一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法

摘要

本发明提供了 一种简单、快速提取和纯化 Taq -DNA 聚合酶的方法 。该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性，简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤，缩短了操作时间和节约了成本。与已知的提取方法相比，我们的方法具有简单、快速和成本低的特点，完全去除了Taq-DNA聚合酶提取产物中的核酸污染。提取的Taq-DNA聚合酶可以应用于各种PCR反应中，包括实时定量PCR反应。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学及分子生物学领域，涉及一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法，适合用于大量低成本商业生产制备Taq-DNA聚合酶。

背景技术

PCR技术广泛应用于生物学、农学和医学的实验中，而其中分离自耐热菌Thermus aquaticus 的DNA聚合酶（Taq）是PCR技术的关键因子。编码该酶的基因已经转入大肠杆菌中高效表达，极大的提高了该酶的产量，大大降低了PCR技术的成本。Taq-DNA聚合酶全酶由832个氨基酸组成，大小94kD；去除该酶的5’到3’外切酶活性，大小变为61kD，称之为Stoffel片段。

Lawyer等首次将Taq-DNA聚合酶基因在大肠杆菌中表达，并利用该酶的热稳定性分离Taq-DNA聚合酶。75℃加热1小时，可以去除大部分杂蛋白。Engelke等（1990）进一步采用聚乙烯亚胺（polyethyleneimine）和BioRex 70纯化，他们的结果在SDS电泳中表现出一条Taq-DNA聚合酶的主带和几条杂蛋白的弱带。然而，采用这种分离方法，从裂解细菌开始至少需要忙碌一天，才能完成。1993年，Lawyer等发展了另一套分离纯化方法，他们的方法采用Polyethyleneimine和硫酸铵纯化，Phenyl-Sepharose CL-4B去除核酸。和Engelke方法比较，变得更复杂但去除了核酸的污染。实际上，提取液中的杂蛋白并不影响Taq-DNA聚合酶的酶活，但DNA的污染，可能会影响PCR反应，一些短的DNA片段可能会作为引物产生假阳性条带，特别是以大肠杆菌作为底物时进行PCR反应时。Pluthero（1993）简化了Engelke方法，采用硫酸铵沉淀，透析去除终产物中的硫酸根和铵根离子。目前，多数实验室自制Taq-DNA聚合酶采用这一方法，但我们发现，这一方法制作的Taq-DNA聚合酶混有少量的DNA，硫酸铵沉淀造成Taq-DNA聚合酶的较大损失，透析需要花费较多的时间。2012年，钟星等利用转基因大肠杆菌，经过简单加热，离心，直接提取分泌到培养基中的Taq-DNA聚合酶，但他们没有提供酶浓缩和纯化的方法。酶中的培养基残液未能去除。

和全酶相比，Stoffel片段表现出更强的热稳定性，这一性质被应用于对该酶的分离。采用沸水浴裂解细菌，离心去除变性杂蛋白，而后采用磷酸氢二钠和乙醇去除DNA，从而快速分离纯化Stoffel片段。我们曾试图采用这一方法分离Taq全酶，但遗憾的是，沸水浴并不能有效地裂解大肠杆菌，分离产物不能长期储存，-20℃放置两天，就可引起酶的失活。这些结果说明这一方法并不适用于Taq全酶的分离纯化，但我们偶然发现，乙醇可以有效的沉淀Taq-DNA聚合酶并保持其活性。因而，我们利用这一性质，改进Pluthero的提取方法，缩短了提取时间，简化了提取方法，提高了Taq-DNA聚合酶的质量和产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法，该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性，简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤，缩短了操作时间和节约了成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）接种：挑取含Taq-DNA聚合酶E.coli 单克隆，接种到3ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270 r/min，培养5-8 小时；

（2）扩大培养：将步骤（1）中培养好细菌液转接到500 ml 含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，37℃，270 r/min培养5-6小时至细菌OD₆₀₀ 值达到0.6-0.8；

（3）诱导Taq-DNA酶表达：加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，置于摇床，37℃, 270 r/min，培养12小时；

（4）收集菌体：将步骤（3）培养得到的菌液分装于50 ml离心管，8000 rpm 离心10min，弃上清，加入25ml Buffer A重悬菌液，8000 rpm 离心10min，弃上清；

（5）裂解菌体： 加入25 ml Buffer A重悬菌液，采用液氮和75 ^oC水浴中交替冻融两次，加入100mg溶菌酶，室温下放置10~20分钟，直至溶液变得粘稠，而后在溶液中加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至1mM；

（6）粗提：加入25 ml Buffer B，75℃水浴加热30 min后8000 rpm 离心15min，取上清；

（7）纯化：在上清液中先后加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，MgCl₂，DNase I以及RNase A处理5 min，75℃水浴加热30 min，8000 rpm 4℃ 离心10 mim，取上清，加入冰浴后的乙醇，终浓度为15%-99%，颠倒混匀，16000 g 4℃离心15 min，弃上清，沉淀溶于12.5mL Storage buffer，-20℃储存备用。

        所述的乙醇浓度为55%最佳。

所述LB液体培养基中含有氨苄青霉素终浓度50ug/ml。

步骤（3）中异丙基硫代半乳糖苷诱导剂终浓度0.5mM。

步骤（5）中溶菌酶含量为4mg/ml。

所述纯化步骤中蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟终浓度为1 mM，MgCl2终浓度0.5 mM，DNase I浓度为5 ug/ml，以及RNase A浓度为100 ug/ml。

实验过程中使用的主要试剂配方：

Buffer A：50mM Tris-HCl pH = 7.9，50mM 葡萄糖和1mM EDTA pH=8.0；

Buffer B：50mM Tris-HCl pH = 7.9，50mM KCl，1mM EDTA pH=8.0，0.5% Tween20和0.5% NP-40%；

Storage buffer：25mM Tris-HCl pH = 7.9，25mM KCl，0.1mM EDTA pH=8.0，50% 甘油，0.5mM PMSF，1mM DTT；      

其它试剂依照说明书使用。

本发明的优点在于：本发明提供了一种新的Taq-DNA聚合酶提取和纯化的方法。该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性，简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤，缩短了操作时间和节约了成本。与已知的提取方法相比，我们的方法具有简单、快速和成本低的特点，完全去除了Taq-DNA聚合酶提取产物中的核酸污染。提取的Taq-DNA聚合酶可以应用于各种PCR反应中，包括实时定量PCR反应。

附图说明

图1：DNase I和RNase A酶处理前后，粗酶和乙醇沉淀后的酶液中DNA和RNA的含量。取10μL样液，琼脂糖凝胶电泳。如图所示，经DNase I和RNase A处理后，酶液中DNA和RNA完全消失。

图2：电泳检测硫酸铵法[Pluthero FG（1993）的方法]和乙醇沉淀法所提酶液中DNA与RNA的污染。取10μL 酶液，琼脂糖凝胶电泳。如图所示，使用硫酸铵法所提取的酶液，经透析后还残留有少量的DNA，而使用本发明方法所制的酶液中无DNA残留。

图3：琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度乙醇沉淀的Taq-DNA 聚合酶活性。经40%、45%、50%、55%、66.7%（2倍体积的乙醇）和70%的乙醇纯化后，PCR反应测定后，琼脂糖电泳检测酶液的活力。M：标准长度的DNA；ck：表示商用酶，购置于上海生工生物工程有限公司；其中酶的量是稀释20倍以后所加入的量。所扩增的基因为水稻actin基因。

图4：不同浓度乙醇沉淀Taq DNA 聚合酶的SDS-PAGE电泳结果。M：标准分子量大小的蛋白质。

经40%、45%、50%、55%、66.7%（2倍体积的乙醇）和70%的乙醇纯化后，取10μL酶液，SDS-聚丙烯酰胺电泳检测酶液纯度和目标蛋白的含量。 

图5：低浓度乙醇沉淀Taq-DNA 聚合酶的活性测定。所扩增的基因为水稻actin基因。

图6：高浓度乙醇沉淀Taq-DNA 聚合酶的活性测定。所扩增的基因为水稻actin基因。

图7：对比分析硫酸铵沉淀的和乙醇沉淀的Taq-DNA聚合酶对不同大小片段的扩增。M：标准长度的DNA（从上到下分别为1.5kb、1kb、750bp、250bp和100bp）。Water：空白对照，所扩增基因分别为：1：拟南芥SMXL7片段（420bp）；2：SMXL6（749bp）；3：SMXL7（1147bp）；4：水稻Wrky10基因启动子（1460bp）。

图8：为本发明方法所制的Taq DNA 聚合酶用于qPCR 实验的扩增曲线。所扩增基因分别为：水稻Actin基因。

图9：为本发明方法所制的Taq DNA 聚合酶用于qPCR 实验的溶解曲线。所扩增基因分别为：水稻Actin基因。

具体实施方式

实施例一：

按上述实验方案，提取了Taq-DNA聚合酶，为检测 DNase I与 RNase A对酶液中的 DNA与 RNA处理效果，通过裂解细胞-加热离心-取上清，在上清中分别以不加 RNase A 和 DNase I、只加 DNase I、只加 RNase A以及同时加入RNase A 和 DNase I 为变量，处理后留样，其余样用乙醇沉淀。图1为10μL样液琼脂糖电泳结果。从图中可以看出DNase I与 RNase A可以有效的除去酶液中的DNA与RNA。

实施例二：

目前，实验室内制备Taq-DNA聚合酶主要应用的是Pluthero FG（1993）的方法。具体操作参照论文Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic acids research, 1993, 21(20): 4850-1。我们依照其实验方案，制备和纯化了Taq-DNA聚合酶。电泳检测发现采用该方法制备的酶液中含有少量DNA污染，而我们制备的酶则没有DNA污染（图2）。

实施例三：

为了鉴定不同浓度的乙醇对Taq-DNA聚合酶的影响，我们检测了不同浓度的乙醇对Taq-DNA聚合酶的纯化效果。含有Taq-DNA聚合酶的大肠杆菌菌株，经裂解、DNase I和RNase A处理后，分成六等份，加入乙醇分别至40%、45%、50%、55%、66.7%和70%，离心沉淀Taq-DNA聚合酶。而后加入等量的Storage buffer溶解该酶，取等量的酶液检测其活性。检测结果见图3。从图3看，不同浓度乙醇沉淀的酶，其酶活差异不大，但乙醇终浓度为55% 沉淀的Taq DNA 聚合酶活力最高。同时，取等量酶液，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶液中蛋白的纯度（图4）。66.7%和70%酶液中杂蛋白含量最高，但目标蛋白的含量不是最高的。40%、45%、50%、55%乙醇沉淀的酶液杂蛋白较少，而55%乙醇沉淀的酶中目标蛋白的含量最高。综上，我们认为，采用55%乙醇沉淀Taq-DNA聚合酶效果最好。

实施例四：

为了鉴定乙醇对Taq-DNA聚合酶纯化效果的下限和上限。含有Taq-DNA聚合酶的大肠杆菌菌株，经裂解、DNase I和RNase A处理后，分成九等份，加入乙醇分别至10%、15%、20%、25%、30%、35%、75%、80%和85%，离心沉淀Taq-DNA聚合酶。而后加入等量的Storage buffer溶解该酶，取等量的酶液检测其活性。检测结果见图5。从图5看，在低于15%浓度的乙醇的沉淀产物中，几乎不能检测到Taq-DNA聚合酶活性；而85%乙醇的沉淀物中，仍然有较强的酶活性（图6）。但随着乙醇浓度的升高，酶活力逐步下降。

实施例五：

为了检测本发明方案所提取的Taq-DNA聚合酶是否可以应用于常规PCR扩增，我们随机选取了4对扩增大小不同的引物，分别扩增拟南芥SMXL7片段、SMXL6、SMXL7基因和水稻Wrky10基因启动子片段，大小分别为420 bp，749 bp，1.147 kb和1.46 kb。由图7可见，本发明方案所提取的Taq-DNA聚合酶完全可以用于常规PCR反应，与硫酸铵沉淀[Pluthero FG（1993）的方法]所提取的酶没有差异。

实施例六：

本发明方案所提取的Taq-DNA聚合酶可以应用与Real-time PCR（qPCR）反应。反应依照下面PCR配方配置，

qPCR扩增体系：

反应在ABI 7500仪进行，扩增检测水稻actin基因，三次重复。图8和9分别为qPCR反应的扩增曲线和溶解曲线。可得本发明方法所制的Taq DNA 聚合酶适用于qPCR实验。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。