热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体和使用其的D-阿洛酮糖的连续制备

摘要

本发明涉及通过取代特定序列号的氨基酸改善热稳定性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。此外，本发明涉及包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体基因的重组载体，和使用所述重组载体转化的重组菌株。另外，本发明涉及使用酶突变体或重组载体制备的固定化反应器，以及使用所述固定化反应器制备D-阿洛酮糖的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及来源于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的热稳定 性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体和使用其制备D-阿洛酮糖的 方法。

背景技术

D-阿洛酮糖是一种被认为是稀有糖的单糖，因为它很少在天然材料中被 发现或以少量存在。D-阿洛酮糖具有超低能量密度和与糖类似的甜味，并且 因此被广泛用作功能性甜味剂。

D-阿洛酮糖是果糖的差向异构体并且具有非常类似于果糖的甜度和味 道。然而，与果糖不同，D-阿洛酮糖几乎不在体内代谢并且因此具有几乎零 卡路里。D-阿洛酮糖可用作减肥食品的有效成分，这是因为D-阿洛酮糖具有 抑制脂质合成所涉及的酶的活性和减少腹部肥胖的能力。另外，被广泛用作 糖替代物的糖醇(如木糖醇等)可能具有副作用，如在过度消耗的情况下导 致腹泻。相反地，已知D-阿洛酮糖实质上不具有副作用(松江(Matsue)，T.， Y.马场(Baba)，M.桥口(Hashiguchi)，K.竹下(Takeshita)，K.何森(Izumori)， 以及H.铃木(Suzuki).2001.食用D-阿洛酮糖，D-果糖的C-3差向异构体， 抑制大鼠肝脏脂肪生成酶的活性(Dietary D-psicose，a C-3epimer of D-fructose， suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats.)亚太临床营养杂志 (Asia Pac.J.Clin.Nutr.)10：233-237.；松尾(Matsuo)，T.，和K.何森2004. D-阿洛酮糖，不提供能量并且提供额外有利的临床营养作用的稀有糖 (D-psicose，a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects  for clinical nutrition.)亚太临床营养杂志13：S127)。

由于所述原因，D-阿洛酮糖作为食用甜味剂引起强烈的注意，并且对开 发食品工业中用于有效制备D-阿洛酮糖的方法存在不断增长的需求。随着开 发D-阿洛酮糖的必要性的提高，已进行许多使用常规生物学方法由果糖制备 D-阿洛酮糖的研究。作为能够将果糖转化成D-阿洛酮糖的酶，已知来源于根 癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶和来源于菊苣假单胞菌(Pseudomonas  cichorii)或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的D-塔格糖3-差向异构 酶。已知D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有比D-塔格糖3-差向异构酶更高的活 性。

属于棒状杆菌属(genus Corynebacterium)的菌株是制备包含L-赖氨酸、 L-苏氨酸和在饲料、药品、食品等中具有不同用途的多种核酸的化学物质的 工业微生物。所述棒状杆菌属的菌株是公认为安全的(Generally Recognized  As Safe；GRAS)菌株，并且具有易于被基因工程改造和大量培养的特性。 此外，棒状杆菌属菌株具有在多种加工条件下的高稳定性和与其他细菌相比 相对强大的细胞膜结构。出于这些原因，菌株具有以下生物学特性：细菌细 胞由于高糖浓度等而在高渗透压下以稳定状态存在。

[现有技术文献]

1)韩国专利第10-0744479B1号(在2007年8月1日公开)

2)韩国专利公开第10-2011-0035805A号(在2011年4月6日公开)

发明内容

技术问题

本发明的发明人发觉来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶尽 管活性高，但因低热稳定性而具有不良效用的问题，并且开发出热稳定性得 到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，使得目前作为重要的食品材料引 起高度注意的D-阿洛酮糖可被大规模工业制备，从而提供一种使用所述变异 体连续制备D-阿洛酮糖的方法。基于所述研究，本发明的发明人已得出本发 明。

确切地说，本发明旨在提供通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶 氨基酸序列的特定位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向 异构酶变异体。

本发明的一个实施例还旨在提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异 体基因的重组表达载体和一种用所述重组表达载体转化的重组菌株。

另外，本发明旨在提供一种使用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体 或重组菌株制备的填充床反应器和一种使用所述固定化反应器连续制备D-阿 洛酮糖的方法。

技术解决方案

本发明提供一种通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列 的特定位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异 体。另外，本发明提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的重组 表达载体和一种用所述重组表达载体转化的重组菌株。此外，本发明提供一 种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组菌株制备的固定化反应器和一 种使用所述固定化反应器连续制备D-阿洛酮糖的方法。

更确切地说，本发明的一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛 酮糖3-差向异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨 酸(Ile)被由亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)以及缬氨酸(Val)所构成的 族群中选出的氨基酸取代的氨基酸序列，或在氨基酸序列位置213的丝氨酸 (Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。

本发明的另一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向 异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被 由亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)以及缬氨酸(Val)所构成的族群中选出 的氨基酸取代且在氨基酸序列位置213的丝氨酸(Ser)被半胱氨酸取代的氨 基酸序列。

本发明的又一个实施例提供一种包含编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异 体的基因的重组表达载体。

本发明的又一个实施例提供用重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)pFIS-1-ATPE-2。

本发明的又一个实施例提供一种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体由 果糖制备D-阿洛酮糖的方法。

本发明的又一个实施例提供一种使用重组谷氨酸棒状杆菌 pFIS-1-ATPE-2由果糖制备D-阿洛酮糖的方法。

本发明的又一个实施例提供一种用于制备D-阿洛酮糖的固定化反应器， 包括用珠粒填充的管柱，其中D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体被固定到所述 珠粒。

本发明的又一个实施例提供一种通过将果糖溶液引入固定化反应器中制 备D-阿洛酮糖的方法。

有益效果

本发明提供一种野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的特定位置 的氨基酸被取代的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。D-阿洛酮糖3-差向异构 酶变异体具有以下优势：所述变异体在保持酶促活性的同时具有显著改善的 热稳定性，从而使得目前作为重要的食品材料引起高度注意的D-阿洛酮糖可 被更有效地大规模工业制备。

确切地说，与野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，根据本发明的D- 阿洛酮糖3-差向异构酶变异体在一般酶反应温度下具有明显延长的半衰期， 从而使得所制备的D-阿洛酮糖3-差向异构酶可被用于长时间制备D-阿洛酮 糖。因此，根据本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体可减少制备时间和 成本，从而改善制备效率。

另外，本发明提供一种用于表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体的重组 载体，和一种重组菌株，即用所述重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌 pFIS-1-ATPE-2。因此，本发明具有以下优势：提供一种用于通过使用D-阿洛 酮糖3-差向异构酶变异体或重组菌株形成固定化反应器来大规模连续制备D- 阿洛酮糖的方法。

附图说明

图1描绘了包含来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体 基因的重组表达载体。

图2是使用差示扫描量热计(DSC)描绘来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛 酮糖3-差向异构酶的野生型和变异体(S213C、I33L以及I33L-S213C)的表 观解链温度分布的图形。图形的峰值部分表示酶的表观解链温度。

图3描绘来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的野生型和变 异体(S213C、I33L以及I33L-S213C)的分子建模结果的图像。(a)和(b) 分别表示野生型和I33L-S213C变异体的二级结构。(c)和(d)分别表示野 生型和S213C变异体的氨基酸序列位置213的氨基酸(在野生型情况下的丝 氨酸(Ser)，和在S213C变异体情况下的半胱氨酸(Cys))周围的估计氢键。 (e)和(f)分别表示野生型和I33L变异体的芳基之间的相互作用。

图4是描绘在根据本发明的一个实施例的方法中使用变异体的固定化反 应器在50℃反应温度下的操作稳定性的图形。

具体实施方式

本发明提供一种通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列 的特定位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异 体。另外，本发明提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的重组 表达载体和一种用所述重组表达载体转化的重组菌株。此外，本发明提供一 种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组菌株制备的固定化反应器和一 种使用所述固定化反应器连续制备D-阿洛酮糖的方法。

在下文中将更详细地描述本发明的实施例。在此省略对此项技术或相关 领域中具有一般知识的人员显而易见的详情的描述。

本发明的一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异 构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3- 差向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被由 亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)以及缬氨酸(Val)所构成的族群中选出的 氨基酸取代的氨基酸序列，或在氨基酸序列位置213的丝氨酸(Ser)被半胱 氨酸取代的氨基酸序列。

根癌土壤杆菌是一种众所周知的菌株，并且根癌土壤杆菌ATCC33970 可被用作实例。

来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有韩国专利公 开案第10-2011-0035805A号中SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其功能片段。 如在此所用，术语“功能片段(functional fragment)”可指代在SEQ ID NO： 1的氨基酸序列中包含因部分氨基酸的取代、插入或缺失造成的突变并且具 有将果糖转化成D-阿洛酮糖的活性的片段。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体是指具有来源于根癌土壤杆菌的野生型 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列特定位置的氨基被取代的氨基酸序列 的酶。

更优选地，D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体表示氨基酸序列位置33的异 亮氨酸被亮氨酸取代。

本发明的另一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向 异构酶变异体，其中所述变异体具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile) 被由亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)以及缬氨酸(Val)所构成的族群中选 出的氨基酸取代且在氨基酸序列位置213的丝氨酸(Ser)被半胱氨酸取代的 氨基酸序列。

更优选地，D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体表示氨基酸序列位置33的异 亮氨酸被亮氨酸取代，并且氨基酸序列位置213的丝氨酸被半胱氨酸取代。

本发明的又一个实施例提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基 因的重组表达载体(图1)。

本发明的又一个实施例提供用重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌 pFIS-1-ATPE-2。

重组菌株谷氨酸棒状杆菌pFIS-1-ATPE-2根据布达佩斯条约(Budapest  Treaty)在2011年8月18日以保藏编号KCCM11204P被保藏在位于韩国首 尔西大门区弘智1-洞(Hongje1-dong，Seodaemun-ku，Seoul，Korea)的韩国微 生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)。

本发明的又一个实施例提供一种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或 重组谷氨酸棒状杆菌pFIS-1-ATPE-2由果糖制备D-阿洛酮糖的方法。

本发明的又一个实施例提供一种用于制备D-阿洛酮糖的固定化反应器， 包括用珠粒填充的管柱，其中D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组谷氨酸 棒状杆菌pFIS-1-ATPE-2被固定到所述珠粒。

术语“固定化反应器(immobilized reactor)”是指通过囊封在海藻酸盐 珠粒中的菌株或经由用囊封在海藻酸盐珠粒中的菌株或酶填充的管柱进行制 备D-阿洛酮糖的反应的反应器。即，固定化意指提供生物活性的物质(在此 情况下，D-阿洛酮糖3-差向异构酶或包含其的菌株)被固定在载体上。

作为固定酶变异体或重组菌株的载体，可使用(但不限于)相关技术中 能够用于固定酶或菌株的任何载体。优选地，可使用海藻酸钠。

海藻酸钠是海藻细胞膜中大量存在的天然胶状多糖并且由β-D-甘露糖醛 酸和α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid)组成。海藻酸钠按照含量随机形成 β-1，4-键结，并且可有利地用于菌株或酶的稳定固定。

本发明的又一个实施例提供一种通过将果糖溶液引入固定化反应器中制 备D-阿洛酮糖的方法。

如在此所用的术语“半衰期(half-life)”是指当酶或酶变异体的初始酶 反应的相对活性被假设为100时，酶或酶变异体的初始酶反应的相对活性被 减小到50所耗费的时段。

如在此所用的术语“操作稳定性(operation stability)”是指反应器可在 与初始活性相比保持连续制备所需产物(在本发明中，D-阿洛酮糖)的合适 生产率下操作的状态。操作稳定性通常由操作时间(时间单位等)表示。

在下文中，将参照以下实例和比较实例更详细地描述本发明。应了解， 这些实例仅被提供用于说明并且不以任何方式解释为限制本发明的范畴。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的测量

使用果糖作为底物测量D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性。将D-阿洛酮糖 3-差向异构酶或包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶的样品添加到含有20mM底物 的50mM哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)(piperazine-N，N′-bis(2-ethanesulfonic acid)， PIPES)缓冲溶液pH8.0中，接着在50℃下反应10分钟。向反应溶液中添加 盐酸，使得最终浓度为200mM来停止反应。使用配备有折射率(Refractive  Index，RI)检测器的HPLC测量果糖和D-阿洛酮糖的浓度。在样品被注射到 设置为80℃的管柱(BP-100Ca²⁺糖管柱)并且接着充当移动相的蒸馏水以0.5 毫升/分钟的速度流经的条件下进行HPLC分析。酶单位被定义为在pH8.0和 50℃的条件下每分钟制备1微摩尔D-阿洛酮糖的量。

实例1

通过随机诱变制备热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体

使用来源于根癌土壤杆菌ATCC33970的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(具 有与韩国专利公开案第10-2011-0035805A号中所披露的SEQ ID NO：1一致 的氨基酸序列)作为模板通过易错聚合酶链反应(易错PCR)构建D-阿洛酮 糖3-差向异构酶变异体文库。

确切地说，采用每1000个碱基对导致两个到三个突变的典型PCR诱变 试剂盒。作为引物，引入NcoI和PstI限制酶的限制酶识别位点序列的寡核苷 酸被用于进行聚合酶链反应，从而构建编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体 的基因文库，所述变异体接着插入大肠杆菌(E.coli)BL21中。

含有50微克/毫升氨苄西林(ampicillin)的LB培养基用于培养包含引入 D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的质粒，接着在37℃下培养6小时的大 肠杆菌BL21。从培养液获取一部分，转移到包含50微克/毫升氨苄西林和0.1 mM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside， IPTG)的培养基，并且接着在37℃下培养6小时以便诱导酶表达。培养液在 60℃下被热处理5分钟，接着添加果糖使得最终浓度为15mM，并且随后在 50℃下反应30分钟。接着，使用一般果糖分析试剂盒测量果糖的残余量，通 过使总共5000种变异体与野生型酶比较，选择活性比野生型酶高约1.2倍的 150种变异体。

以与上述相同的方式再次诱导所选择的150种变异体来表达酶。对所培 养的细胞进行超声波处理以破坏细胞。离心被破坏的细胞以便获得包括D-阿 洛酮糖3-差向异构酶的上清液。接着，使用上文提及的“测量D-阿洛酮糖3- 差向异构酶活性的方法”测量酶活性。作为测量结果，再选择在55℃反应温 度下展现高半衰期的23种变异体。

23种再选择的变异体的基因从pTrc99A转移到pET-24a(+)，用于转化大 肠杆菌BL21。在37℃下，在含有50微克/毫升卡那霉素(kanamycin)的LB 培养基中培养重组菌株大肠杆菌BL21。当OD₆₀₀达到0.6时，添加IPTG(异 丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷)使得最终浓度为0.1mM，接着在16℃下培养16 小时。离心培养液以便收集细菌组分，接着将所述细菌组分再悬浮于包含300 mM KCl和10mM咪唑的50mM磷酸盐缓冲液中。对悬浮溶液进行超声波处 理以粉碎细胞。离心被破坏的细胞溶液以收集包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶 的上清液，接着使用金属离子亲和色谱法纯化所述上清液。通过采用脱盐滤 筒去除被纯化的酶中的咪唑。

在55℃下测量23种再选择的变异体的半衰期。选择展现最高半衰期的 五种变异体。5种所选变异体和野生型酶的相对活性和在55℃下的半衰期概 述于表1中。

表1

D-阿洛酮糖3-差向异构酶 相对活性(％) 半衰期(分钟) 野生型 100±0.5 10±2.3 S8T 29±0.5 15±0.3 I33L 88±3.3 64±0.2 G67C 8±0.0 132±0.4 V96A 51±0.5 18±0.2 S213C 103±0.4 28±0.7

因此，降序排列的半衰期被确定为G67C＞I33L＞S213C＞V96A＞S8T。鉴于 半衰期以及酶活性，两种变异体I33L和S213C被鉴定为最优选的变异体。

使用例如I33L解释在此使用的酶变异体的命名。数字33意指野生型D- 阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列位置33的氨基酸被取代，并且所述编号两 侧的字母I和L分别意指氨基酸的首写字母。总之，I33L意指D-阿洛酮糖3- 差向异构酶氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被亮氨酸(Leu)取代。

实例2

使用合理设计制备热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体

以与实例1类似的方式，选择变异体S213C和I33L作为热稳定性得到改 善而活性并未显著减小的变异体。基于所选变异体，在氨基酸序列位置33和 213的氨基酸进行定点诱变。

确切地说，位置213的具有极性并且无电荷的丝氨酸(Ser)分别被具有 极性并且无电荷的苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)或甲硫氨酸(Met)；非极 性氨基酸脯氨酸(Pro)；具有负电荷的谷氨酸(Glu)；以及具有正电荷的赖 氨酸(Lys)取代。

位置33的不具有极性的异亮氨酸分别被具有极性并且无电荷的半胱氨 酸；非极性的缬氨酸(Val)、亮氨酸或脯氨酸；具有负电荷的谷氨酸；以及 具有正电荷的赖氨酸取代。

测量氨基酸如上所述被取代的变异体和野生型酶的相对活性和在55℃下 的半衰期。

因此，获得热稳定性得到改善同时不影响酶活性的I33L、I33C、I33V以 及S213C变异体。另外，S213C变异体与在氨基酸序列位置33氨基酸经取代 的变异体中鉴于酶活性和热稳定性为最优选变异体的I33L变异体组合，从而 获得具有卓越活性和明显得到改善的热稳定性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变 异体(I33L-S213C)。

表2概述来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶、位置 33或213的氨基酸被取代的变异体、以及位置33和213的氨基酸都被取代 的变异体的相对活性和在55℃下的半衰期。

表2

D-阿洛酮糖3-差向异构酶 相对活性(％) 半衰期(分钟) 野生型 100±0.5 10±2.3 I33L 88±3.3 63±0.2 I33C 83±2.0 24±0.6 I33V 92±2.2 12±0.4 I33E ND ND I33K ND ND I33P ND ND S213C 103±0.4 28±0.7 S213P 95±0.9 6±0.2 S213T 68±0.3 5±0.1 S213M 22±1.9 3±0.3 S213E 19±0.0 3±0.1 S213K ND ND I33L-S213C 74±1.1 265±2.3

ND：未检测到

比较实验实例1

野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶和根据实例2的D-阿洛酮糖3-差向异 构酶变异体的表观解链温度的比较

为了测定野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶和根据实例2的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶变异体(即I33L、S213C以及I33L-S213C)的热稳定性，测量 每种酶(或变异体)的表观解链温度(T_m)。

因此，可见升序排列的表观解链温度为野生型＜S213C＜I33L＜I33L-S213C (图2)。确切地说，与野生型相比，表观解链温度在S213变异体的情况下增 加约4.3℃，并且在I33L-S213C变异体的情况下增加约7.6℃。

比较实验实例2

野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶和实例2的D-阿洛酮糖3-差向异构酶 变异体的酶反应速率的比较

为了测定野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶和根据实例2的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶变异体(即I33L、S213C以及I33L-S213C)的酶反应速率，观 察每种酶(或变异体)在50℃反应温度下的动力学参数。

测量结果概述于表3中。

表3

D-阿洛酮糖3-差向异构酶 Km(mM) kcat(min^-1) k_cat/K_m野生型 44±0.4 4338±6 99±0.9 S213C 42±1.0 4194±63 101±3.0 I33L 40±0.7 4240±65 105±2.5 I33L-S213C 31±0.1 4135±99 134±3.2

作为测量每种酶的动力学参数的结果，野生型酶和变异体I33L和S213C 展现相似的值，而I33L-S213C变异体展现比野生型酶以及变异体I33L和 S213C高约1.4倍的酶催化效率(k_cat/K_m)。这是因为I33L-S213C与其他变异 体或野生型酶相比形成额外氢键和无法在野生型酶中发现的芳基之间的新堆 叠相互作用，从而形成更硬并且更致密的结构，转而增加底物亲和力(图3)。

更确切地说，鉴于分子建模结果，与野生型酶具有在氨基酸序列位置213 的丝氨酸和在氨基酸序列位置33的异亮氨酸(这两种氨基酸不存在于酶的活 性位点而是表面)不同，发现I33L-S213C在氨基酸序列位置213的半胱氨酸 与位置33的亮氨酸(Leu)之间形成卷曲螺旋相互作用(图3的(a)、(b))。 已知所述卷曲螺旋相互作用稳定蛋白质的结构。

另外，已知在野生型酶的氨基酸序列位置213的丝氨酸形成两个假定氢 键。然而，对于其中在氨基酸序列位置213的丝氨酸被半胱氨酸取代的S213C， 可见假定氢键增加到六个(图3的(c)、(d))，这也被确定使得蛋白质结构 更致密，有助于增加热稳定性。

另外，在分子建模中，野生型酶似乎在芳基之间不具有相互作用。相反 地，可见I33L变异体在芳基之间展现堆叠相互作用(图3的(e)、(f))。已 确定，芳基之间的堆叠相互作用为增加热稳定性的因素。

实例3

用包含根据实例2的I33L-S213C变异体基因的重组载体转化的重组菌株 的制备和培养

(1)重组菌株的制备

使用根据实例2的I33L-S213C变异体的DNA作为模板和引入PstI和 XbaI限制酶识别位点序列的寡核苷酸作为引物，通过聚合酶链反应扩增编码 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因。为了大规模表达由扩增基因编码的D-阿洛 酮糖3-差向异构酶，通过将由限制酶PstI和Xba I切割的扩增PCR产物插入 来源于属于棒状杆菌属的细菌的穿梭载体pCJ-1(在2004年11月6日以保藏 编号KCCM-10611保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)，这是国际保藏机构) 构建重组表达载体pFIs-1-ATPE-2(图1)。

使用电穿孔法通过转化将重组表达载体引入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中来制备能够表达编码来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构 酶的基因的重组菌株。

重组菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌pFIS-1-ATPE-2，并且在2011年8月 18日以保藏编号KCCM11204P被保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)。

(2)培养重组菌株

上述(1)中获得的重组菌株以OD₆₀₀＝0.1的初始浓度被接种到含有10 微克/毫升卡那霉素的MB培养基(10克/升胰化蛋白胨(Bacto-tryptone)、5 克/升细菌用酵母提取物、5克/升NaCl、5克/升大豆蛋白胨)，接着在30℃下 培养24小时以诱导D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体的表达。所获得的培养 液以OD₆₀₀＝0.6被接种到用含有10微克/毫升浓度的卡那霉素的突变培养基 (8克/升葡萄糖、20克/升大豆蛋白胨、10克/升(NH₄)₂SO₄、1.2克/升KH₂PO₄、 1.4克/升MgSO₄)填充的发酵罐，在30℃下培养20小时。

实例4

根据实例3的重组菌株的固定和通过固定化反应器的D-阿洛酮糖的连续 制备

在培养根据实例3的重组菌株后，通过离心培养液收集细菌细胞。将所 收集的细胞悬浮于50mM EPPS缓冲溶液(pH8.0)中以使得所收集的细胞的 浓度为20％。将悬浮的重组菌株的细菌细胞添加到2％(v/v)海藻酸钠水溶 液中。借助于注射泵和真空泵将混合溶液逐滴添加到100mM CaCl₂溶液中， 生成细菌细胞-海藻酸盐结合物，其中所述细菌细胞被截留在海藻酸钠珠粒 中。使用通过用固定在海藻酸钠的重组菌株填充填充床管柱所形成的固定化 反应器来连续制备D-阿洛酮糖。

比较实验实例3

使用野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化反应器和根据实例4的固 定化反应器的操作稳定性的比较

为了测量使用野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化反应器和根据实 例4的固定化反应器的操作稳定性，将反应温度设置为50℃，并且通过相应 反应器连续制备D-阿洛酮糖两个月，并且随后测量D-阿洛酮糖的活性。果糖 的浓度为480克/升并且流动速率为850毫升/小时。

因此，与使用野生型的固定化反应器相比，可见使用热稳定性和酶活性 得到改善的变异体的固定化反应器保持高操作稳定性超过两个月。确切地说， 使用野生型的固定化反应器展现约30天的半衰期，而使用I33L-S213C变异 体的固定化反应器展现约77天的半衰期(图4)。

因此，预期根据本发明的酶可长期使用，从而降低D-阿洛酮糖的生产成 本。

保藏的微生物或是其他生物性物质的标示事项

(专利合作条约规则第13条之2)

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表PCT/RO/134(1998年7月：2004年1月再版)