的电镜图和溶液照片；图2b为用本发明 的方法合成的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的电镜图和溶液照片。

图3用本发明的方法对模拟Ⅱ型糖尿病6个易感基因突变位点的检测结果 图。

图4用本发明的方法对模拟Ⅱ型糖尿病6个易感基因突变位点的等位基因 频率检测结果及对应的扫描图。

图5用本发明的方法对15例Ⅱ型糖尿病实际样品的风险基因检测结果以及 相对应的扫描图。

具体实施方式

一种DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法，具 体包括以下步骤：

(1)合成6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物

将六条100μM巯基修饰的寡核苷酸以 SP₁:SP₂:SP₃:SP₄:SP₅:SP₆＝1.2:1.2:0.6:1:1.6:1.6的比例混合。取5μl该混合物与300μl 8nM的金纳米粒子混合均匀(按摩尔吸光系数为4.2×10⁸cm^-1M^-1计算)，室温静置 反应10h，加入等体积的PBS缓冲溶液(10mM PB，0.2M NaCl，pH 7.5)，混合 均匀后反应过夜。将上述溶液真空离心浓缩至100μl，通过离心(13000rpm,(9000 rpm,3×))提纯反应产物，获得6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物。将纯化 后的产物溶解在探针反应缓冲溶液(0.67×SSC，0.1％(w/v)SDS)中，在4℃ 下保存。所述6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的平均粒径为13nm。

其中所述寡核苷酸序列分别为：

SP₁：(T₁₀)CTCTCTTACATA，SP₂：(T₁₀)ATTTAAACCTTC，

SP₃：(T₁₀)TTCCTGGTTTCA，SP₄：(T₁₀)ACTTGATGCAAT，

SP₅：(T₁₀)ATAGACTTACTG，SP₆：(T₁₀)GGCAATTAAATT。

图2a为未修饰的金纳米粒子的电镜图和溶液照片；图2b为用本发明的方法 合成的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的电镜图和溶液照片。通过对比说 明我们已经将6条寡核苷酸修饰到了金纳米粒子表面。

(2)筛选出用于Ⅱ型糖尿病6个突变位点检测的6条特定寡核苷酸探针；

所述的6个突变位点分别为：rs11196205，rs11196218，rs6585205，rs10946398， rs10811661，rs7903146；

所述的6条特定寡核苷酸探针序列分别为：

P₁：CTGCTCGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P_1A：CTGCTGGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P₂：TCGGGTGCTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P_2A：TCGGGTGTTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P₃：TCTAAGTCGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P_3A：TCTAAGTAGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P₄：GACAGCATAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P_4A：GACAGCAGAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P₅：TCATGAGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P_5A：TCATGGGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P₆：ATATAGTATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂，

P_6A：ATATAATATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂。

(3)利用标准制作方法将所述特定寡核苷酸探针点样液点样到芯片上制备 得到DNA微阵列芯片；

将特定寡核苷酸探针溶于3×SSC，1.5M甜菜碱，0.005％(w/v)SDS的点 样液中。根据标准制作方法使用博奥SmartArrayer 136微阵列芯片接触式针点系 统在三维高分子D基片上点样，点样量约为1nL/点，点样浓度为30μM。将得 到DNA微阵列芯片放入反应盒中于37℃，75％相对湿度恒温恒湿培养箱中孵育 过夜。

(4)用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标(也称 为模拟Ⅱ型糖尿病DNA样品)和Ⅱ型糖尿病实际样品进行检测，再使用6条寡 核苷酸修饰的金纳米粒子标记物对检测结果进行标记；

在制作好的DNA微阵列芯片的每个子阵列中先加入25μl待测样品反应1h， 再加入3nM的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物反应1h，反应温度均为 30℃，清洗并离心甩干。

所述模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标序列分别为：

T₁：TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,

T_1A:TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG，

T₂：TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T_2A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T₃：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA，

T_3A：TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA，

T₄：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T_4A：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T₅：TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT，

T_5A：TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT，

T₆：TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC，

T_6A：TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。

用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖尿病DNA样品进行检测时，所述 模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标T₁、T₂、T₃、T₄、T₅、T₆、T_1A、T_2A、T_3A、 T_4A、T_5A和T_6A的浓度分别为：0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、 100、500和1000nM，寡核苷酸探针P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、P_1A、P_2A、 P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的点样浓度均为30μM；

用所述DNA微阵列芯片对Ⅱ型糖尿病实际样品进行检测时，实际样品的浓 度分别为：0.5、1、5和10nM，寡核苷酸探针P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、 P_1A、P_2A、P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的点样浓度均为30μM。

为了进一步提高检测灵敏度，还可以将步骤(4)所述的DNA微阵列芯片 与1mL银增强溶液反应8min；根据金纳米粒子的共振光散射原理对DNA微阵 列芯片进行检测。

所述银增强溶液为硝酸银溶液与氢醌溶液的混合溶液，硝酸银溶液与氢醌 溶液的体积比为1:1。

实施例1：模拟Ⅱ型糖尿病DNA样品的检测

结合图1，图3，图4和表1说明本实施例。

应用美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法，将固定浓度(30 μmol/L)的寡核苷酸探针(P₁-P₆)点样在基片上制备DNA微阵列芯片。通过使 用PBS(PH＝7.4，50mmol/L磷酸缓冲液+0.15mol/L氯化钠)和0.1mol/L乙 醇胺封闭芯片。并依次与寡核苷酸靶标T₁、T₂、T₃、T₄、T₅、T₆、T_1A、T_2A、 T_3A、T_4A、T_5A和T_6A的浓度分别为：0.005nM，0.01nM，0.05nM，0.1nM， 0.5nM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM和1000nM的混合物， T_1A-T_6A在混合物中所占的百分比分别为：0，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50， 70，90和100％，及3nM寡核苷酸修饰的金纳米粒子(SP_n@GNPs)，30℃各 反应1h。再进一步与1mL银增强溶液反应8分钟后使用共振光散射微阵列生 物芯片扫描仪进行检测。

图3用本实施例的方法对模拟Ⅱ型糖尿病6个易感基因突变位点的检测结 果。如图3所示，利用这个方法获得的DNA微阵列芯片可以对6个与Ⅱ型糖尿 病相关的易感基因位点进行检测。筛选出的6个位点的寡核苷酸探针对寡核苷 酸靶标检测具有高特异性。图4为利用本实施例的方法对模拟Ⅱ型糖尿病6个 易感基因突变位点的等位基因频率检测结果及对应的扫描图。图中(a)-(f) 分别对应1-6个易感基因突变位点。如图4所示，利用这一方法可以准确检测低 至0.2％的等位基因频率。

表1为本发明方法对Ⅱ型糖尿病易感基因突变位点的定量检测结果，如表1 所示，利用这一方法可以对检测模拟Ⅱ型糖尿病易感基因突变位点的检出限可 低至0.005nM。

实施例2：Ⅱ型糖尿病的实际样品检测

结合图1，图5和表1说明本实施例。

收集15例Ⅱ型糖尿病患者的血液，针对rs10811661位点进行PCR扩增。 应用美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法，将固定浓度(30μmol/L) 的寡核苷酸探针(P_n)点样在基片上制备DNA微阵列芯片。通过使用PBS (PH＝7.4，50mmol/L磷酸缓冲液+0.15mol/L氯化钠)和0.1mol/L乙醇胺 封闭芯片。并依次与不同浓度(0.5nM，1nM，5nM和10nM)的Ⅱ型糖尿病 患者血液的PCR产物，及3nM寡核苷酸修饰的金纳米粒子(SP_n@GNPs)，30 ℃各反应1h。再进一步与1mL银增强溶液反应8分钟后使用共振光散射微阵 列生物芯片扫描仪进行检测。

图5为利用本实施例方法对15例Ⅱ型糖尿病患者rs10811661位点的风险基 因进行检测的结果。如图5所示，15例患者中有11例患者的rs10811661位点 为T/C杂合基因型，2例患者为C/C纯合基因型，2例患者为T/T纯合基因型。

表1为利用本发明方法对Ⅱ型糖尿病易感基因突变位点的定量检测结果， 如表1所示，利用该方法对Ⅱ型糖尿病实际样品的的检出限可以低至0.5nM。

表1.11型糖尿病易感基因突变位点的定量检测结果

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的 限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由 此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。