一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法

摘要

本发明涉及一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸(DHA)含量的方法，其特征在于，通过选择发酵碳源来降低菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量，还可以添加外源调控因子，使菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量降低，同时对三羧酸转运体系中的苹果酸酶的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)含量大幅下降，促进DHA的大量合成，使最终所获取菌体的油脂中DHA含量最高可达55.3％。发酵碳源为1,2-丙二醇，或者1,2-丙二醇与乙醇及乙酸盐中任一种或二种的混合物，外源调控因子优选为芝麻酚，在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加；芝麻酚的添加量可为0.5-3.0mM/L。本发明方法简单易行，效果明显，可大幅提高菌体油脂中DHA含量，且易于工业化应用。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种提高裂殖壶菌油脂中二十 二碳六烯酸(DHA)含量的方法。

背景技术

二十二碳六烯酸(DHA)属于多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理 功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养素。DHA大量存 在于人体视网膜及大脑皮层的神经组织中，有促进脑部及视力发育，提高 智力，改善记忆力和视力的作用；此外，它还能阻止胆固醇在血管壁上沉 积，预防或减轻动脉粥样硬化及冠心病的发生。

裂殖壶菌(Schizochytrium)是一种优良的生产多不饱和脂肪酸油脂的资 源。目前，利用裂殖壶菌大规模发酵生产多不饱和脂肪酸油脂得到很多科 研院所和单位的关注，并对其生产过程进行了深入的研究。申请号为 201010000055.4的专利文献公开了一种海洋真菌裂殖壶菌，其中二十二碳 六烯酸甘油三酯占油脂总量的35-40％；申请号为201310571413.0的专利公 开了利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法，最终获得的DHA可 占油脂总重的42.1-45.3％；申请号为201010504635.7的专利公开了外源添 加因子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法，该方法指出，向可产DHA 的微生物培养基中添加乙酸、柠檬酸和辛伐他汀中的任意一种或几种组合 时，微生物体内的DHA含量可有效得到提高，从初始的35.51％最高可提 高到45.00％。

上述方法对裂殖壶菌发酵产DHA的工艺技术具有一定的提升，但目前 尚未有技术结合裂殖壶菌体内所特有的DHA合成路径来调控其代谢通路， 以期实现裂殖壶菌所产油脂中DHA含量的进一步提升；而且，进一步促进 DHA含量的增加，可有效提升裂殖壶菌所产油脂的品质，也间接降低了发 酵成本，增加了生产效率。

发明内容

针对现有利用裂殖壶菌发酵产DHA油脂技术的不足，本发明提供了一 种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，根据裂殖壶菌体内所 特有的DHA合成路径的特点，在裂殖壶菌发酵过程中，通过选择发酵碳源 来降低菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量，以提高裂殖壶菌所产油脂中DHA 的含量，提升DHA油脂的品质，同时，提高生产效率，并降低生产成本。

为了实现上述目的，本发明提供了一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳 六烯酸含量的方法，该方法选择发酵培养基中的发酵碳源来降低菌体内的 磷酸戊糖途径代谢通量，使裂殖壶菌体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)含量大幅下降，促进DHA的大量合成；所述发酵碳源为1,2- 丙二醇，1,2-丙二醇与乙醇，1,2-丙二醇与乙酸盐，或1,2-丙二醇、乙醇与 乙酸盐的组合中的任意一种。

作为上述技术方案的改进，该方法在发酵培养基中添加外源调控因子， 使菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量降低，同时对三羧酸转运体系中的苹果 酸酶的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内NADPH含量大幅下降，促进DHA 的大量合成。其中，外源调控因子优选为芝麻酚，在发酵培养基灭菌后， 进行过滤除菌后添加；芝麻酚的添加量可为0.5-3.0mM/L。

本发明的优点在于通过选择发酵碳源，使菌体中的磷酸戊糖途径代谢 通量下降，以及进一步同时选择发酵碳源和添加外源调控因子，使菌体内 的磷酸戊糖途径代谢通量降低，同时对三羧酸转运体系中的苹果酸酶(ME) 的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内的还原力NADPH含量大幅下降，致使 碳代谢流转向聚酮合酶路径来合成DHA，从而促进DHA的大量合成，大 幅提高裂殖壶菌油脂中DHA的含量，显著提升了DHA油脂的品质。

具体实施方式

本发明通过选择发酵碳源，以及进一步添加外源调控因子等方式，使 菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量降低，同时对三羧酸转运体系中的苹果酸 酶的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内NADPH含量大幅下降，从而促使脂 肪酸前体性物质-乙酰辅酶A向聚酮合酶途径转化。

本发明方法的具体实现步骤为：

(1)将低温冻存的裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液；

活化培养所采用的种子培养基可以采用现有技术提供的各种组分，其 优选的组分(g/L)为：葡萄糖15.0-30.0，酵母粉4.0-8.0，牛肉膏0-5.0蛋 白胨0-5.0，玉米浆2.0-6.0，MgSO₄·7H₂O 0.2-1.0，KH₂PO₄ 0.5-2.0，海水 晶10.0-20.0。

(2)将裂殖壶菌种子液按照体积百分比4％-10％(优选8％)接入发酵 培养基进行培养；

发酵培养基可以采用现有技术提供的各种组分，只是将其中作为发酵 碳源的葡萄糖替换为1,2-丙二醇，或者为1,2-丙二醇与乙醇和/或乙酸盐的 混合溶液，乙醇需经过滤除菌后加入已灭菌后的发酵培养基中，其中，乙 酸盐优选乙酸钠。

发酵培养基优选的组分(g/L)为：发酵碳源40.0-60.0，酵母抽提物 6.0-15.0，谷氨酸钠0-10.0，MgSO₄·7H₂O 0.2-1.0，KH₂PO₄ 0.5-2.0，(NH₄) ₂SO₄ 0-5.0，NaNO₃ 1.0-3.0，Na₂SO₄ 5.0-12.0。

当发酵碳源为多种物质混合时，其组份(g/L)为：

1,2-丙二醇与乙酸盐：1,2-丙二醇40-60；乙酸钠0-10；

1,2-丙二醇与乙醇：1,2-丙二醇40-60；乙醇0-10；

1,2-丙二醇、乙醇与乙酸盐：1,2-丙二醇40-60；乙醇0-10；乙酸盐0-10。

为进一步提高本发明的技术效果，可以在发酵培养基灭菌后，进行过 滤除菌后添加外源调控因子。

外源调控因子可优选芝麻酚，其添加量为0.5-3.0mM/L。

(3)结束发酵后，收集湿菌体并真空干燥，直至菌体保持恒重，并称 重。

(4)对干燥的菌体进行破壁，加入有机溶剂(如石油醚和正己烷等) 进行萃取，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，进行甲酯化后的气相检 测分析，可以得到DHA的含量。

步骤(3)、(4)均可以采用现有技术，在此不再赘述。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂 殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温 冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖15.0，酵母粉6.0，牛肉膏3.0，蛋 白胨2.0，玉米浆4.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄ 2.0，海水晶15.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以10％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇40.0，酵母抽提物6.0，MgSO₄·7H₂O  0.6，KH₂PO₄ 0.5，NaNO₃ 1.0，Na₂SO₄ 5.0；

CK(g/L)：葡萄糖40.0，酵母抽提物6.0，MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄  0.5，NaNO₃ 1.0，Na₂SO₄ 5.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示：

表1 发酵过程中菌体内的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)活性变化对比

表2 发酵过程中菌体内的NADPH含量变化对比

表3 1,2-丙二醇组和葡萄糖组发酵对比

发酵碳源1,2-丙二醇的应用，致使裂殖壶菌在发酵过程中G6PDH活性 明显下降，磷酸戊糖途径代谢通量下降明显，菌体内NADPH含量下降明 显，致使DHA含量提升明显，从而最终获得的DHA产量也相应的大幅升 高。

实施例2

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂 殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温 冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖25.0，酵母粉8.0，蛋白胨5.0，玉 米浆2.0，MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄ 1.5，海水晶10.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以8％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇50.0，酵母抽提物10.0，谷氨酸 钠5.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 3.0，NaNO₃ 2.0，Na₂SO₄  8.0；

CK(g/L)：葡萄糖50.0，酵母抽提物10.0，谷氨酸钠5.0，MgSO₄·7H₂O  0.2，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 3.0，NaNO₃ 2.0，Na₂SO₄ 8.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示。

表4 1,2-丙二醇组和葡萄糖组发酵对比

由以上结果可知，发酵碳源1,2-丙二醇的应用，可有效提高油脂中DHA 的含量，从而最终获得的DHA产量增加明显。

实施例3

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖 壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻 存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖30.0，酵母粉4.0，牛肉膏5.0， 玉米浆6.0，MgSO₄·7H₂O 1.0，KH₂PO₄ 0.5，海水晶20.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以4％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇60.0，酵母抽提物15.0，谷氨酸 钠10.0，MgSO₄·7H₂O 1.0，KH₂PO₄ 1.5，(NH₄)₂SO₄ 5.0，NaNO₃ 3.0， Na₂SO₄ 12.0；

在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加外源调控因子芝麻酚，其 添加量为0.5mM/L。

CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母抽提物15.0，谷氨酸钠10.0，MgSO₄·7H₂O  1.0，KH₂PO₄ 1.5，(NH₄)₂SO₄ 5.0，NaNO₃ 3.0，Na₂SO₄ 12.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示。

表5 发酵过程中菌体内的G6PDH活性变化对比

表6 发酵过程中菌体内的苹果酸酶(ME)活性变化对比

表7 发酵过程中菌体内的NADPH含量变化对比

表8 1,2-丙二醇+0.5mM/L芝麻酚组和葡萄糖组发酵对比

发酵碳源1,2-丙二醇及外源调控因子芝麻酚的应用，有效抑制了裂殖壶 菌中的磷酸戊糖途径和三羧酸转运体系，致使NADPH含量下降明显，在 不影响裂殖壶菌生物量及油脂含量的基础上，可明显促进DHA含量的提 高，从而DHA含量提升明显。

实施例4

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂 殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温 冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖15.0，酵母粉6.0，牛肉膏3.0，蛋 白胨2.0，玉米浆4.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄ 2.0，海水晶15.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以10％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇50.0，乙酸钠10.0，酵母抽提物 6.0，MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄ 0.5，NaNO₃ 1.0，Na₂SO₄ 5.0；

CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母抽提物6.0，MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄  0.5，NaNO₃ 1.0，Na₂SO₄ 5.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示。

表9 1,2-丙二醇+乙酸钠组和葡萄糖组发酵对比

发酵碳源1,2-丙二醇和乙酸钠的应用，有效促进了油脂中DHA的积累， 致使DHA含量提升明显，DHA产量也相应的大幅升高。

实施例5

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶 菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存 的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖15.0，酵母粉6.0，牛肉膏3.0，蛋 白胨2.0，玉米浆4.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄ 2.0，海水晶15.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以10％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇55.0，乙酸钠5.0，酵母抽提物6.0， MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄ 0.5，NaNO₃ 1.0，Na₂SO₄ 5.0；

在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加外源调控因子芝麻酚，其 添加量为1.0mM/L。

CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母抽提物6.0，MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄  0.5，NaNO₃ 1.0，Na₂SO₄ 5.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示。

表10 1,2-丙二醇+乙酸钠+1.0mM/L芝麻酚添加组和葡萄糖组发酵对比

结果表明，发酵碳源1,2-丙二醇和乙酸钠，及芝麻酚的应用，明显提高 了DHA的含量，最终获取的DHA产量也增加明显。

实施例6

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂 殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温 冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖25.0，酵母粉8.0，蛋白胨5.0，玉 米浆2.0，MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄ 1.5，海水晶10.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以8％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇50.0，乙醇10.0，酵母抽提物10.0， 谷氨酸钠5.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 3.0，NaNO₃ 2.0， Na₂SO₄ 8.0；

CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母抽提物10.0，谷氨酸钠5.0，MgSO₄·7H₂O  0.2，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 3.0，NaNO₃ 2.0，Na₂SO₄ 8.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示。

表11 1,2-丙二醇+乙醇组和葡萄糖组发酵对比

由以上结果可知，发酵碳源1,2-丙二醇和乙醇的应用，可有效提高油脂 中DHA的含量，最终发酵获得的DHA产量增加明显。

实施例7

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖 壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻 存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖25.0，酵母粉8.0，蛋白胨5.0，玉 米浆2.0，MgSO₄·7H₂O 0.6，KH₂PO₄ 1.5，海水晶10.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以8％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇55.0，乙醇5.0，酵母抽提物10.0， 谷氨酸钠5.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 3.0，NaNO₃ 2.0， Na₂SO₄ 8.0；

在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加外源调控因子芝麻酚，其 添加量为2.0mM/L。

CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母抽提物10.0，谷氨酸钠5.0，MgSO₄·7H₂O  0.2，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 3.0，NaNO₃ 2.0，Na₂SO₄ 8.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示。

表12 1,2-丙二醇+乙醇+2.0mM/L芝麻酚组和葡萄糖组发酵对比

由以上结果可知，发酵碳源1,2-丙二醇和乙醇，及调控因子芝麻酚的应 用，可有效提高油脂中DHA的含量，使最终获得的DHA产量增加明显。

实施例8

(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖 壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻 存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖30.0，酵母粉4.0，牛肉膏5.0，玉 米浆6.0，MgSO₄·7H₂O 1.0，KH₂PO₄ 0.5，海水晶20.0。

(2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以4％ 的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；

发酵培养基组分(g/L)：1,2-丙二醇40.0，乙酸钠10.0，乙醇10.0， 酵母抽提物15.0，谷氨酸钠10.0，MgSO₄·7H₂O 1.0，KH₂PO₄ 1.5，(NH₄) ₂SO₄ 5.0，NaNO₃ 3.0，Na₂SO₄ 12.0；

在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加外源调控因子芝麻酚，其 添加量为3.0mM/L。

CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母抽提物15.0，谷氨酸钠10.0，MgSO₄·7H₂O  1.0，KH₂PO₄ 1.5，(NH₄)₂SO₄ 5.0，NaNO₃ 3.0，Na₂SO₄ 12.0；

每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；

(3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行8000g离心15分钟，并 用单蒸水洗2-3次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空 度为0.9Mpa，温度为80℃条件下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重， 并称重。

(4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取1g破壁菌粉于试管中， 加入30-60沸程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收 集石油醚萃取液，并置于真空干燥箱内，于80℃，真空度为0.9Mpa条件 下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，并进行甲酯化后 的气相检测分析。

发酵结果如下所示。

表13 1,2-丙二醇+乙酸钠+乙醇+3.0mM/L芝麻酚组和葡萄糖组发酵对比

发酵碳源1,2-丙二醇，乙酸钠和乙醇的应用，及外源调控因子芝麻酚的 添加，有效抑制了裂殖壶菌中的磷酸戊糖途径和三羧酸转运体系，致使裂 殖壶菌油脂中DHA含量增加明显，从而发酵获得的DHA产量提升明显。

本发明方法适用于各种裂殖壶菌，如裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056， 于2013年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为 CCTCC M 2013459，等等。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施 例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修 改，都落入本发明保护的范围。