动物器官人源化的方法及人-动物嵌合体模型

摘要

本发明涉及一种动物器官人源化的方法，其通过使用高效的DTA作为毒性基因产物，构建DTA-Cre双转基因动物，植入该双转基因动物体内的人体干细胞，可以发育成人的体细胞，部分或完全替代动物体内原内脏或血液，达到人体细胞部分或完全替代动物体内目标脏器或血液的效果，并且通过使用四环素调控系统调控，可以严密控制毒性DTA的表达。通过上述方法构建的人-动物嵌合体代替传统的转基因小鼠，操作简便。此外，本发明还涉及一种使用上述动物器官人源化的方法构建得到的人-动物嵌合体模型。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种动物器官人源化的方法及使用 该方法构建的人-动物嵌合体模型。

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）属于嗜肝病毒科，嗜肝病毒都有较 强的种属特异性和组织特异性。例如人类乙肝病毒的自然宿主只有人类和少数 非人灵长类动物（如黑猩猩），通常只侵犯宿主的肝脏组织。医学实验中最常用 的实验动物小鼠因其肝脏无法感染HBV而限制了在这一研究领域的使用。而人 与动物嵌合肝脏模型正好能够解决这一难题，因为这种模型动物可以在自然情 况下感染HBV。除用于HBV研究，这一模型还可以精确地测量抗HBV载体的 效能。除应用于HBV的研究，人和动物的嵌合肝脏还可以应用于其他很多方面， 包括人类肝细胞的生产和人工肝移植等。

肝脏有一个显著的特点，即肝细胞具有增殖的潜力。在部分肝切除后，或 在病毒性肝炎中发生散在的肝细胞细胞死亡时，肝细胞的增殖可以弥补肝脏细 胞的损失直到肝脏回复原状。肝脏细胞群的这一生理控制机制已经被用来制造 人与动物嵌合肝脏：建立一种宿主肝细胞慢性死亡机制，从而产生一个增值信 号来刺激移植进来的人类肝细胞。目前已有两个动物模型建立在这种机制之上， 即尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator，uPA）转基因小鼠 模型和富马酰乙酰乙酸水解酶（fumaryl acetoacetate hydrolase，FAH）基因敲除 小鼠模型。肝细胞中uPA通常存在低水平的表达，过量的表达将导致细胞毒性 从而摧毁宿主细胞。在转基因uPA模型中，白蛋白基因启动子驱动多拷贝的uPA 基因，合成致毒剂量的uPA蛋白，结果导致宿主慢性肝细胞死亡。在FAH模型 中，因为敲除了络氨酸异化通路中的一个基因FAH，引起毒性代谢物尿激酶型 纤溶酶逐渐累积从而导致宿主慢性肝坏死。虽然上述两个模型中一致的人肝细 胞可以填补替代高达70%的宿主肝脏，但由于毒性产物累计造成子代频繁死亡 而使得这两种模型难以传代。

发明内容

基于此，有必要提供一种可以较为容易传代的且可以完全替代动物器官的 动物器官人源化的方法及使用该方法构建的人-动物嵌合体。

一种动物器官人源化的方法，包括如下步骤：

构建含有DTA基因的转基因动物以及含有Cre基因的转基因动物，其中， 所述含有DTA基因的转基因动物的启动子与DTA基因被两个LoxP和一个停止 序列隔开，由所述LoxP加上停止序列抑制表达，所述含有Cre基因的转基因动 物的Cre基因的启动子由转入动物体内特异性启动子启动的四环素依赖的反式 作用子启动；

将所述含有DTA基因的转基因动物与所述含有Cre基因的转基因动物杂交， 并对杂交后代进行基因筛选得到含有Cre基因及DTA基因的双转基因动物；

向所述含有Cre基因及DTA基因的双转基因动物体内植入人体干细胞，制 得含有人体细胞的双转基因动物；

对含有人体细胞的双转基因动物喂食或注射四环素或四环素衍生物，诱导 表达Cre，从而介导两个Loxp位点的重组，移除停止序列，启动子接近并启动 表达DTA基因，杀死动物体内目标细胞，促进人源性细胞的增生，得到人-动物 嵌合体模型。

在其中一个实施例中，所述含有DTA基因的转基因动物为由ROSA26启动 子启动表达的含有LoxP停止序列及DTA基因的动物，所述LoxP停止序列位于 所述ROSA26启动子与所述DTA基因之间。

在其中一个实施例中，所述含有DTA基因的转基因动物在所述ROSA26启 动子之后依次含有如下序列：SA剪接受体序列、LoxP停止序列、eGFP序列盒、 pFK-Neo序列盒、3个SV40poly A序列、LoxP停止序列及DTA基因序列。

在其中一个实施例中，所述动物体内特异性启动子为动物肝脏特异性启动 子白旦白基因启动子（albumin gene promoter，Alb），所述人体干细胞为人肝脏 干细胞。

在其中一个实施例中，所述含有Cre基因的转基因动物是一种TetOn调控系 统，其中TetOn调控系统所表达的反向四环素依赖的反式作用子由所述启动子 Alb启动表达，所述Cre重组酶序列位于由所述反向四环素依赖的反式作用子启 动的hCMV启动子之后且可由所述hCMV启动子启动表达。

在其中一个实施例中，所述动物体内特异性启动子为动物造血干细胞特异 性基因启动子，所述人体干细胞为人造血干细胞。

在其中一个实施例中，所述动物为小鼠、猪或山羊。

一种由上述任一实施例所述的动物器官人源化的方法构建的人-动物嵌合 体。

上述动物器官人源化的方法构建得到的人-动物嵌合体模型使用高效的DTA （白喉毒素）作为毒性基因产物，构建DTA-Cre双转基因动物，植入该双转基 因动物体内的人体干细胞，可以发育成人的体细胞，部分或完全替代动物体内 原内脏或血液，达到人体细胞部分或完全替代动物体内目标脏器或血液的效果， 并且通过使用四环素调控系统调控，可以严密控制毒性DTA的表达。通过上述 方法构建的人-动物嵌合体代替传统的转基因小鼠，操作简便。

附图说明

图1为含有DTA基因的转基因动物的基因片段示意图；

图2为含有Cre基因的转基因动物的基因片段示意图；

图3为Cre表达后的含有Cre基因及DTA基因的双转基因动物的基因片段 示意图。

具体实施方式

下面主要结合附图对发明的动物器官人源化的方法及由该方法构建得到的 人-动物嵌合体作进一步详细的说明。

一实施方式的动物器官人源化的方法，包括如下步骤：

步骤一：构建含有DTA（diphtheria tosin，白喉毒素）基因的转基因动物以 及含有Cre（Crerecombinase，来源于P1噬菌体的一种整合酶）基因的转基因动 物。其中，含有DTA基因的转基因动物的启动子与DTA基因被两个LoxP重组 序列及停止序列隔开，由LoxP加上停止序列抑制表达，含有Cre基因的转基因 动物的Cre基因的启动子由转入动物体内特异性启动子启动的四环素依赖的反 式作用子启动。

本实施方式所述的动物可以是小鼠、猪或山羊等实验动物。

在本实施方式中，该含有DTA基因的转基因动物为由ROSA26启动子启动 表达DTA基因的动物，LoxP停止序列位于ROSA26启动子与DTA基因之间。 如图1所示，具体该含有DTA基因的转基因动物在ROSA26启动子之后依次含 有如下序列：SA剪接受体序列、LoxP停止序列、eGFP序列盒、pFK-Neo序列 盒、3个SV40poly A序列（three poly A，简称tpA）、LoxP停止序列及DTA基 因序列。在正常状态下，由于LoxP停止序列的存在，DTA基因沉默不表达DTA。

动物体内特异性启动子可以为动物肝脏特异性启动子Alb或动物造血干细 胞特异性基因启动子等，对应地，后续步骤植入的人体干细胞可以为人肝脏干 细胞或造血干细胞等。可以理解，该动物体内特异性启动子还可以为动物其他 内脏器官的特异性启动子，后续步骤植入的人体细胞可以为对应的人体其他内 脏器官细胞。

具体在本实施方式中，如图2所示，该含有Cre基因的转基因动物是一种 TetOn调控系统，其中TetOn调控系统所表达的反向四环素依赖的反式作用子 （reverse tetracycline-responsive transactivator，rtTA）由动物肝脏特特异性启动 子Alb启动表达。Cre重组酶序列位于由反向四环素依赖的反式作用子启动的 hCMV启动子之后且可由hCMV启动子启动表达。hCMV的启动依赖于rtTA表 达的TetO基因序列的表达。因此，当向该动物喂食或注射四环素或四环素衍生 物后，TetO基因序列表达，从而启动hCMV启动子，进一步启动Cre重组酶序 列的表达Cre重组酶。

步骤二：将含有DTA基因的转基因动物与含有Cre基因的转基因动物杂交， 并对杂交后代进行基因筛选得到含有Cre基因及DTA基因的双转基因动物。

步骤三：向含有Cre基因及DTA基因的双转基因动物体内植入人体干细胞， 制得含有人体细胞的双转基因动物。

步骤四：对含有人体细胞的双转基因动物喂食或注射四环素或四环素衍生 物，得到人-动物嵌合体模型。

当向该双转基因动物喂食或注射四环素或四环素衍生物（如强力毒素DOX 等）后，Cre基因表达Cre重组酶，该Cre重组酶可以引起两个LoxP位点之间 的基因序列发生重组，LoxP停止序列被去除，如图3所示，从而表达DTA引起 宿主目标细胞的死亡。通过调控喂食或注射的四环素或四环素衍生物的量，可 以部分或完全去除宿主体内的目标细胞，而让植入的人体细胞得到繁衍并完全 替代宿主体内目标细胞。

该动物器官人源化的方法构建得到的人-动物嵌合体模型使用高效的DTA （白喉毒素）作为毒性基因产物替代传统的uPA和FHA，可以完全去除动物体 内目标脏器或血液细胞，达到人体细胞完全替代动物体内目标脏器或血液的效 果，并且通过使用四环素调控系统调控，可以严密控制毒性DTA的表达。通过 上述方法构建的人-动物嵌合体代替传统的转基因小鼠，操作简便。

通过该方法获得的人-动物嵌合体模型可以作为HBV的研究模型进行HBV 的发病和治疗研究，此外，该人-动物嵌合体还可以应用在其他众多领域，如：

（1）人类肝细胞来源：人类原代肝细胞在体外难以培养和传代，应用上述 人-动物嵌合体模型就可以在动物的体内不断地生成人类肝细胞。如果用体型较 大的动物制作模型，即可以为人类的肝脏移植提供充足的供体来源。

（2）其它疾病模型：用患者自身的诱导多能干细胞(induced pleuripotent stem  cell，iPS)代替脐带血干细胞作为人源性细胞来源，可以制作患者特异性肝脏疾 病动物模型，比如A型和B型血友病、高胆固醇血症，从而大大促进对这些疾 病的基因和细胞治疗研究。

（3）药物代谢动力学研究。肝脏是人体内主要的代谢器官，绝大部分的内 源性和外源性化合物都在肝内进行代谢，而人类肝细胞内的代谢酶系统与动物 的明显不同，所以该人-动物嵌合体的肝脏模型可以为人类的药物代谢动力学研 究提供一个便利的动物模型。

（4）其它器官的人-动物嵌合模型。利用制作嵌合肝脏模型的原理，可以制 作其它器官的嵌合模型，例如嵌合血液和免疫系统、嵌合心血管和神经系统； 还可以制作拥有两个嵌合器官的转基因动物，例如嵌合的肝脏和血液的双嵌合 器官动物模型，该双嵌合器官动物模型将有利于研究人类免疫系统和许多病毒 （例如HBV和HCV）的相互作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。