基于卵裂球的卵裂和形态的胚胎质量评估

摘要

本发明涉及一种基于所观测到的细胞卵裂的发生时间和持续时间以及相关的细胞形态来选择用于体外受精的胚胎的方法和系统，尤其涉及一种用于确定胚胎质量的方法，所述方法包括监测胚胎一段时间，以及测定所述胚胎的一个或多个质量标准，其中所述一个或多个质量标准是基于在所述胚胎从四个卵裂球发育成八个卵裂球时细胞分裂发生时间的不规则程度，和/或基于对卵裂成五卵裂球胚胎的时间(t5)进行测定并且其中t5在48.7小时与55.6小时之间，和/或基于两个时间间隔的比率，所述两个时间间隔中的每一个被测定为从受精到八个卵裂球的胚胎发育中两个形态学事件之间的时间段的持续时间，以及基于所述一个或多个质量标准确定胚胎质量。

说明书

本申请是申请日为2012年5月31日、发明名称为“基于卵裂球的卵裂和 形态的胚胎质量评估”的中国专利申请号201280035768.1的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种基于所观测到的细胞卵裂的发生时间和持续时间以及相关 的细胞形态来选择用于体外受精的胚胎的方法和系统。

背景技术

不育症累及全球超过8000万人。据估计，所有夫妻中的10％遭遇原发性或 继发性不育症(Vayena等,2001)。体外受精(IVF)是一种可选择的医学治疗手段， 可以为不能够以其他方式怀孕的夫妻提供受孕的机会。它是一种将卵细胞(卵母 细胞)从女性的卵巢中取出，然后在实验室中用精子使其受精的过程。然后将在 这个过程中形成的胚胎放入子宫当中以进行潜在植入。为了避免多胎妊娠和多 胞胎，仅移植几个胚胎(通常少于四个而理想地仅有一个(Bhattacharya等,2004))。 选择适用于移植的胚胎是任何IVF治疗中的一个关键步骤。当前的选择程序大 部分完全基于在发育期间不同的时间点对胚胎进行的形态学评价，并且特别是 基于在移植时使用标准立体显微镜所进行的评价。然而，已普遍认识到，该评 价程序需要定性以及定量方面的改良。

一种途径是利用向二细胞期的‘早期卵裂’(即在授精/注射后25小时至27小 时之前)作为质量指标。在这种途径中，在受精后25小时至27小时对胚胎进行 目视检查以确定第一次细胞卵裂是否已经完成。然而，虽然早期卵裂以及其他 早期标准可能是关于发育成胚胎的质量指标，但是仍然需要关于成功植入并且 从而因此成功怀孕的质量指标。

在该申请或本申请中所引用的所有专利和非专利参考文献也特此以引用的 方式整体并入本文。

发明内容

先前的研究经常集中于胚胎基因组活化之前的胚胎发育。然而，本申请的 发明人已经发现对其中发生胚胎基因组活化的后续卵裂的发生时间和持续时间 进行监测可以产生另外的质量标准(有时被称为“后期标准”)，这些质量标准对胚 胎选择以便提高植入的成功性非常有用。因此，本发明涉及一种有助于在体外 受精(IVF)之后基于所观测到的细胞卵裂的发生时间和持续时间选择待转移以进 行植入的最佳胚胎的方法和系统。

在第一方面，本发明涉及一种用于确定胚胎质量的方法，所述方法包括监 测胚胎一段时间，以及测定所述胚胎的一个或多个质量标准，以及基于所述一 个或多个质量标准确定胚胎质量。具体来说，可以将本发明应用于人类胚胎， 并且所获得的胚胎质量量度可以用于识别和选择适于移植到女性子宫中以便提 供妊娠和活产婴儿的胚胎。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种用于确定胚胎质量的方法，所 述方法包括监测胚胎一段时间，以及测定所述胚胎的一个或多个质量标准，其 中所述一个或多个质量标准是基于在所述胚胎从四个卵裂球发育成八个卵裂球 时细胞分裂发生时间的不规则程度，和/或其中所述一个或多个质量标准是基于 对卵裂成五卵裂球胚胎的时间(t5)进行测定并且其中t5为48.7小时到55.6小时， 和/或其中所述一个或多个质量标准是基于两个时间间隔的比率，所述两个时间 间隔中的每一个被测定为从受精到八个卵裂球的胚胎发育中两个形态学事件之 间的时间段的持续时间，以及基于所述一个或多个质量标准确定胚胎质量。

因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于选择适于移植的胚胎的方法， 所述方法包括如上文所定义对胚胎进行监测，从而获得胚胎质量量度，以及选 择具有最高胚胎质量量度的胚胎。

在另一个方面，本发明涉及一种系统，所述系统具有用于实施上述方法的 装置。所述系统可以是任何适合的系统，如包括构成用于执行如上文所述的方 法的工具的计算机代码部分的计算机。所述系统可以进一步包括用于以不同的 时间间隔获取胚胎图像的装置，如2006年10月16日提交的名称为 “Determination of a change in a cell population(对细胞群体变化的测定)”的未决 PCT申请中所述的系统。

在又另一个方面，本发明涉及一种数据载体，所述数据载体包括构成用于 执行如上文所述的方法的工具的计算机代码部分。

附图说明

图1：卵裂型的命名，示出了与所获得的图像有关的卵裂时间(t2-t5)、细胞 周期持续时间(cc1-cc3)以及同步性(s1-s3)。

图2：具有参数t5-s2-cc2的分层决策树。

图3：基于以下各项的具有参数t5-s2-cc2的示意性分层决策树：i)形态学筛 选；ii)不存在排除标准；iii)细胞分裂成五个细胞的发生时间(t5)；iv)从二细胞期 至四细胞期的分裂同步性s2，即三细胞期的持续时间；v)第二细胞周期的持续 时间cc2，即分裂至三细胞期与分裂至五细胞期之间的时间。所述分类产生了预 期植入潜能递增(从右到左)并且每个当中胚胎数目几乎相等的十个胚胎等级。

图4：t2：卵裂成二卵裂球胚胎的时间。

图5：示出了直接卵裂成三卵裂球胚胎的一系列图像。从1个细胞卵裂成3 个细胞在一帧中出现。

图6a：在二细胞期(第二细胞周期)时卵裂球大小不均匀。图6b：在二细胞 期时卵裂球大小均匀。

图7：在四细胞期时的多核卵裂球。

图8：在受精后给定时间内完成细胞分裂的胚胎的百分比。蓝色曲线呈现了 能够植入的胚胎，红色曲线表示不能植入的胚胎。每种颜色的四条曲线表示从 一个细胞到五个细胞的四次连续细胞分裂(即t2、t3、t4以及t5)的完成。

图9：61个能够植入的胚胎(阳性，蓝点)以及186个不能植入的胚胎(阴性， 红点)的细胞分裂成五个细胞的发生时间t5的分布。左图示出了卵裂时间的总体 分布。短的蓝线标定了标准偏差、平均值以及平均值的95％置信界限。红色方 框表示每一类胚胎的四分位数。右图示出了在曲线图上被绘制成正态分位数的 对于两种类型的胚胎(红色＝不植入的，蓝色＝植入的)所观测到的t5卵裂时间的 分布，在所述曲线图上，正态分布以直线表示。两条拟合线表示对应于两种类 型胚胎的正态分布。

图10：具有在由总数据集的四分位数界限所界定的范围以内或以外的细胞 分裂时间的能够植入的胚胎的百分比。三张图示出了关于以下各项的范围和植 入率：i)分裂成2个细胞，t2；ii)分裂成3个细胞，t3；以及分裂成5个细胞，t5。 由于所述范围的界限被界定为四分位数，所以每个柱形图表示相同数目的具有 已知植入结果的经过移植的胚胎，但是相对于在所述范围以外的胚胎，在所述 范围以内的胚胎的植入频率显著更高。

图11：细胞分裂参数低于或高于中值的能够植入的胚胎的百分比。两张图 示出了针对以下各项的分类：i)第二细胞周期的持续时间cc2；ii)从二细胞期分 裂至四细胞期的同步性s2。由于界限被界定为所有247个所研究的具有已知植 入结果的胚胎的中值，所以每个柱形图表示相同数目的经过移植的胚胎并且参 数值低于中值的胚胎的植入频率显著更高。

图12：参数t2、t3、t4、t5、cc2、cc3以及s2的高植入组和低植入组中的 植入率。图13：关于t2被分成四分位数并且每个四分位数具有所述预期值的已 知植入数据(参见实施例2)(左侧图表)。在这些四分位数组中，由具有相似概率 的三个相邻四分位数Q1、Q2以及Q3形成了新的目标组(右侧图表)-参见实施例 2。

图14：关于cc2和cc3的成功植入(三角形)和不成功植入(圆形)的KID数据， 图解了排除标准的有用性。

图15：使用从t2开始往后的质量标准和排除标准建立的决策树模型。

图16：使用从t4开始往后的质量标准和排除标准(即仅后期标准)建立的决 策树模型。

定义

卵裂时间被定义为第一次观测到新形成的卵裂球由汇合的细胞膜完全分开 的时间点，卵裂时间因此是卵裂球卵裂完成的时间。在本发明的上下文中，所 述时间被表示为胞质内精子注射(ICSI)显微注射后的小时数，即受精时间。因 此，卵裂时间如下：

t2：卵裂成二卵裂球胚胎的时间

t3：卵裂成三卵裂球胚胎的时间

t4：卵裂成四卵裂球胚胎的时间

t5：卵裂成五卵裂球胚胎的时间

t6：卵裂成六卵裂球胚胎的时间

t7：卵裂成七卵裂球胚胎的时间

t8：卵裂成八卵裂球胚胎的时间

细胞周期的持续时间的定义如下：

cc1＝t2：第一细胞周期。

cc2＝t3-t2：第二细胞周期，即呈二卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间。

cc2b＝t4-t2：两个卵裂球的第二细胞周期，即呈二卵裂球胚胎和三卵裂 球胚胎形式的时间段的持续时间。

cc3＝t5-t3：第三细胞周期，即呈三卵裂球胚胎和四卵裂球胚胎形式的时 间段的持续时间。

cc2_3＝t5-t2：第二和第三细胞周期，即呈二卵裂球胚胎、三卵裂球胚胎 以及四卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间。

cc4＝t9-t5：第四细胞周期，即呈五卵裂球胚胎、六卵裂球胚胎、七卵裂 球胚胎以及八卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间。

同步性的定义如下：

s2＝t4-t3：从二卵裂球胚胎分裂成四卵裂球胚胎的同步性。

s3＝t8-t5：从四卵裂球胚胎分裂成八卵裂球胚胎的同步性。

s3a＝t6-t5；s3b＝t7-t6；s3c＝t8-t7：牵涉到从四卵裂球胚胎发育成八卵 裂球胚胎的单个细胞分裂的持续时间。

卵裂期：从首次观测到细胞膜中出现凹陷(指示胞质卵裂开始)到胞质细胞 卵裂完成，以使得卵裂球由汇合的细胞膜完全分开的时间段。也被称作胞质分 裂的持续时间。

受精和卵裂是胚胎至少到八卵裂球期为止的主要形态学事件。卵裂时间、 细胞周期、分裂的同步性以及卵裂期是可以根据这些主要的形态学事件加以定 义的形态学胚胎参数的实例，并且这些形态学胚胎参数中的每一个均被定义为 例如以小时测量的两个形态学事件之间的时间段的持续时间。

归一化的形态学胚胎参数被定义为两个形态学胚胎参数的比率，例如cc2 除以cc3(cc2/cc3)，或cc2/cc2_3或cc3/t5或s2/cc2。

可以使用如下离散(二元)变量：

MN2：在二卵裂球期观测到的多核现象；可以取值“真”或“假”。

MN4：在四卵裂球期观测到的多核现象；可以取值“真”或“假”。

EV2：二卵裂球胚胎中卵裂球的均匀性；可以取值“真”(即均匀)或“假” (即不均匀)。

细胞位置的重排＝细胞运动(参见下文)

细胞运动：细胞中心和外部细胞膜的运动。细胞器在细胞内的内部运动不 是细胞运动。外部细胞膜是动态结构，因此细胞界限将连续轻微地变换位置。 然而，这些轻微的变动也不被认为是细胞运动。当细胞的重心和该细胞相对于 其他细胞的位置发生变化时以及细胞分裂时发生细胞运动。可以通过计算运动 中的细胞的两个连续数字图像之间的差异来对细胞运动进行定量。这种定量的 实例详细描述于2006年10月16日提交的名称为“Determination of a change  in a cell population(对细胞群体变化的测定)”的未决PCT申请中。然而， 测定细胞重心和/或细胞质膜位置运动的其他方法可以例如通过使用 FertiMorph软件(丹麦哥本哈根的ImageHouse Medical公司(ImageHouse  Medical,Copenhagen,Denmark))半自动地勾勒出在穿过胚胎的连续光学断面 中每个卵裂球的界限来设想。

细胞器运动：可以通过显微镜检查法看到的胚胎内的内部细胞器和细胞器 膜的运动。在本申请的上下文中，细胞器运动不是细胞运动。

运动：物体的空间重排。通过多种不同的参数来对运动进行表征和/或定量 和/或描述，所述参数包括但不限于：运动程度、运动中所牵涉到的面积和/或 体积、旋转、平移向量、运动的取向、运动的速度、大小调整、胀大/缩小等。 细胞或细胞器运动的不同量度因此可以被用于不同的目的，这些量度中的一些 反映了运动的程度或幅度，一些反映了运动物体的空间分布，一些反映了运动 所波及的轨迹或体积。

胚胎质量是所述胚胎在移植之后能够成功地在子宫中植入和发育的能力的 量度。高质量的胚胎在移植后将成功地在子宫中植入和发育，而低质量的胚胎 则不会。

胚胎存活力是所述胚胎在移植后能够成功地在子宫中植入和发育的能力的 量度。高存活力的胚胎在移植后将成功地在子宫中植入和发育，而低存活力的 胚胎则不会。存活力与质量在本文中可互换使用。

胚胎质量(或存活力)量度是意图反映胚胎质量(或存活力)的参数，因此具 有高质量参数值的胚胎具有较高的概率成为高质量(或存活力)的胚胎，而具有 较低的概率成为低质量(或存活力)的胚胎。然而，具有相关的低质量(或存活力) 参数值的胚胎仅具有较低的概率成为高质量(或存活力)的胚胎，而具有较高的 概率成为低质量(或存活力)的胚胎。

具体实施方式

质量确定

对于可以预测胚胎发育和体外受精(IVF)治疗结果的预后因素的寻找已经吸 引了相当多的研究关注，这是因为对这些因素的了解预期可能会提高未来的IVF 治疗。如上文所述，一个有前景的预测因素是早期胚胎发育中的关键事件的精 确发生时间。涉及成像在内的研究已经局限于对早期发育(如原核形成和融合) 以及到第一次卵裂的时间进行测量(Nagy,Z.P.1994；Fenwick,J.2002；Lundin,K. 2001；Lemmen,J.G.2008)。延时(time-lapse)分析的一项重要发现是到四细胞 期为止的早期卵裂型态与后续向胚泡期发育之间存在相关性。也已经公布了对 牛胚胎发育进行的形态动力学分析，其中早期胚胎发育中的细胞卵裂之间的发 生时间、持续时间以及时间间隔成功地预测了后续向扩张型胚泡期的发育 (Ramsing 2006；Ramsing 2007)。

本发明人已经进行了一项大型临床研究，所述研究牵涉到大量的人类胚胎， 并且不仅对发育进行监测直到形成胚泡为止，还进一步对发育进行监测直到出 现胚胎植入的体征为止。在这项研究中，观测到植入的胚胎(即被移植并且随后 成功植入的胚胎)与不植入的胚胎(即被移植但不能成功植入的胚胎)之间在发育 的时间模式上存在重要的差异。

已发现，对于对胚胎细胞分裂进行表征的参数存在最佳的时间范围。与发 育更快或更慢的胚胎相比较，在中间时间点发生卵裂的胚胎显著提高了继续植 入的概率。这些观测结果支持了如下的假设：胚胎的存活力与从受精时间开始 的一系列受到高度调节的细胞事件有关。在这项对特别优质胚胎进行的大型临 床研究中，已确定胚胎植入的能力与许多不同的细胞事件相关，所述细胞事件 例如细胞分裂的发生时间和分裂之间的时间以及不均匀的卵裂球大小和多核现 象。模型的复杂度、结构以及参数必须可适应于不同的临床情况，如孵育温度、 移植时间、培养基以及其他情况。胚胎发育中早期事件的发生时间与发育成胚 泡相关，然而已发现，发育成胚泡未必与胚胎的成功植入相关。通过使用植入 作为终点，不仅对胚胎形成胚泡的能力进行评估，还对后续非常必要的过程进 行评估，所述过程如孵化以及在子宫中成功植入。

因此，所述数据允许对植入潜能的后期发育标准进行检测。结果特别地指 示了后期事件(如卵裂至五细胞期)的发生时间是植入潜能的一贯良好的指标，并 且相对于早期事件(t2、t3以及t4)，在使用后期细胞分裂事件(例如t5)时，可以 提高在能够植入的胚胎与不能植入的胚胎之间进行辨别的能力。所提供的数据 指示将胚胎孵育至第3天，就能够对细胞在完成第三细胞周期后从五个细胞分 裂成八个细胞的发生时间进行评价，从而可以提供提高对具有高植入潜能的有 活力的胚胎进行选择的能力的另外的重要信息。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于确定胚胎质量的方法，所述方法 包括将所述胚胎监测一段时间，以及测定所述胚胎的一个或多个质量标准，以 及基于所述质量标准确定胚胎质量。在本发明上下文中，胚胎质量是与植入成 功性有关的质量。

选择标准(质量标准)可以是基于单个变量、复合变量(可以由其他变量计算 的变量)以及多个变量(同时较多个变量)。

本文所用的质量标准优选地是与从二卵裂球胚胎到八卵裂球胚胎的阶段有 关的标准，特别是与从四卵裂球胚胎到八卵裂球胚胎的阶段有关的标准，并且 因此，本发明的质量标准可以是对于卵裂成五卵裂球胚胎、六卵裂球胚胎、七 卵裂球胚胎和/或八卵裂球胚胎的时间的测定。

本发明的质量标准优选地是从受精开始48小时到72小时的时间段内所获 得的标准。如上文所述，在受精时启动时钟，所述受精时在本发明的上下文中 的意思是如通过ICSI显微注射法注射精子的时间。优选地，对胚胎进行监测包 括至少三个细胞周期，如至少四个细胞周期的一段时间。

具体来说，已发现卵裂成五卵裂球胚胎的时间对于植入成功性有十分重要 的影响，并且因此，质量标准优选地是对于卵裂成五卵裂球胚胎的时间(即t5) 的测定。如下文所示，t5应当优选地在从受精开始47-58小时的范围内，更优选 地在从受精开始48-57小时的范围内，更优选地在从受精开始48.7-55.6小时的 范围内。

卵裂成二卵裂球胚胎的时间对于植入成功性有十分重要的影响，并且t2应 当优选地少于从受精开始32小时，更优选地少于从受精开始27.9小时。在本发 明的另一个实施方案中，t2≥24.3小时。

卵裂成三卵裂球胚胎的时间对于植入成功性可能有影响，并且t3应当优选 地少于或等于从受精开始40.3小时。在本发明的另一个实施方案中，t3≥35.4小 时。卵裂成六卵裂球胚胎的时间对于植入成功性可能有影响，并且t6应当优选 地少于从受精开始60小时。

卵裂成七卵裂球胚胎的时间对于植入成功性可能有影响，并且t7应当优选 地少于从受精开始60小时。

卵裂成八卵裂球胚胎的时间对于植入成功性可能有影响，并且t8应当优选 地少于从受精开始60小时，更优选地少于从受精开始57.2小时。呈二卵裂球胚 胎形式的时间段的持续时间，即第二细胞周期cc2＝t3-t2，对于植入成功性可能 有影响并且cc2应当优选地少于12.7小时。

呈二卵裂球胚胎和三卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间，即两个卵裂球 的第二细胞周期cc2b＝t4-t2，对于植入成功性可能有影响，并且cc2应当优选地 少于12.7小时。在本发明的另一个实施方案中，cc2>5小时。

呈三卵裂球胚胎和四卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间，即cc3＝t5-t3， 对于植入成功性可能有影响，并且cc3应当优选地少于或等于16.3小时。在本 发明的另一个实施方案中，cc3≥5小时或cc3≥12.9小时。

呈二卵裂球胚胎、三卵裂球胚胎以及四卵裂球胚胎形式的时间段的持续时 间，即cc2_3＝t5-t2，对于植入成功性可能有影响，并且cc2_3应当优选地少于 或等于28.7小时。在本发明的另一个实施方案中，cc2_3≥24小时。

从二卵裂球胚胎分裂成四卵裂球胚胎的同步性，即s2＝t4-t3，对于植入成功 性可能有影响，并且s2应当优选地少于1.33小时或少于0.33小时。

从四卵裂球胚胎分裂成八卵裂球胚胎的同步性，即s3＝t8-t5，对于植入成功 性可能有影响，并且s3应当优选地少于2.7小时。

多个变量

在挑选选择标准时，可以使用多个变量。在使用多个变量时，优势可能在 于逐步地对变量进行选择，以使得最初可以选择在早期能够以高准确度测定的 一个或多个变量，例如t2、t3、t4或t5。随后，可以使用可能更难以测定并且与 更高的不确定性相关联的其他变量(例如多核现象、细胞的均匀性以及后期发生 时间(例如在t5之后))。

除t5之外，还可以增添其他标准来确定胚胎质量。在一个实施方案中，将 本发明的质量标准与对第二细胞周期持续时间的测定相结合以便确定胚胎质 量。在另一个实施方案中，将本发明的质量标准与对从二卵裂球胚胎卵裂成四 卵裂球胚胎的同步性的测定相结合。

因此，在一个实施方案中，通过将对卵裂成五卵裂球胚胎的时间的测定与 对第二细胞周期长度的测定相结合来确定胚胎质量。

此外，可以结合三个不同的标准，例如因此可以将对卵裂成五卵裂球胚胎 的时间的测定和对第二细胞周期长度的测定与对从二卵裂球卵裂的同步性的测 定相结合。

归一化的参数

在本发明的一个实施方案中，胚胎质量标准选自归一化形态学胚胎参数的 群组，特别是基于选自t2、t3、t4、t5、t6、t7以及t8的群组的两个、三个、四 个、五个或更多个参数的归一化形态学参数的群组。通过对参数进行归一化， 可以从胚胎质量评估中“去除”受精时间。此外，归一化的形态学胚胎参数可以更 好地描述具体的胚胎发育速率的均一性和/或规则性而无需考虑环境条件，这是 因为使用归一化的参数能够确保可以将具体的时间间隔比率与“整体上”测定的 归一化参数相比较，而非与可能取决于局部环境条件的“整体上”测定的绝对时间 间隔相比较，从而提供关于胚胎发育的额外的信息。举例来说，比率cc2/cc3可 以指示第二细胞周期的持续时间是否(相对地)对应于第三细胞周期的持续时间， cc2/cc2_3提供了呈二卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间相对于呈二卵裂球胚 胎、三卵裂球胚胎以及四卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间的关系，s2/cc2 提供了从二卵裂球到四卵裂球的同步性相对于呈二卵裂球胚胎形式的时间段的 持续时间的关系，并且cc3/t5提供了第三细胞周期的持续时间相对于卵裂成五 卵裂球胚胎的时间的关系。

在本发明的一个实施方案中，归一化的形态学胚胎参数 cc2/cc2_3＝1-cc3/cc2_3＝(t3-t2)/(t5-t2)应当为0.41-0.47。

在本发明的一个实施方案中，归一化的形态学胚胎参数cc3/t5＝1-t3/t5应当 大于0.3或为0.26-0.28。

在本发明的一个实施方案中，归一化的形态学胚胎参数s2/cc2＝(t4-t3)/(t3-t2) 应当小于0.025。

在本发明的一个实施方案中，归一化的形态学胚胎参数s3/cc3＝(t8-t5)/(t5-t3) 应当小于0.18。

在本发明的一个实施方案中，归一化的形态学胚胎参数cc2/cc3＝(t3-t2)/(t5-t3) 应当为0.72-0.88。

从四个卵裂球到八个卵裂球的不规则性

在胚胎从四个卵裂球发育成八个卵裂球时，单个细胞分裂的发生时间(即 s3a＝t6-t5；s3b＝t7-t6；以及s3c＝t8-t7)可能与胚胎质量和植入的成功性相关。这 些发生时间可以表明每个单独的细胞进行细胞分裂的能力。有丝分裂中可能存 在的不规则性或异常可能会引起s3a、s3b和/或s3c值之间大的差异。因此，在 本发明的另一个实施方案中，胚胎质量标准是细胞分裂发生时间的不规则程度， 如到八卵裂球胚胎为止的细胞分裂发生时间的不规则性，如在从四卵裂球胚胎 发育成八卵裂球胚胎时细胞分裂发生时间的不规则性。在本发明的另一个实施 方案中，胚胎质量标准是s3a、s3b以及s3c中的最大值。优选地，s3a、s3b以 及s3c中的最大值小于1.5小时。在本发明的另一个实施方案中，胚胎质量标准 是s3a/s3、s3b/s3以及s3c/s3中的最大值，优选地，max(s3a、s3b、s3c)/s3(s3a/s3、 s3b/s3以及s3c/s3中的最大值)小于0.5。请注意，max(s3a、s3b、s3c)/s3是基 于t5、t6、t7以及t8的归一化的形态学胚胎参数。

多核现象可以是胚胎质量参数，特别是在四卵裂球期观测到的多核现象 (MN4)。优选地，在四卵裂球期应当不存在多核现象，因此优选地，MN4＝假。

卵裂球大小的均匀性可以是胚胎质量参数，特别是，二卵裂球胚胎应当具 有大小均匀的卵裂球，因此优选地，EV2＝真。EV2：二卵裂球胚胎中卵裂球的 均匀性；可以取值“真”(即均匀)或“假”(即不均匀)。

排除标准

可以对胚胎群体执行一个或多个排除标准以便从群体中排除植入成功概率 低的胚胎(即离群值)。这可以是满足了多个阳性选择标准，但仅在一个或两个选 择标准中显示出异常行为的胚胎。排除标准的实例是诸如在t2时卵裂球的均匀 性以及在四卵裂球期的多核现象之类的离散标准。然而，也可以将排除标准应 用于形态学胚胎参数。长久以来，已知胚胎发育缓慢是质量较差的指征，这反 映在t2值非常高(>31.8小时)，但是从一个卵裂球直接卵裂成三个卵裂球也可能 是与低植入率相关的质量较差的胚胎的指征。这可以反映在cc2和cc3的值非常 低。

指明群体中植入概率低的一组胚胎的特定排除标准并不意味着所述群体中 的其余胚胎均具有高植入概率。排除标准仅指示质量较差的胚胎。因此，在本 发明的一个实施方案中，将所述一个或多个质量标准与一个或多个排除标准相 结合。将排除标准应用于胚胎群体的实例(基于KID数据，参见实施例2)示出于 图17中。cc2(以小时为单位)沿x轴，而cc3(以小时为单位)沿y轴。成功植入的 胚胎被描绘成三角形，而不成功的胚胎(不能成功植入的胚胎)则被描绘成圆形。 可以看到，一大群具有低cc2的不成功的胚胎集中于附图的左侧，而一大群具有 低cc3的不成功的胚胎集中于附图的底部。如果应用cc2少于5小时和/或cc3 少于5小时的排除标准，那么可以排除大群不成功的胚胎，因而有助于分离成 功的胚胎，从而可以从中提取更好的质量标准。

监测

定期对胚胎进行监测以获得相关信息，优选地至少每小时监测一次，如至 少每小时监测两次，如至少每小时监测三次。优选地在胚胎处于用于培养胚胎 的孵育箱中时进行监测。这优选地通过获取胚胎的图像(如下文关于延时法所论 述)来进行。

可以例如通过对胚胎图像进行目视检查和/或通过自动化方法来对选择标准 进行测定，所述自动化方法如在2006年10月16日提交的名称为“Determination  of a change in a cell population(对细胞群体变化的测定)”的未决PCT申请中所详 细描述的自动化方法。此外，可以例如通过使用FertiMorph软件(丹麦哥本哈根 的ImageHouse Medicall公司)所设想的对细胞质膜的位置进行测定来实施测定 选择标准的其他方法。所述方法可以单独使用或与对胚胎图像进行目视检查和/ 或与如上文所述的自动化方法结合使用。

决策树模型

具体来说，可以将标准组合成如图2和3中所示的分层形式，关于更多的 信息，还参见实施例1，从而产生决策树模型(或分类树模型)以对植入概率较高 的胚胎进行选择。在分类树模型中，使用若干个变量以通过使用逐次分支规则 将胚胎分到植入成功率的相关概率不同的各组中。可以在一组给定的约束条件 下从一组可能的变量中选择出用于分支规则中的最佳变量对分类树模型进行优 化。用于模型中的变量可以例如是基于形态学事件之间的时间间隔的形态学胚 胎参数和相应的归一化形态学胚胎参数以及离散变量(例如多核现象或卵裂球的 均匀性)，或这些变量的任何组合。可以使用ROC曲线下面积(AUC)来对这一类 型的模型进行评价。如果不应用分支，那么AUC等于0.5，并且如果AUC>0.5， 那么分支提高了预测效力。

图3中所描绘的决策树代表了对所鉴定的选择标准与传统的形态学评价的 组合的依序应用。

决策树将胚胎细分到从A至F的6个类别中。如图5中所示，将这些类别 中的四个类别(A至D)进一步细分成两个子类(+)或(-)，从而得到总共10个类别。 分层决策程序起始于对组群中的所有胚胎进行形态学筛选以排除那些明显无活 力的胚胎(即高度异常、闭锁或明显停滞的胚胎)。放弃那些明显无活力的胚胎并 且不考虑用于移植(类别F)。所述模型中的下一步是排除满足以下三个排除标准 中的任一个的胚胎：i)在二细胞期卵裂球大小不均匀；ii)从一个细胞突然分裂成 三个或更多个细胞；或iii)在四细胞期存在多核现象(类别E)。所述模型中的后 续层次遵循了基于二元发生时间变量t5、s2以及cc2的严格分层结构。首先， 如果t5值处于最佳范围以内，那么将胚胎分类为A或B。如果t5值处于最佳范 围以外(或如果在第64小时还没有观测到t5)，那么将胚胎分类为C或D。如果 s2值处于最佳范围以内(≤0.76小时)，那么根据t5，将胚胎分类为A或C，并且 类似地，如果s2值处于最佳范围以外，那么根据t5，将胚胎分类为B或D。最 后，如果cc2值处于最佳范围以内(≤11.9小时)，那么使用额外的加号(+)对胚胎 进行分类(A+/B+/C+/D+)，而如果cc2值在最佳范围以外，那么将所述胚胎分类 为A、B、C、D。

在实施例1中所论述的研究中，决策程序将所有247个所评价的胚胎分成 十个不同的类别，所述类别各自含有大致相同数目的经过移植的胚胎，但是植 入潜能大幅递减(即从68％(A+)到8％(E))。

还已经基于来自1598个人类胚胎的KID数据建构决策树模型(参见实施例 2)。所述两个决策树是基于从t2开始(图15)以及从t4开始(图16)的质量标准和 排除标准。已借助于这些决策树模型，将1598个胚胎分类为植入概率在0.04至 0.37范围内的八个质量类别A-H(图15)以及植入概率在0.12至0.36范围内的六 个类别A-F(图16)。这应当与所有1598个胚胎的总植入概率0.28相比较。这些 概率仅适用于这个具体的数据集而不能一般地应用于IVF胚胎。来自特定女性 的特定胚胎的植入概率取决于许多其他参数。然而，这个数据集提供了极难得 的机会来对本文所提供的质量标准和排除标准进行测试以便对IVF胚胎的分类 进行优化。举例来说，对取自单个女性的多个胚胎进行分类(在质量方面)以便选 择一个或多个用于移植的最佳胚胎。在来自单个女性的胚胎当中由于所有胚胎 的质量都是欠佳的或较差的而可能没有一个胚胎满足所有的最佳质量标准。然 而，必须进行移植，并且因此对胚胎进行分类对于选择胚胎中的最佳胚胎来说 是重要的。

结合运动量度

还可以将上述质量标准与对胚胎运动的测定相结合，所述对胚胎运动的测 定如i)测定在细胞卵裂期期间细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布；和/或ii) 测定在卵裂间期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布，从而获得胚胎质量 的量度。

透明带内缺乏运动的体积(或类似地，胚胎2D投影图像中保持静止的面积) 是胚胎内“死”区的指征。这些不动的“死”区越多并且越大，则胚胎成功发育的概 率就越低。在一系列延时胚胎图像内没有发生任何类型的运动(即，既无细胞运 动也无细胞器运动)的面积较大则指示存活力较低。即使当仅对两个或几个连续 帧进行比较时，细胞器运动一般也应当是可以在整个胚胎中检测到的。细胞运 动可能会更加局部化，尤其在胚胎发育的后期。

细胞位置在细胞卵裂之间通常是相对固定的(即几乎没有细胞运动)，除了每 次细胞卵裂前后短暂的时间间隔之外，此时一个细胞卵裂成两个细胞引起分裂 中的细胞以及周围的细胞发生短暂但相当大的重排(即显著的细胞运动)。在卵裂 之间较少运动是优选的。

在一个实施方案中，为了测定与卵裂期和卵裂间期有关的运动，可以对每 个卵裂期的时间长度以及每个卵裂间期的时间长度进行测定。优选地，对在至 少两个卵裂间期内细胞运动的时间段以及在至少两个卵裂间期内细胞运动的程 度进行测定。此外，已发现快速的卵裂似乎提高胚胎的质量，其中快速通常意 指少于2小时。

关于卵裂期和卵裂间期内的运动，我们还参考了PCT申请WO 2007/144001。

可以使用神经网络或其他定量模式识别算法来评价上述复杂的细胞运动模 式，例如使用不同的数学模型(线性、主成分分析、马尔可夫模型(Markov model) 等)。

延时监测

本发明的具体用途是对发育中的胚胎的一系列图像(延时图像)进行评价。这 些延时图像可以通过差分成像设备来分析(参见例如名称为“Determination of a  change in a cell population(对细胞群体变化的测定)”的WO 2007/042044)。可以使 用所得到的差分图像对在一系列图像中连续帧之间发生的变化的量进行定量。

本发明可以被应用于对差分图像数据进行分析，其中因细胞运动而使得细 胞界限(即细胞膜)的位置发生变化，从而引起源自于差分图像的一系列参数暂时 地升高(参见WO 2007/042044)。这些参数包括(但不限于)平均绝对强度或方差升 高。细胞卵裂和它们的持续时间以及相关的细胞重排因此可以通过差分图像中 所有像素的标准偏差或者在WO 2007/042044中所列出的“卵裂球活动”的任何其 他衍生参数的暂时变化(即增加或减少)来进行检测。然而，也可以将选择标准应 用于对延时图像以及与胚胎相关的其他时间分辨的数据(例如代谢物的排泄或摄 取、物理或化学外观的变化、衍射、散射、吸收等)进行目视观测和分析。

特别关注的是细胞卵裂的起始时间、幅度以及持续时间，它们可以被定量 成衍生参数值的峰或谷。这些极限值(即峰或谷)时常表示细胞卵裂事件。就像峰 的大小一般可以提供另外的信息，每个峰的形状也提供了另外的信息。峰还可 以表示卵裂球突然崩溃以及同时发生的细胞死亡。然而，有可能通过在事件之 前和之后的峰形和基值的变化来区分细胞卵裂事件与细胞死亡事件。大多数参 数的基线通常不受细胞卵裂的影响，而细胞溶解时常伴有基线值的显著变化(对 于大多数参数来说，在发生溶解后减小)。

总之，本发明表明了在临床环境下对胚胎发育进行常规的延时监测(即在未 受到干扰的受控孵育环境中进行自动的图像获取)能够提供有关在能够植入的胚 胎与不能植入的胚胎之间存在差异的发育参数的新颖信息。

胚胎

在一些情况下，术语“胚胎”用于描述到受精后的第8周(在此阶段受精的卵 母细胞将变成胎儿)为止的植入子宫后的已受精的卵母细胞。根据该定义，已 受精的卵母细胞在进行植入以前经常被称为前期胚胎(pre-embryo)。然而，在整 个本专利申请中，我们将使用术语胚胎的更宽泛的定义，所述定义包括前期胚 胎期在内。它因此涵盖了从卵母细胞受精到桑椹胚、胚泡期孵化以及植入的所 有发育阶段。

胚胎呈大致球形并且由一个或多个由明胶样外壳包围的细胞(卵裂球)构成， 所述明胶样外壳是被称为透明带的无细胞基质。透明带发挥多种功能直到胚胎 孵化为止，并且是用于进行胚胎评价的优良标志。透明带呈球形并且是半透明 的，并且应当可与细胞碎片明显相区分。

当通过融合或注射精细胞(精子)而使卵母细胞受精时，形成胚胎。传统上在 孵化(即透明带破裂)和随后的植入后也使用该术语。对于人类而言，已受精的卵 母细胞在前八周内传统上被称为胚胎。之后(即在八周之后以及在已形成所有主 要器官时)，它被称为胎儿。然而，胚胎与胎儿之间的差别一般未被明确限定。

在胚胎发育期间，卵裂球数目成几何级数增加(1个-2个-4个-8个-16个-等)。 同步的细胞卵裂一般在胚胎中被维持到十六细胞期。之后，细胞卵裂变得不同 步，并且最终，个体细胞拥有它们自己的细胞周期。通常将在不育症治疗期间 产生的人类胚胎在十六卵裂球期之前移植到接受者体内。在一些情况下，还将 人类胚胎在移植前培育至胚泡期。这优选地在许多优质胚胎可供使用或者需要 长时间的孵育来等待植入前遗传诊断(PGD)结果时进行。

因此，术语胚胎在下文中用于表示以下的各个阶段：已受精的卵母细胞、 受精卵、二细胞期、四细胞期、八细胞期、十六细胞期、桑椹胚、胚泡、扩张 型胚泡以及孵化了的胚泡，以及之间的所有阶段(例如三细胞期或五细胞期)。

其他测量

最终的分析步骤可以包括将所获得的观测结果与具有不同质量和发育能力 的胚胎的类似观测结果相比较，以及将给定胚胎的参数值与对于同一胚胎所获 得的其他定量量度相比较。这可以包括与诸如卵裂球运动、呼吸率、氨基酸摄 取等的在线量度相比较。卵裂球运动分析、呼吸率以及其他定量参数的组合数 据集有可能提高胚胎选择，并且使胚胎学家能够可靠地选择用于移植的最佳胚 胎。因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法可以与其他测量相结合，以 便对所讨论的胚胎进行评价，并且可以用于选择用于移植到接受者体内的有能 力的胚胎。

这些其他测量可以选自以下各项的群组：呼吸率、氨基酸摄取、运动分析、 卵裂球运动、形态、卵裂球大小、卵裂球粒化(blastomere granulation)、断裂、卵 裂球颜色、极体取向、核化、纺锤体形成和完整性以及许多其他定性测量。可 以如PCT公布号WO 2004/056265中所述进行呼吸测量。

培养基

在一个优选的实施方案中，在培育细胞群体期间，如在细胞群体被放入培 养基中的情况下进行观测。用于培养细胞群体的手段是本领域已知的。培养胚 胎的实例描述于PCT公布号WO 2004/056265中。

数据载体

本发明进一步涉及一种数据载体，所述数据载体包括直接可装在数字处理 器件的存储器中的计算机程序并且包括构成用于执行如上文所述的本发明方法 的工具的计算机代码部分。

数据载体可以是磁盘或光盘或者呈例如像EEPROM或Flash类型的电子卡 的形状，并且经过设计以装入现有的数字处理装置中。

对胚胎进行选择或识别

本发明进一步提供了一种选择用于移植的胚胎的方法。该方法暗示已经如 上文所述对胚胎进行监测以确定细胞卵裂何时已经发生。

选择或识别方法可以与如上文所述的其他测量相结合，以便对胚胎的质量 进行评价。对胚胎进行形态学评价的重要标准是：(1)胚胎的形状，包括卵裂球 的数目和断裂的程度；(2)透明带的存在和质量；(3)大小；(4)颜色和结构；(5) 对与胚胎发育阶段有关的胚龄的了解；以及(6)卵裂球膜的完整性。

然后可以通过本领域技术人员已知的任何适合的方法进行移植。

实施例

实施例1-回顾性研究

材料与方法

在瓦伦西亚市(Valencia)的瓦伦西亚不孕不育研究所(Instituto Valenciano de  Infertilidad，IVI)进行这项研究计划。程序和方案得到了伦理审查委员会 (Institutional Review Board，IRB)的批准，伦理审查委员会规定和批准了用于在 IVI进行的研究的数据库分析和临床IVF程序。该项计划遵守管辖辅助生殖技术 (Assisted Reproductive Technologies)的西班牙法(Spanish Law)(14/2006)。本研究 包括了总共2903个卵母细胞，在2009年9月与2010年9月之间的285个IVF 治疗周期中从这些卵母细胞产生了2120个胚胎。在通过胞质内精子注射(ICSI) 受精后获得所有胚胎并且这些胚胎是临床标准(n＝188)和卵子捐赠项目(n＝97)的 一部分。获取所有胚胎的延时图像，但仅对经过移植的具有已知的植入结果(即 0％植入或100％植入)的胚胎通过详细的延时分析进行研究，所述详细的延时分 析以通过ICSI受精后的小时数测量了发育事件的精确发生时间。对于这项研究， 标准患者和接受者的排除标准是：低反应(少于5个MII期卵母细胞)、子宫内膜 异位症、多囊卵巢综合征(PCOS)、输卵管积液、BMI>30kg/m²、子宫病变(肌瘤、 腺肌病、内分泌病、易栓症、慢性病变、获得性或先天性子宫畸形)、习惯性流 产、孕妇年龄超过39岁(对于标准患者)和45岁(对于卵母细胞捐赠接受者)(子宫 老化)，或严重的男性因素(在射精时总共提供少于500万个活动精细胞)。

在标准患者和卵母细胞捐赠者中进行卵巢刺激

所有捐赠者均来自于临床卵细胞捐赠项目。在所述研究中仅包括满足纳入 标准的患者在内。简而言之，按照西班牙法律的规定，捐赠者在18岁与35岁 之间，当前或既往未暴露于放射线或危险的化学物质、不使用药物、无家族遗 传或染色体疾病病史、染色体组型正常，并且对于脆性X染色体综合征和性传 播疾病检查呈阴性(Garrido,N.2002)。研究群体中男性患者的平均年龄是37.9岁 (SD＝5.2)。女性群体的平均年龄是36.9岁(SD＝4.9)。所有捐赠者均具有正常的 26天到34天持续时间的月经周期、正常的体重(BMI是18-28kg/m²)，在研究前 3个月内未接受内分泌治疗(包括促性腺激素和口服避孕药在内)，在经阴道超声 检查时具有正常的子宫和卵巢(无多囊卵巢综合征体征)，并且在使用GnRH激动 剂下调后，在接受促性腺激素施用的第一天，窦卵泡计数(AFC)>20个(Meseguer, M.2010)。

在控制性卵巢刺激(COS)之前，使用进行GnRH激动剂方案的周期。在GnRH 激动剂方案中，患者在上一个周期的黄体中期开始接受0.5mg醋酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)(西班牙马德里的雅培公司(Abbott,Madrid,Spain)) 的施用，直到阴道超声检查所定义的卵巢静止呈阴性为止。经过充分的垂体脱 敏的患者开始他们的刺激过程，并且将GnRH激动剂的剂量降低至每天0.25mg 直到施用hCG当天为止(Melo,M.2009)。

对于COS，如先前所述进行治疗(Melo,M.2010)。简而言之，使用150IU 的rFSH(果纳芬(Gonal-f)；默克雪兰诺公司(Merck Serono))+75IU的HP-hMG(美 诺孕(Menopur)；辉凌制药公司(Ferring))对捐赠者和患者进行治疗。从月经第3 天开始每天服用225IU固定起始剂量的促性腺激素，并且持续服用至控制性卵 巢刺激的前5天，在此期间，对血清E2进行评估。必要时对促性腺激素的剂量 进行调整。从控制性卵巢刺激的第5天开始进行连续的经阴道超声检查并且每 48小时进行一次以监测卵泡的生长。在至少八个优势卵泡达到平均直径≥18mm 时，皮下施用人绒毛膜促性腺激素(hCG)(艾泽(Ovitrelle)，西班牙马德里的雪兰 诺实验室(Serono Laboratories,Madrid,Spain))。在施用hCG当天中止促性腺激素 和GnRH激动剂的每日施用。在36小时后安排经阴道卵母细胞采集。在施用hCG 当天早上测量血清E2和P的水平。使用微粒酶免疫测定Axsym系统(西班牙马 德里的雅培科学有限公司(Abbott Cientifico S.A.))对样本进行测试。血清E2试剂 盒的灵敏度是28pg/mL，并且观测者自身(intraobserver)和观测者间(interobserver) 变异系数分别是6.6％和7.7％。

接受者的子宫内膜准备方案：可以见于Meseguer,M.2008；Meseguer,M. 2010中。简而言之，通过在上一个周期的分泌期肌肉内施用单次剂量3.75mg 的曲普瑞林(Triptorelin)(达必佳3.75(Decapeptyl 3.75)，西班牙马德里的易普森医 药股份公司(Ipsen Pharma S.A.,Madrid,Spain))来对具有卵巢功能的患者进行下 调。使用阴道超声检查来确定在卵巢下调后周期的第1天开始进行的激素替代 疗法。患者开始接受从第1天到第8天每天2mg戊酸雌二醇(补佳乐(Progynova)， 西班牙马德里的先灵公司西班牙分公司(Schering Spain,Madrid,Spain))的口服施 用；从第9天到第11天，每天4mg；并且从第12天开始每天6mg。没有卵巢 功能的患者直接开始激素替代疗法。在施用戊酸雌二醇14天后，进行阴道超声 检查，并且测定血清E₂。如果接受者准备好接受卵母细胞，那么她们在等待同 时继续服用每天6mg的戊酸雌二醇直到合适的捐赠细胞可获得为止。在进行胚 胎移植后，对于黄体期支持疗法，所有患者每12小时接受一次200mg(对于标 准患者)和400mg(对于卵母细胞接受者)日剂量的阴道用微粉化孕酮(爱丝缇 (Progeffik)，西班牙马德里的埃非克公司(Effik,Madrid Spain))。卵子采集和ICSI

抽吸卵泡并且将卵母细胞在Quinn's Advantage培养基(QAM)(意大利罗马的 赛捷公司(SAGE,Rome,Italy))中洗涤。在洗涤后，将卵母细胞在Quinn's Advantage受精培养基(QAFM)(意大利罗马的赛捷公司)中在5.2％CO₂和37℃下 培养4小时，之后剥脱(denudation)卵母细胞。通过在含40IU/mL透明质酸酶的 相同培养基(QAFM)中进行机械吸移来进行卵母细胞剥离。此后，在含有HEPES 的培养基(QAM)中进行ICSI(Garcia-Herrero,S.2010)。使用Olympus IX7显微镜， 在400×放大倍数下进行ICSI。最后，将卵母细胞放置在预平衡过的载玻片 (丹麦奥尔胡斯的Unisense FertiliTech公司(Unisense FertiliTech, Aarhus Denmark))中。

孵育

所述载玻片经过建构而具有含12个具有平直侧面的圆柱形孔的中央凹陷部 分，每个孔容纳20μL的Quinn's Advantage卵裂培养基(QACM)的培养基液滴。 将含有12个孔的凹陷部分用1.4mL的矿物油覆盖层填充以防止蒸发。提前至少 4小时准备载玻片并且将所述载玻片在孵育箱中在37℃下于5.0％CO₂气氛中预 平衡。在预平衡后，仔细地去除所有气泡，之后将卵母细胞单独地放置到液滴 中并且在延时监测系统中孵育直到约72小时后进行胚胎移植为止。延时仪器 (ES)(丹麦奥尔胡斯的Unisense FertiliTech公司)是一种三气型卵 母细胞/胚胎孵育箱，所述孵育箱具有内装式显微镜以自动地获取多达72个单独 的胚胎在发育期间的图像。

成像系统

ES中的成像系统使用来自单个LED的低强度红光(635nm)，所述红光的照 明时间较短(每张图像30ms)以使胚胎的曝光量减到最少并且避免有破坏性的短 波长光。光学器件在20×专业物镜(Leica Place)下包括改进的霍夫曼对比度 (Hoffmann contrast)以对于红光波长提供最佳的感光度和分辨率。通过分辨率为 每微米3像素的高灵敏度的CCD摄像机(1280×1024像素)来采集数字图像。在 ES内部在胚胎发育期间(即从受精后约1小时到第3天(即受精后约72小时)移植 时)每15分钟在5个等距的焦平面上获取图像栈。使用在EmbryoScope内被安 置于EmbryoSlide中的胚胎位置上的具有100μm尖端直径的标辐照度微型传感 器对胚胎在孵育期间的曝光量进行测量。在用于生育门诊的标准显微镜上进行 类似的测量。在3天培养和采集1420张图像期间在延时系统中的总曝光时间是 57秒，这优于对于标准IVF治疗所报道的167秒显微镜曝光时间(Ottosen等, 2007)。由于在ES内使用标辐照度微型传感器所测量的光强度比用于IVF门诊 的显微镜中的光强度要低得多，所以基于来自Ottosen等,2007的平均照明时间 以及使用标辐照度微型传感器所测量的平均强度，发现在3天孵育期间在延时 系统中的总光剂量是20J/m²(即每个胚胎0.24μJ)，相对而言，在普通IVF治疗 中在显微镜检查期间的曝光量是394J/m²(即每个胚胎4.8μJ)。此外，在ES中的 光的光谱组成被限制在围绕635nm的较窄范围内，并且因此缺少550nm以下 的低波长光，并且包含在普通IVF显微镜中所遇到的光的约15％。胚胎评定和 培养条件

在ICSI后16小时到19小时，基于使用延时监测系统获取的数字图像对成 功的受精进行评估。在第2天(ICSI后48小时)和第3天(ICSI后72小时)，基于 所获取的数字图像，在将如先前所述(Alikani,M.2000)的卵裂球的数目、对称性 以及颗粒度、断裂的类型和百分比、多核卵裂球的存在以及紧密度考虑在内的 情况下，对胚胎形态进行评价。仅通过基于以下各项的形态来进行胚胎选择：i) 不存在多核细胞；ii)在第2天为2个细胞到5个细胞；iii)在第3天为6个细胞 到10个细胞；iv)胚胎的总碎片体积少于15％；以及v)胚胎必须看上去是对称的 而卵裂球仅仅是略微不对称(Meseguer,M.2006；Muriel,L.2006；Meseguer,M. 2008)。将总共522个胚胎移植到285名患者体内。

对形态动力学参数进行延时评价

使用外部计算机工作站(EV)(丹麦奥尔胡斯的Unisense  FertiliTech公司)，利用图像分析软件对所获取的每个胚胎的图像进行回顾性分 析，其中对所有所考虑到的胚胎发育事件以及以ICSI显微注射后的小时数计算 的事件的相应发生时间进行注释。随后，使用EV对第一次细胞分裂的精确发生 时间进行鉴定。这次分裂是分裂成2个细胞并且在下文中使用t2作为简写符号。 同样对第二次(即分裂成3个细胞，t3)、第三次(分裂成4个细胞，t4)以及第四次 (分裂成5个细胞，t5)细胞分裂进行注释。为了便于这项研究，将卵裂时间定义 为首先观测到新形成的卵裂球由汇合的细胞膜完全分开的时间点。所有事件均 表示为在ICSI显微注射后的小时数。

第二细胞周期的持续时间被定义为从分裂成二卵裂球胚胎直到分裂成三卵 裂球胚胎的时间。cc2＝t3-t2，即第二细胞周期是呈二卵裂球胚胎形式的时间段的 持续时间。

第二同步性s2被定义为从二卵裂球胚胎分裂成四卵裂球胚胎的持续时间 (s2＝t4-t3)，对应于呈三卵裂球胚胎形式的时间段的持续时间。

对100％植入的经过移植的胚胎(即其中通过超声检查所确定的孕囊数目与 所移植的胚胎的数目相匹配)(N＝61)以及0％植入的经过移植的胚胎(其中没有实 现生化妊娠)(N＝186)进行详细分析。

胚胎移植

所移植的胚胎的数目通常是两个，但在一些情况下，由于胚胎质量或患者 的意愿而移植1个或3个胚胎。使用IVI标准玻璃化冷冻技术(Cobo等,2008)将 多余的胚胎冷冻以供未来可能的移植使用。在胚胎移植后第13天测定β-hCG值 并且在妊娠7周后可见到有胎儿心跳的孕囊时确定临床妊娠。

统计分析

对已植入的胚胎，以ICSI显微注射后的小时数计算的胚胎事件的精确发生 时间基本上遵循正态分布，而未植入的胚胎典型地并非如此(夏皮罗-威尔克检验 (Shapiro-Wilk test))。未植入的胚胎的分布典型地具有延伸至后发生时间值的长 尾部。为了研究胚胎事件的精确发生时间中的方差在已植入的胚胎与未植入的 胚胎之间是否不同，使用用于方差齐性的布朗-福赛斯检验(Brown-Forsythe's  test)，这是因为这一检验不要求所检验的分布具有正态性。使用曼-惠特尼U-检 验(Mann-Whitney U-test)来检验胚胎事件的精确发生时间的中值在已植入的胚 胎与未植入的胚胎之间是否显著不同。

为了描述植入概率的分布，使用针对所测量参数中的每一个的所有观测结 果的四分位数将发生时间从连续变量转换成分类变量。使用能够提供四个类别 (发生时间四分位数)(每个类别具有相等数目的观测结果)的基于排序法的系 统获得这些类别。通过这个程序，避免了因每个类别中胚胎总数的差异所引起 的偏差。此后，对每个发生时间四分位数中已植入的胚胎的百分比进行计算以 评估不同类别中植入的分布。在对两组进行比较时，使用斯图登氏T-检验 (Student's T-test)分析衍生的胚胎发生时间，而在考虑到多组时，使用方差分析 (ANOVA)，继而使用邦费罗尼氏(Bonferroni's)和雪费氏(Scheffe's)事后分析(post  hoc analysis)来分析衍生的胚胎发生时间。使用卡方检验(Chi square test)在分类数 据之间进行比较。对于每个发生时间变量，最佳范围被定义为由具有最高植入 率的两个四分位数所跨越的组合范围。另外，如果发生时间变量的值处于最佳 范围以内(以外)，那么使用值在内(在外)对二元变量进行定义。

所产生的所有二元变量对植入的影响的优势率(OR)用95％置信区间(CI95) 和显著性来表示。通过进行逻辑回归分析，对最佳范围和其他二元变量对植入 的影响进行定量。使用整体检验(omnibus test)计算显著性(似然比)，并且通过 Negelkerke R²对由所述模型揭示的不确定性进行评价，Negelkerke R²是类似于 线性回归分析中的R²指数的系数。使用ROC曲线来检验在关于植入的模型中 所包括的所有变量的预测值。ROC曲线分析提供了AUC值(曲线下面积)，所述 AUC值包括0.5到1并且可以被解释成对模型的整体分类能力的量度。使用社 会科学统计软件包17(Statistical Package for the Social Sciences 17)(伊利诺斯州芝 加哥市的SPSS公司(SPSS Inc.,Chicago,IL))和MedCalc软件(比利时根特市 (Ghent,Belgium))进行统计分析。

结果

女性不育症的主要病因是：卵母细胞质量较差，占34.7％(n＝99)；孕妇高龄， 占24.6％(n＝70)；卵巢早衰，占6.0％(n＝17)；正常，占23.8％(n＝68)；输卵管堵 塞，占2.5％(n＝7)；卵巢反应低下，占8.4％(n＝24)。在hCG注射之前平均E2水 平是1701(SD＝991)pg/ml。在经过移植的总共522个胚胎当中，总共有201个胚 胎成功植入(孕囊)，从而得到了38.5％的植入率。每次移植的生化妊娠率是 55.1％(n＝157)，并且每次移植的继续妊娠率是49.8％(n＝142)。

在双胚胎移植后时常观测到单个孕囊。由于不可能非常明确地确定两个经 过移植的胚胎中哪一个已植入，所以在进一步分析中将这些胚胎排除在外。将 具有已知植入结果的所有胚胎选用于进行进一步回顾性分析。这项分析包括了 247个胚胎；61个胚胎100％植入(孕囊的数目与所移植的胚胎数目相匹配)并且 186个胚胎0％植入(没有实现生化妊娠)。

基于延时的形态动力学参数和植入率

对使用EV延时工具所分析的形态动力学参数与胚胎植入之间的相关性进 行研究。对于总共247个胚胎中的51个胚胎(20.6％)，观测到显然与胚胎发育不 良相关的形态学事件。这三个事件是：A)从受精卵直接卵裂成三卵裂球胚胎， 被定义为：cc2＝t3-t2<5小时(N＝9)。B)在二细胞期在可见到细胞核的间期内卵裂 球大小不均匀(N＝26)。如果大卵裂球的平均直径比小卵裂球的平均直径大超过 25％，那么认为卵裂球的大小不均匀。这个定义暗示了大卵裂球的体积应当是小 卵裂球体积的至少两倍。C)在四细胞期在可见到细胞核的间期内存在多核现象 (N＝28)。如果在一个(或多个)卵裂球中观测到多于一个的清楚细胞核，那么认为 胚胎是多核的。在这51个胚胎当中，仅4个胚胎植入(8％)(两个胚胎的卵裂球大 小不均匀而两个胚胎是多核的)。由于植入频率非常低(51个中有4个植入，即 8％)，所以鉴于在显示出这些事件的胚胎中所观测到的低植入率，表明可以使用 所列出的观测结果作为用于胚胎选择的排除标准。胚胎发育事件的发生时间和 植入

前四次分裂的卵裂时间示出于图8中，表示为在通过ICSI受精后的不同时 间点完成细胞分裂的胚胎的百分比。四条蓝色曲线表示61个能够植入的胚胎的 连续分裂，而四条红色曲线表示186个不能植入的胚胎的连续分裂。很明显， 与不能植入的胚胎相对比，能够植入的胚胎的卵裂时间的分布更紧密。对于不 能植入的胚胎(红色曲线)，存在因胚胎滞后而出现的显著尾部。至少对于后期卵 裂，也存在因被发现不能植入的胚胎过早卵裂而出现的主要尾部。

对所有分裂发生时间的分布进行更详细的评价。一个实例，即细胞分裂成 五个细胞的发生时间t5示出于图9中。61个能够植入的胚胎(阳性)的卵裂时间 的分布由蓝点指示而186个不能植入的胚胎(阴性)的卵裂时间的分布由红点指 示。左图示出了对应各胚胎类型的卵裂时间的总体分布。右图示出了在正态分 位数曲线图上绘制的对于两种胚胎类型所观测到的t5卵裂时间的分布。遵循正 态分布的观测结果将沿着直线落在这一类型的曲线图上。根据两条拟合线明显 的是，两种类型胚胎的卵裂时间t5看上去遵循正态分布。这些拟合线在0.5处 相交，暗示两组的t5的平均值是相似的，但线的斜率不同，指示两种类型胚胎 的标准偏差不相同。阳性(能够植入)组的斜率更水平，并且因此，能够植入的胚 胎的t5的方差预期显著更低。

所分析的经过移植并且具有已知结果的胚胎的t2、t3、t4和t5以及cc2和 s2的平均发生时间呈现于表1中，还计算了那些植入的和未植入的胚胎的值。 在该表中还包括了每个变量的标准偏差。另外，在表1中包括了用于正态分布 的夏皮罗-威尔克检验的结果。对于已植入的胚胎，胚胎事件的所有参数(除s2 之外)的精确发生时间均遵循正态分布。另一方面，未植入的胚胎的胚胎事件的 精确发生时间不遵循正态分布，但在后期发生时间处展现出尾部。对于未植入 的胚胎，仅参数t5遵循正态分布(还参见图9)。

如根据图8中所示出的卵裂时间的分布所预期，已植入的胚胎的所有参数 分布的特征在于方差显著小于不能植入的胚胎的参数分布的方差(用于方差齐性 的布朗-福赛斯检验，p值示出于表1中)。

这支持了以下假设：有活力的胚胎遵循预先确定的发育时程的忠实度大于 不能植入的胚胎。

由于所有参数均显示出显著不同的方差，所以使用非参数曼-惠特尼U-检验 对中值进行比较。除s2之外，任何参数的中值在能够植入的胚胎与不能植入的 胚胎之间并非显著不同。s2，即第二次细胞分裂和第三次细胞分裂的同步性在已 植入的胚胎(中值是0.50小时)与未植入的胚胎(中值是1.00小时)之间显著不同 (p＝0.0040)。

表2

所研究的每个参数的发生时间的四个四分位数以及每个四分位数中能够植 入的胚胎的百分比呈现于表2中。使用由这些四分位数所界定的类别基于具有 最高植入概率的两个相邻四分位数(在表2中以粗体字表示的条目)确定最佳范 围。在图10和图11中呈现出与最佳范围外的所观测的参数相比，在最佳范围 以内的所观测的参数的胚胎的植入率显著更高。

对于所评估的所有卵裂时间(t2、t3、t4以及t5)，在两个中心四分位数中完 成卵裂的胚胎展示出最高的植入率，并且因此组合成每个参数的最佳范围(图 10)。发现这些卵裂时间的第一个四分位数中的植入率低于随后两个四分位数中 的植入率，指示可能存在“过早卵裂”的缺点。如果将所研究的IVF周期中所有 胚胎的卵裂发生时间均包括在内，那么这种影响将不明显，但是由于分析仅局 限在这些周期中经过移植的优质胚胎，所以可以确定t2、t3、t4以及t5的最佳 卵裂范围的下限。

对于所有卵裂时间，在最佳范围内的胚胎与在所述范围以外的胚胎之间在 植入率方面存在显著性差异(图10)。然而，应指出的是，两个最佳四分位数内的 植入率与这些四分位数以外的植入率之间的差别会随连续的细胞分裂而增加。 对于t2，植入率的差异是12％，对于t3，存在21％的差异，而对于t5，达到24％。 t5卵裂在所述范围以内的胚胎的植入率是在这个范围以外的胚胎的植入率的2.6 倍。基于卵裂至五细胞期的发生时间的选择因此提供了选择具有提高的植入潜 能的胚胎的最佳单一标准。

对于第二细胞周期的持续时间cc2以及从二细胞期过渡到四细胞期的细胞 卵裂的同步性s2(即三细胞期的持续时间)，发现在前两个四分位数中发生卵裂的 胚胎的植入率显著高于落在后两个四分位数中的那些胚胎(图11)。如果从这项分 析中排除据观测从一个细胞突然细胞分裂成三个或四个细胞的胚胎(即cc2<5小 时的胚胎)，那么cc2的第一个四分位数中的植入率将会更高(26％而非23％)。这 些异常分裂是罕见的，并且仅在所研究的247个胚胎中的9个胚胎中观测到， 这些胚胎当中没有一个能够植入。

基于逻辑回归分析对潜在选择参数进行评价

使用逻辑回归分析来选择和组织应当连同形态学排除标准一起使用哪些所 观测到的计时事件，所述所观测到的计时事件被表示为在如上文所定义的最佳 范围以内或以外的二元变量。所述模型将分裂成五个细胞的时间 t5(OR＝3.31(CI95％1.65-6.66))，其次是二细胞期后分裂的同步性 s2(OR＝2.04(CI95％1.07-4.07))以及第二细胞周期的持续时间 cc2(OR＝1.84(CI95％0.95-3.58))鉴定为最有前途的表征能够植入的胚胎的变量。

通过使用排除变量加上t5、s2以及cc2限定逻辑回归模型。对这一模型在 植入概率方面的预测特性进行测定的ROC曲线分析得到了0.720的曲线下面积 AUC值(CI95％0.645-0.795)。使用这些数据产生本文所述的分层选择模型(图2 和3)。

实施例2-基于已知的植入数据进行的数据分析

这项分析是基于来自10个不同诊所的1598个胚胎的已知植入数据(KID)。 KID胚胎均是经过移植并且具有已知植入结果的胚胎。在移植多个胚胎的情况 下，仅使用植入完全失败或完全成功的胚胎。放弃有植入但是已植入的胚胎少 于所移植的胚胎的所有多重移植以能够确定具体胚胎的植入成功性。如果经过 移植的胚胎能够成功植入，则植入成功性取值1，而如果不能成功植入，则植入 成功性取值0。用于计算目标组和非目标组的预期值(成功概率)的胚胎数目(N) 对于不同变量是不同的。

单个变量

对于单个连续变量(例如t2)，将数据分成四分位数，并且计算每个四分位数 的预期值(在一次试验中获得成功的概率)。从这些四分位数组中，由具有最高预 期值的四分位数或者由具有相似概率的两个或三个相邻四分位数形成新的组(目 标组)(参见图13中的实例)。使用费雪精确检验(Fisher's exact test)对如下假设进 行检验：目标组中胚胎的植入概率(KID数据的预期值)与该组以外的胚胎的植入 概率是相等的(表3)。如果p值<0.1，则该假设被拒绝，指示存在组间差异，否 则将视为不显著。

表3：使用连续延时变量对所有经过注释的胚胎的胚胎植入概率进行统计学 评价

表4：使用离散变量对所有经过注释的胚胎的胚胎植入概率进行统计学评 价。在1598个观测结果(N)下，整个数据集的植入概率是0.28。

可以使用表4中所检验的所有变量来排除植入率非常低的胚胎，这是因为 在目标组以外的胚胎的植入成功率是0.23及低于0.23。两个标准，即cc2<5小 时以及cc3<5小时与低植入成功率有关。这可能归因于直接从1个卵裂球卵裂 成3个卵裂球以及直接从2个卵裂球卵裂成5个卵裂球，大体上指示在DNA复 制或细胞分裂中存在错配。具有这些不规则分裂模式的胚胎将具有不同步的延 时数据并且如果将它们包括在数据内，那么可能会干扰任何统计计算。cc1(t2) 长于32小时的胚胎也与低植入成功率相关并且是可能因卵母细胞不成熟而发育 缓慢的胚胎。

复合变量

另一个选择方案是利用使用主要形态动力学变量(发生时间和时间段)计算 的复合变量。尤其关注的是表示两个形态学时间段之间的比率的变量。这些类 型的归一化变量可以提供对于预测模型来说更佳的信息，这是因为它们可以去 除可能因温度和其他环境变量的差异所引起的一些可变性并且因为它们可能较 不易受到受精时间的定义的影响。这可以例如是cc2/cc2_3和cc3/cc2_3(前两个 细胞周期中第一细胞周期和第二细胞周期所占的分数)或s2/cc2和s3/cc3(第一细 胞周期或第二细胞周期的同步性相对于第一细胞周期或第二细胞周期的时间的 关系)。认为应当关注s3(t8-t5)中单个细胞分裂的发生时间，即s3a(t6-t5)、 s3b(t7-t6)、s3c(t8-t7)，这是因为它们可以表明各单个细胞进行细胞分裂的能力。 有丝分裂中可能存在的不规则性或异常可能会引起s3a、s3b和/或s3c值之间较 大的差异(即有一个非常高的最大值)。

表4：对复合变量、目标组、在目标组以内和以外的胚胎的植入成功率(概 率)、目标组和非目标组中观测的数目以及费雪精确检验的p值的四分位数分析。

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本发明另外的细节

现在将参考如下项目进一步详细地描述本发明：

1.一种用于确定胚胎质量的方法，所述方法包括监测胚胎一段时间，以及 测定所述胚胎的一个或多个质量标准，以及基于所述一个或多个质量标准确定 胚胎质量。

2.根据项目1的方法，其中通过多个所述质量标准，如通过将多个所述质 量标准组合来确定所述胚胎质量。

3.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准是与从二卵裂球胚胎 到八卵裂球胚胎或从四卵裂球胚胎到八卵裂球胚胎的阶段有关的标准。

4.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准是在从受精开始48小 时到72小时的时间段内所获得的标准。

5.根据前述项目中任一项的方法，其中对一群胚胎进行监测。

6.根据前述项目中任一项的方法，其中所述胚胎质量是与植入成功性有关 的质量。

7.根据前述项目中任一项的方法，其中将所述一个或多个质量标准与一个 或多个排除标准组合以淘汰和/或排除植入成功概率低的胚胎。

8.根据项目7的方法，其中排除标准是cc2和/或cc3少于5小时。

9.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对于卵裂成二卵裂球胚 胎、三卵裂球胚胎、四卵裂球胚胎、五卵裂球胚胎、六卵裂球胚胎、七卵裂球 胚胎和/或八卵裂球胚胎的时间的测定。

10.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准选自归一化形态学胚 胎参数的群组。

11.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准选自与从二卵裂球胚 胎到八卵裂球胚胎的阶段有关的归一化形态学胚胎参数的群组。

12.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是基于选自t2、t3、t4、 t5、t6、t7以及t8的群组的两个、三个、四个、五个或更多个参数的归一化形态 学胚胎参数。

13.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是基于选自t2、t3、t4、 t5、t6、t7以及t8的群组的四个参数的归一化形态学胚胎参数。

14.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是基于两个时间间隔的比 率，所述时间间隔中的每一个被测定为在胚胎发育中两个形态学事件之间的时 间段的持续时间。

15.根据项目14的方法，其中所述质量标准是归一化的形态学胚胎参数。

16.根据前述项目14至15中任一项的方法，其中所述形态学事件选自受精、 卵裂球开始卵裂以及卵裂球卵裂完成的群组。

17.根据前述项目10至16中任一项的方法，其中所述归一化的形态学胚胎 参数选自下组：

cc2/cc2_3＝(t3-t2)/(t5-t2)；

cc3/cc2_3＝(t5-t3)/(t5-t2)；

cc3/t5＝1-t3/t5；

s2/cc2＝(t4-t3)/(t3-t2)；

s3/cc3＝(t8-t5)/(t5-t3)；以及

cc2/cc3＝(t3-t2)/(t5-t3)。

18.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对 cc2/cc2_3＝(t3-t2)/(t5-t2)的测定。

19.根据项目18的方法，其中如果cc2/cc2_3＝(t3-t2)/(t5-t2)在0.38与0.5之 间，或在0.39与0.49之间，或在0.4与0.48之间，或在0.41与0.47之间，那 么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

20.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准是对t3/t5的测定。

21.根据项目20的方法，其中如果t3/t5大于0.6，或大于0.62，或大于0.64， 或大于0.66，或大于0.68，或大于0.7，或大于0.72，或大于0.74，那么所述质 量标准是高胚胎质量的指标。

22.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对s2/cc2＝(t4-t3)/(t3-t2) 的测定。

23.根据项目22的方法，其中如果s2/cc2＝(t4-t3)/(t3-t2)小于0.03，或小于 0.029，或小于0.028，或小于0.027，或小于0.026，或小于0.025，或小于0.024， 或小于0.023，或小于0.022，或小于0.021，或小于0.02，那么所述质量标准是 高胚胎质量的指标。

24.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对s3/cc3＝(t8-t5)/(t5-t3) 的测定。

25.根据项目22的方法，其中如果s3/cc3＝(t8-t5)/(t5-t3)小于0.25，或小于 0.23，或小于0.21，或小于0.2，或小于0.19，或小于0.18，或小于0.17，或小 于0.16，或小于0.15，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

26.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对于 cc2/cc3＝(t3-t2)/(t5-t3)的测定。

27.根据项目26的方法，其中如果cc2/cc3＝(t3-t2)/(t5-t3)在0.7与0.9之间， 或在0.71与0.89之间，或在0.72与0.88之间，那么所述质量标准是高胚胎质 量的指标。

28.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对在胚胎从4个卵裂球 发育成8个卵裂球时细胞分裂发生时间的不规则程度的测定。

29.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对在胚胎从4个卵裂球 发育成8个卵裂球时每个卵裂球的最长卵裂时间的测定。

30.根据项目29的方法，其中如果所述最长卵裂时间少于1.5小时，那么 所述质量标准是高胚胎质量的指标。

31.根据项目29的方法，其中如果所述最长卵裂时间少于2.5小时，或少 于2.3小时，或少于2.1小时，或少于2小时，或少于1.9小时，或少于1.8小 时，或少于1.7小时，或少于1.65小时，或少于1.6小时，或少于1.55小时， 或少于1.5小时，或少于1.45小时，或少于1.4小时，或少于1.35小时，或少 于1.3小时，或少于1.25小时，或少于1.2小时，或少于1.15小时，或少于1.1 小时，或少于1小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

32.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对在胚胎从4个卵裂球 发育成8个卵裂球时每个卵裂球的最长卵裂时间与从4个卵裂球到8个卵裂球 的总时间段的持续时间之间的比率的测定；即max(s3a、s3b、s3c)/s3。

33.根据项目32的方法，其中所述质量标准是归一化的形态学胚胎参数。

34.根据前述项目32至33中任一项的方法，其中如果所述比率小于0.5， 那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

35.根据前述项目32至33中任一项的方法，其中如果所述比率小于0.8， 或小于0.75，或小于0.7，或小于0.65，或小于0.6，或小于0.58，或小于0.56， 或小于0.54，或小于0.52，或小于0.5，或小于0.48，或小于0.46，或小于0.44， 或小于0.42，或小于0.4，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

36.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对卵裂成五卵裂球胚胎 的时间的测定。

37.根据项目36的方法，其中如果t5少于58小时，或少于57小时，或少 于56.5小时，或少于56.3小时，或少于56.2小时，或少于56.1小时，或少于 56小时，或少于55.9小时，或少于55.8小时，或少于55.7小时，或少于55.6 小时，或少于55.5小时，或少于55小时，或少于54.5小时，那么所述质量标 准是高胚胎质量的指标。

38.根据前述项目36至37中任一项的方法，其中如果t5多于46小时，或 多于47小时，或多于47小时，或多于48小时，或多于48.5小时，或多于48.7 小时，或多于48.9小时，或多于49小时，或多于49.1小时，或多于49.2小时， 或多于49.3小时，或多于49.4小时，或多于49.5小时，或多于49.6小时，或 多于49.7小时，或多于49.8小时，或多于49.9小时，或多于50小时，或多于 51小时，或多于52小时，或多于53小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的 指标。

39.根据项目36的方法，其中如果t5在48.7小时与55.6小时之间，那么 所述质量标准是高胚胎质量的指标。

40.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对卵裂成八卵裂球胚胎 的时间t8的测定。

41.根据项目36的方法，其中如果t8少于60小时，或少于59小时，或少 于58小时，或少于57.8小时，或少于57.6小时，或少于57.4小时，或少于57.2 小时，或少于57小时，或少于56.8小时，或少于56.6小时，或少于56.4小时， 或少于56.2小时，或少于56小时，或少于55小时，那么所述质量标准是高胚 胎质量的指标。

42.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对第二细胞周期持续时 间cc2的测定。

43.根据项目42的方法，其中如果cc2＝t3-t2少于14小时，或少于13.5小 时，或少于13小时，或少于12.9小时，或少于12.8小时，或少于12.7小时， 或少于12.6小时，或少于12.5小时，或少于12.4小时，或少于12.3小时，或 少于12.1小时，或少于12小时，或少于11.9小时，或少于11.9小时，或少于 11.8小时，或少于11.7小时，或少于11.6小时，或少于11.5小时，或少于11.4 小时，或少于11.3小时，或少于11.2小时，或少于11.1小时，或少于11小时， 或少于10.9小时，或少于10.8小时，或少于10.7小时，或少于10.6小时，或 少于10.5小时，或少于10小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

44.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对cc2b＝t4-t2的测定。

45.根据项目44的方法，其中如果cc2b＝t4-t2少于14小时，或少于13.9 小时，或少于13.8小时，或少于13.7小时，或少于13.6小时，或少于13.5小 时，或少于13.4小时，或少于13.3小时，或少于13.2小时，或少于13.1小时， 或少于13小时，或少于12.9小时，或少于12.8小时，或少于12.7小时，或少 于12.6小时，或少于12.5小时，或少于12.4小时，或少于12.3小时，或少于 12.1小时，或少于12小时，或少于11.9小时，或少于11.9小时，或少于11.8 小时，或少于11.7小时，或少于11.6小时，或少于11.5小时，或少于11.4小 时，或少于11.3小时，或少于11.2小时，或少于11.1小时，或少于11小时， 或少于10.9小时，或少于10.8小时，或少于10.7小时，或少于10.6小时，或 少于10.5小时，或少于10小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

46.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对第三细胞周期时间长 度cc3的测定。

47.根据项目46的方法，其中如果cc3＝t5-t3少于19小时，或少于18.5小 时，或少于18小时，或少于17.9小时，或少于17.8小时，或少于17.7小时， 或少于17.6小时，或少于17.5小时，或少于17.4小时，或少于17.3小时，或 少于17.2小时，或少于17.1小时，或少于17小时，或少于16.9小时，或少于 16.8小时，或少于16.7小时，或少于16.6小时，或少于16.5小时，或少于16.4 小时，或少于16.3小时，或少于16.2小时，或少于16.1小时，或少于16小时， 或少于15.8小时，或少于15.6小时，或少于15.5小时，或少于15.4小时，或 少于15.3小时，或少于15.1小时，或少于15小时，或少于14.9小时，或少于 14.9小时，或少于14.8小时，或少于14.7小时，或少于14.6小时，或少于14.5 小时，或少于14.4小时，或少于14.3小时，或少于14.2小时，或少于14.1小 时，或少于14小时，或少于13小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

48.根据项目46至47中任一项的方法，其中如果cc3＝t5-t3多于11小时， 或多于11.5小时，或多于12小时，或多于12.2小时，或多于12.4小时，或多 于12.5小时，或多于12.6小时，或多于12.7小时，或多于12.8小时，或多于 12.9小时，或多于13小时，或多于13.1小时，或多于13.2小时，或多于13.3 小时，或多于13.5小时，或多于14小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指 标。

49.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对cc2_3＝t5-t2的测定。

50.根据项目49的方法，其中如果cc2_3＝t5-t2少于32小时，或少于31小 时，或少于30小时，或少于29.8小时，或少于29.6小时，或少于29.5小时， 或少于29.4小时，或少于29.3小时，或少于29.2小时，或少于29.1小时，或 少于29小时，或少于28.9小时，或少于28.8小时，或少于28.7小时，或少于 28.6小时，或少于28.5小时，或少于28.4小时，或少于28.2小时，或少于28 小时，或少于27.5小时，或少于27小时，或少于26小时，那么所述质量标准 是高胚胎质量的指标。

51.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对从二卵裂球胚胎分裂 成四卵裂球胚胎的同步性s2＝t4-t3的测定。

52.根据项目51的方法，其中如果s2＝t4-t3少于3小时，或少于2.8小时， 或少于2.6小时，或少于2.4小时，或少于2.3小时，或少于2.2小时，或少于 2.1小时，或少于2小时，或少于1.8小时，或少于1.6小时，或少于1.4小时， 或少于1.2小时，或少于1小时，或少于0.9小时，或少于0.8小时，或少于0.7 小时，或少于0.6小时，或少于0.5小时，或少于0.45小时，或少于0.4小时， 或少于0.39小时，或少于0.38小时，或少于0.37小时，或少于0.36小时，或 少于0.35小时，或少于0.34小时，或少于0.33小时，或少于0.32小时，或少 于0.31小时，或少于0.3小时，或少于0.29小时，或少于0.28小时，或少于0.27 小时，或少于0.26小时，或少于0.25小时，或少于0.24小时，或少于0.22小 时，或少于0.2小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

53.根据前述项目中任一项的方法，其中质量标准是对从四卵裂球胚胎分裂 成八卵裂球胚胎的同步性s3＝t8-t5的测定。

54.根据项目53的方法，其中如果s3＝t8-t3少于5小时，或少于4.5小时， 或少于4.3小时，或少于4.2小时，或少于4.1小时，或少于4小时，或少于3.9 小时，或少于3.8小时，或少于3.7小时，或少于3.6小时，或少于3.5小时， 或少于3.4小时，或少于3.3小时，或少于3.2小时，或少于3.1小时，或少于3 小时，或少于2.9小时，或少于2.8小时，或少于2.7小时，或少于2.6小时， 或少于2.55小时，或少于2.53小时，或少于2.51小时，或少于2.5小时，或少 于2.4小时，或少于2.3小时，或少于2.2小时，或少于2.1小时，或少于2小 时，或少于1.8小时，或少于1.6小时，或少于1.4小时，或少于1.2小时，或 少于1小时，那么所述质量标准是高胚胎质量的指标。

55.根据前述项目中任一项的方法，其中将所述质量标准与对第二细胞周期 时间长度的测定相结合。

56.根据前述项目中任一项的方法，其中将所述质量标准与对从二卵裂球胚 胎卵裂成四卵裂球胚胎的同步性的测定相结合。

57.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量标准是对卵裂成五卵裂球 胚胎的时间的测定与对第二细胞周期时间长度的测定的组合。

58.根据项目9的方法，其中将所述质量标准进一步与对从二卵裂球胚胎卵 裂成四卵裂球胚胎的同步性的测定相结合。

59.根据前述项目中任一项的方法，其中确定胚胎质量进一步包括i)测定在 细胞卵裂期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布；和/或ii)测定在卵裂间期 内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布，从而获得胚胎质量的量度。

60.根据前述项目中任一项的方法，其中对胚胎进行监测包括至少三个细胞 周期，如至少四个细胞周期的一段时间。

61.根据前述项目中任一项的方法，其中对每个卵裂期的时间长度进行测 定。

62.根据前述项目中任一项的方法，其中对每个卵裂间期的时间长度进行测 定。

63.根据前述项目中任一项的方法，其中对至少两个卵裂间期内细胞运动的 时间段进行测定。

64.根据前述项目中任一项的方法，其中在至少两个卵裂间期内测定细胞运 动的程度。

65.根据前述项目中任一项的方法，其中所述质量量度包括至少一个排除标 准。

66.根据前述项目中任一项的方法，其中所述排除标准包括关于在t2时卵 裂球均匀性的信息、关于在二卵裂球期和/或在四卵裂球期多核现象的信息，和/ 或关于从一个卵裂球直接卵裂成三个卵裂球的信息。

67.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是cc2和/或cc3少于10 小时，或少于9.5小时，或少于9小时，或少于8.5小时，或少于8小时，或少 于7.5小时，或少于7小时，或少于6.5小时，或少于6小时，或少于5.5小时， 或少于5小时，或少于4.5小时，或少于4小时，或少于3.5小时，或少于3小 时，或少于2.5小时，或少于2小时，或少于1.5小时，或少于1小时。

68.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是t2多于28小时，或多 于28.5小时，或多于29小时，或多于29.5小时，或多于30小时，或多于30.5 小时，或多于31小时，或多于31.25小时，或多于31.5小时，或多于31.75小 时，或多于32小时，或多于32.5小时，或多于33小时，或多于33.5小时，或 多于34小时。

69.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是cc2b多于11小时，或 多于11.5小时，或多于12小时，或多于12.5小时，或多于12.75小时，或多于 13小时，或多于13.1小时，或多于13.25小时，或多于13.5小时，或多于14 小时，或多于14.5小时，或多于15小时。

70.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是cc3多于15小时，或 多于15.5小时，或多于16小时，或多于16.5小时，或多于17小时，或多于17.25 小时，或多于17.5小时，或多于17.6小时，或多于17.75小时，或多于18小时， 或多于18.5小时，或多于19小时，或多于19.5小时。

71.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是s2多于1小时，或多 于1.1小时，或多于1.2小时，或多于1.3小时，或多于1.4小时，或多于1.5小 时，或多于1.6小时，或多于1.7小时，或多于1.8小时，或多于1.9小时，或 多于2小时，或多于2.1小时，或多于2.2小时，或多于2.3小时，或多于2.4 小时，或多于2.5小时，或多于2.6小时，或多于2.7小时，或多于2.8小时， 或多于2.9小时，或多于3小时。

72.根据前述项目中任一项的方法，其中排除标准是s3多于2小时，或多 于2.2小时，或多于2.4小时，或多于2.6小时，或多于2.8小时，或多于3小 时，或多于3.1小时，或多于3.2小时，或多于3.3小时，或多于3.4小时，或 多于3.5小时，或多于3.6小时，或多于3.7小时，或多于3.8小时，或多于3.9 小时，或多于4小时，或多于4.1小时，或多于4.2小时，或多于4.3小时，或 多于4.4小时，或多于4.5小时，或多于4.6小时，或多于4.7小时，或多于4.8 小时，或多于4.9小时，或多于5小时，或多于5.25小时，或多于5.5小时，或 多于6小时。

73.根据前述项目中任一项的方法，其中在孵育箱中对胚胎进行监测。

74.根据前述项目中任一项的方法，其中经由图像获取，如每小时至少一次 图像获取，优选地每半小时至少一次图像获取来对胚胎进行监测。

75.一种用于对适用于移植的胚胎进行选择的方法，所述方法包括如项目1 至74中任一项中所定义对胚胎进行监测，从而获得胚胎质量量度，以及选择具 有最高胚胎质量量度的胚胎。

76.一种用于确定胚胎质量的系统，所述系统包括用于监测胚胎一段时间的 装置，所述系统进一步具有用于测定所述胚胎的质量标准的装置，并且具有用 于基于所述质量标准确定胚胎质量的装置。

77.根据项目76的系统，所述系统包括用于测定如项目1至74中任一项中 所定义的特征中的一个或多个的装置。