一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用

摘要

本发明公开了一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用。本发明公开的一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，其保藏编号为CGMCC No.9499。作为小麦赤霉病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及特基拉芽孢杆菌，特别涉及一株特基拉芽孢杆菌及其 防治禾谷镰刀菌方面的应用。

背景技术

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是禾本科作物的重要病原 菌之一，可引起麦类赤霉病(Fusarium Head Blight，FHB)，禾谷镰刀 菌为限制小麦产量的一个主要因素(Dubin,1997)。我国气候条件十分 有利于麦类赤霉病的发生，长江中下游地区常年病害造成产量损失 10％-15％，大流行年份减产近50％(黄昌等，2000)。由于全球气候变 暖以及秸秆还田、免耕栽培等耕作制度改变的影响，我国麦类赤霉病 的发生区域由长江流域迅速向西北、华北扩展(张昊，2011)，特别 是在2008、2010和2012年，全国麦类赤霉病发生十分严重，造成 了严重的产粮损失和不良的社会影响，严重威胁我国粮食安全。

禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，3,7,15三羟基 -12,13环氧单端孢霉-9烯-8酮)是存在于赤霉病菌感染麦粒中的主要 天然毒素之一。DON已被认定为最危险的自然发生食品污染物之一， 被列入国际研究的优先地位(Larsen et al.,2004)。DON可致人免疫力 下降、贫血、头痛、腹痛、恶心；致动物拒食、生长延滞和流产(Rocha  et al.,2005；Sobrova et al.,2010；Pestka,2010)。DON广泛存在并大 量污染小麦及其制品，对人畜构成很大危害，严重威胁我国食品安全。

因此，加强禾谷镰刀菌防控研究已成为保障我国粮食安全和食品 安全的迫切需求。

多年来对麦类赤霉病防治主要依靠化学农药,但随着化学农药带 来的环境问题，加之多年用药已导致病原菌抗药性禾谷镰刀菌菌株的 出现(Changjun Chen et al.，2007),使防治难度加大。虽然在赤霉病 抗性品质方面国内外投入大量的精力开展相关研究，但至今尚无理想 的高抗小麦品种(李正辉等，2007)。

生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性，相关理 论和技术的研究日益为人们所关注。特基拉芽孢杆菌营养简单，在自 然界中广泛存在,对人畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素 和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，较其他微生物更具有开 发为生物防控菌剂的潜力。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一株特 基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，其保藏编号为 CGMCC No.9499。

上述菌株在生物防治镰刀菌引起的植物病害中的应用也属于本 发明的保护范围。

上述应用中，所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。

上述任一所述的应用中，所述病害为镰刀菌引起的赤霉病或穗腐 病或根腐病。

上述任一所述的应用中，所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物 或玉米；所述麦类作物具体为小麦。

上述菌株在制备抑制镰刀菌的产品中的应用也属于本发明的保 护范围。

一种防治镰刀菌引起的植物病害的方法也属于本发明的保护范 围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为上述特基 拉芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物。

上述方法中，所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。

上述任一所述的方法中，所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。

上述任一所述的方法中，所述植物为谷物；所述谷物为麦类作物 或玉米；所述麦类作物具体为小麦。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的特基拉芽 孢杆菌不仅在平板培养时可高效抑制禾谷镰刀菌，而且在温室实验中 其防治效果高达77.4％。作为小麦赤霉病的生物防治材料，无论开发 新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。

附图说明

图1为对峙培养实验。

图2为挥发性气体抑菌实验。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细 阐述：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业 途径得到。

NB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和 NaCl，溶剂为水；蛋白胨在NB液体培养基中的浓度为1％，牛肉膏 在NB液体培养基中的浓度为0.3％，NaCl在NB液体培养基中的浓 度为0.5％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。

NA固体培养基：在NB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培 养基的比例为1.5g：100ml)，得到NA固体培养基。

PDA培养基：马铃薯200g,加入少量水煮20min，三层纱布过滤， 取滤液用水定容至1L，加入20g葡萄糖，15g琼脂，121℃高压灭菌 20min。

绿豆汤培养基：绿豆10g，加入少量水煮20min，三层纱布过滤， 取滤液用水定容至1L，分装后121℃高压灭菌20min。

磷酸盐缓冲液：由溶剂和溶质组成；溶质为磷酸二氢钾和氯化镁， 溶剂为水；磷酸二氢钾的浓度为0.004％,氯化镁的浓度为0.019％，所 述％均为质量体积百分比(g/100ml)。

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)FG1在文献“杨慧勇,李飞 凤,陆琼娴,徐剑宏,史建荣.拮抗菌株AFR0406对小麦赤霉病菌和 纹枯病菌的生物活性测定.江苏农业科学，2006(06),142-144.”中公开 过，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。

小麦石新828品种在文献“孙志军，杨晓丽，张辉，张广辉.小麦 新品种石新828选育过程及高产栽培技术.现代农业科技，2011(09)， 96-97.”中公开过，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。

实施例1、菌株的分离与鉴定

一、菌株的分离

(一)2012年6月，在超净工作台中，将10穗江苏采集的小麦 病穗放在100ml无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，然后80℃水 浴处理10分钟。

(二)将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培 养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种 环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化， 点接纯化后的菌株应用于禾谷镰刀菌对峙培养实验，结果如图1所 示。将得到的对禾谷镰刀菌拮抗能力强的一株菌命名为JS5L。

二、鉴定

(一)按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴 定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中 描述的方法，对菌株JS5L进行形态特征、培养特性和生理生化特性 鉴定，具体结果如下：

菌体的形态和生理生化特性：

在NA培养基，28℃培养1天，菌体杆状，直径约为0.6μm× 2.0-2.5μm；菌落微黄色，圆形，平滑，边缘整齐。

生理生化特征：

氧化酶：+；精氨酸双水解酶：+；明胶水解：+；淀粉水解：+； 过氧化氢酶：+；三丁酸甘油脂水解：-；硝酸盐还原：+；七叶灵水 解：+；酪素水解：+；Tween80水解：+；吲哚实验：-；脲酶：-； 柠檬酸利用：+；H2S生成：-；VP实验：+；厌氧生长：-；50℃：+；

20℃：-；pH4.0：-；pH9.0：-。

可以利用甘油、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、 L-木糖、阿东醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨 糖、L-鼠李糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙 酰葡糖胺、七叶灵、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D- 蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-棉籽糖、淀粉、木糖醇、D-龙胆二 糖、D-土伦糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿 拉伯醇、L-阿拉伯醇产酸。利用卫矛醇、苦杏仁苷、熊果苷、菊糖和 糖原产酸能力较差。

(二)16S rDNA试验

提取JS5L的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引 物进行PCR扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回 收并进行测序，测得的序列如SEQ ID No.1所示。

根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株JS5L与Bacillus sp.LB159 (GenBank登录号KJ564121.1)同源性为99％，与Bacillus sp.JX2 (GenBank登录号KF860138.1)同源性为99％，初步判定该菌为芽孢 杆菌属细菌(Bacillus sp.)。

基于以上特征，将菌株JS5L鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillus  tequilensis)。该菌株已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保 藏号为CGMCC No.9499。

实施例2、特基拉芽孢杆菌JS5L对禾谷镰刀菌的拮抗作用

采用对峙培养法检测特基拉芽孢杆菌JS5L对禾谷镰刀菌的拮 抗。

一、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)FG1菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将 菌盘挑入PDA平板中心。

二、在距PDA平板中心25mm处四点划线接种相同体积和浓度 的JS5L，以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的PDA平板为对照组，28℃培养 4-5天，观察有无抑菌带形成。每个组做三个平行。结果如表1所示。 表明，JS5L对禾谷镰刀菌有很强的抑制效果。

表1培养5天后JS5L对禾谷镰刀菌的抑制作用

(抑菌带宽度是指病原菌边缘至拮抗菌株边缘的最短距离)

实施例3、JS5L发酵液对禾谷镰刀菌的抑制效果

采用对峙培养法检测特基拉芽孢杆菌JS5L对禾谷镰刀菌的拮 抗。

一、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)FG1菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将 菌盘挑入PDA平板中心。

二、在距PDA平板中心25mm处四点打孔接种相同体积和浓度 的JS5L，以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的PDA平板为对照组，28℃培养 4-5天，观察有无抑菌带形成。每个组做三个平行。结果如表1所示。 表明，JS5L对禾谷镰刀菌有很强的抑制效果。

表2培养5天后JS5L对禾谷镰刀菌的抑制作用

(抑菌带宽度是指病原菌边缘至拮抗菌株边缘的最短距离)

实施例4、JS5L挥发性气体对禾谷镰刀菌的抑制效果

采用对峙培养法检测特基拉芽孢杆菌JS5L产生的挥发性气体对 禾谷镰刀菌的拮抗。

一、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)FG1菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将 菌盘挑入PDA平板中心。

二、在NA平板中心接种JS5L，倒扣于接有禾谷镰刀菌的平板， 以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的PDA平板为对照组，28℃培养4-5天， 观察有无抑菌效果。每个组做三个平行。结果如图2所示。表明，JS5L 可产生抑制禾谷镰刀菌的挥发性气体。

实施例5、JS5L对禾谷镰刀菌抑制效果的温室实验

一、将JS5L在NB培养基中28℃振荡过夜培养，采用磷酸盐缓 冲液稀释至浓度为2×10⁸cfu/ml。

二、将禾谷镰刀菌FG1用绿豆汤培养基振荡培养(28℃，5天)， 得到菌悬液，采用磷酸盐缓冲液稀释菌液浓度为2×10⁵cfu/ml。

三、将稀释后的JS5L与禾谷镰刀菌FG1依照1:1的比例混合， 终浓度分别为10⁸cfu/ml和10⁵cfu/ml。

四、在石新828品种的扬花早期进行麦穗中部接种，接菌体积为 10μl，作为实验组。同时以仅含有禾谷镰刀菌的磷酸盐缓冲液作为阳 性对照组，以仅接种磷酸缓冲液的作为阴性对照。每组设10个重复， 实验重复3次，结果取平均值。

禾谷镰刀菌菌悬液接种16天后，观察麦穗的发病，有麦穗干枯 发白或发红，内部籽粒不饱满、重量减轻表现的麦穗为发病麦穗。

其中赤霉病指数＝发病率×发病指数/100。

表3JS5L对禾谷镰刀菌的温室防治效果

结果如表3所示，特基拉芽孢杆菌JS5L在温室条件下能很好防 治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在 本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书 所限定的保护范围为准。