牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽及其应用

摘要

本发明公开了牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽及其应用。本发明利用重叠短肽分段表达技术，对CFP-10进行迟发型变态反应抗原肽的鉴定，最终鉴定出具有迟发型变态反应性的抗原肽为C-P

说明书

技术领域

本发明涉及抗原表位多肽，特别涉及牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗 原表位多肽，还涉及该表位多肽在检测牛分枝杆菌感染中的应用。本发明属于生物 技术领域。

背景技术

牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的 一种慢性消耗性人兽共患传染病，其特点是在多类器官或组织中形成结核结节、肉 芽肿、干酪样坏死和钙化病灶。牛结核病的潜伏期长短不一，通常为慢性，感染早 期一般无典型症状，主要表现为精神和食欲不振，逐渐消瘦，被毛凌乱无光泽，皮 肤无弹性，产奶量逐渐降低，由于感染部位和被感染组织损伤的程度不同，因而病 畜表现出的临床症状也不尽相同。

该病全年均可发生，流行范围遍布全世界，并且能通过奶液及奶制品传染给人 和犊牛，这给食品安全和公共卫生带来了重大的危害。近年来调查研究显示，该病 发病率呈上升趋势，给养牛业和畜牧业的发展造成了巨大的阻碍。世界卫生组织将 结核病列为全球重点防控的三大疫病之一，我国将牛结核病列为二类动物疫病。牛 型结核菌的易感动物种类繁多，几乎可以感染所有的温血动物，可感染包括有蹄动 物、灵长类等在内的50多种哺乳动物，其中奶牛最易感。同时，人结核病的重要 病因之一为牛分枝杆菌感染，研究表明，野生动物是牛分枝杆菌的一类重要保藏宿 主。因而牛分枝杆菌的存在，一直威胁着人类的健康，调查显示，人结核病例中， 有10％患者的病因是牛分枝杆菌感染。结核病已成为当前世界上成年人传染病中的 主要杀手，因而防制牛结核病对人类健康具有重要意义。

牛分枝杆菌，革兰氏染色与抗酸染色阳性，与结核分枝杆菌、卡介苗、非洲分 枝杆菌、田鼠分枝杆菌和卡耐提分枝杆菌共同组成结核分枝杆菌复合群，菌体形态 细长，略带弯曲，长度大约1～4×0.4μm，无鞭毛和芽孢、不产生内外毒素，属专性 需氧型，培养要求条件苛刻，生长周期长。研究发现，结核分枝杆菌复合群由同一 个祖先进化而来，它们在核苷酸水平上的相似度达到99.95％，且某些基因序列完全 一致，但是在进化过程中赋予了不同的宿主偏好、表型和致病性。由于其菌体成分 中脂质含量较高，导致其疏水性较强，这增强了结核菌对外界环境的抵抗力。而且 研究表明，结核菌的毒力强弱与其所含糖脂成分密切相关。

1996年Maheira等(Mahairas G G,Sabo P J,Hickey M J,et al.Molecular analysis of  genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M.bovis[J].Journal  of bacteriology,1996,178(5):1274-1282)，利用基因缺失杂交技术，比较卡介苗BCG 和致病性牛分枝杆菌，以此来研究卡介苗减毒机制的基因基础，研究结果表明：与 牛分枝杆菌相比，卡介苗上缺失3个基因区，分别命名为删除区域(RD)RD1、RD2、 RD3。其中一个为称为lhp的基因区，表达产物即被称为培养滤液蛋白-10，即CFP-10， 其编码基因为300bp，可编码100个氨基酸的多肽。CFP-10是重要的T细胞抗原，能 诱导机体产生细胞免疫和记忆性免疫应答，并且CFP-10能诱导刺激高水平IFN-γ的 产生和强烈的DTH反应，CFP-10在T、B细胞免疫应答过程中具有如此重要的作用， 而且BCG菌株基因组中又缺失这种蛋白的编码基因，基于此点，CFP-10在预防和诊 断试剂的开发研究中，成为了当前的热点。MPT64，相对分子量为24000，是结核 分枝杆菌在培养早、中期分泌释放于菌体外而游离于培养基中的一种蛋白，只有结 核分枝杆菌、牛分枝杆菌和某些BCG菌株能表达MPB64，而其他一些BCG菌株则 缺失此基因。RD2区基因包含11个ORF(Rv1978-Rv1988)，分别编码11个蛋白， Rv1980c，也即MPT64(Mycobacterium protein tuberculosis 64，MPT64)，是RD2区 的重要T细胞抗原，可以引起的细胞免疫应答水平较高，有研究证明，其可引起结 核阳性豚鼠皮内较强的迟发型变态反应，其在疫苗和诊断试剂方面表现出来的应用 潜能引起大量研究者的兴趣，是皮试诊断的优选抗原之一。MPT64中具有迟发性变 态反应的抗原肽M-P₁₁(NYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEA)已在研究中得到鉴定。

目前，对CFP-10和MPT64的应用研究，主要集中在诊断试剂的研制、新型疫 苗的研制及两种蛋白在流行病调查方面的应用。DavincDillon设计并获得了 CFP10-ESAT6融合蛋白，研究其引起的20例TST+健康者和20例TST-健康者的T 细胞增殖和IFN-γ释放量的情况，研究结果表明，PPD(+)者发生T细胞的增殖 反应的比例为70％，而在PPD(-)者中未见增殖反应的发生，研究还发现，IFN-γ 的释放量也与T细胞增殖反应呈明显相关性。Vordermeier H M等人，合成了来源于 CFP-10的短肽，并应用MTT法对各段短肽进行了增殖活性的测定。Sandra比较了 多种结核患者和包括BCG免疫的无结核对照组T细胞对ESAT-6和CFP-10反应的 差异，发现大多数活动性或经治疗的结核患者对ESAT-6(92％)和CFP-10(89％)有反 应，而在PPD阴性的对照组中则均不反应。体外T细胞分泌IFN-γ实验过程复杂， 限制了其在牛结核诊断中的应用，而仅作为该病的辅助诊断手段之一。

酶联免疫吸附试验(ELISA)方法虽具有简单，快速等特点，而且是近年来众多 研究者在诊断结核病方面的研究热点，但如前所述，该方法仅能作为结核病的辅助 诊断方法，其原因在于CFP-10并不是结核体液免疫的靶抗原，因此，其作为诊断 试剂而应用于结核病血清诊断方法(如ELISA)的意义不大。

目前，临床上最常用的结核菌感染的诊断方法是PPD皮内TST法，而且也是 OIE唯一推荐的牛结核诊断标准方法，但是，由于PPD是一种含有许多分枝杆菌蛋 白抗原的混合物，因此，其诊断结核的特异性较差。鉴于CFP-10和MPT64是结核 分枝杆菌和致病分枝杆菌相对特异的抗原，并且其在结核菌感染早期即出现，这在 众多研究中都得到了验证，说明其在皮试诊断中具有良好的特异性，若将其联合使 用，开发出一种新的牛结核皮试诊断试剂来代替牛结核诊断中的PPD，必将有良好 的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于在通过原核表达方式，采用重叠短肽分段技术，筛选出 CFP-10的迟发性变态反应性抗原表位，然后，将筛选出的表位基因与经验证具有较 强迟发型变态反应性的MPT64抗原表位肽M-P₁₁基因 (NYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEA，SEQ ID NO.5所示)串联，并进行基因优 化与表达，以获得在大肠杆菌中高效表达的新型DTH皮试诊断抗原，以此替代目 前牛结核皮试诊断中使用的结核菌素(PPD)，在致敏豚鼠皮内检验其迟发型变态反 应效力。

本发明的目的是通过以下技术手段实现的：

本发明以牛分枝杆菌C68001基因组DNA为模板，经PCR获得CFP-10基因， 连入pET32a(+)载体，并将构建的重组质粒pET32a-CFP-10转化大肠杆菌Rosetta 感受态中，经IPTG诱导5h后得到可溶性表达的目的蛋白，纯化后的重组蛋白在致 敏豚鼠皮内检验其迟发型变态反应性(DTH)，试验结果表明，重组蛋白rCFP-10 具有较强的迟发型变态反应性。然后，利用重叠短肽分段表达技术，对CFP-10进 行迟发型变态反应抗原肽的鉴定，共进行了3轮鉴定，每轮鉴定均在致敏豚鼠皮内 完成，最终鉴定出CFP-10具有迟发型变态反应性的抗原肽为C-P_C(AQAAVVRFQE AANKQKQELD，SEQ ID NO.1所示)和C-P_B7 (EISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALS，SEQ ID NO.2所示)。将鉴定出的两抗原 肽C-P_C和C-P_B7与M-P₁₁通过基因工程手段以Linker序列(GGGGS)进行连接， 基因优化以使其在大肠杆菌中高效表达，串联肽基因命名为CCM基因，其核苷酸 序列如SEQ ID NO.7所示，构建了表达单拷贝及多拷贝串联肽基因的重组质粒 pET30a-CCM、pET30a-2CCM、pET30a-4CCM、pET30a-6CCM、pET30a-8CCM、 pET30a-12CCM，分别转入大肠杆菌Rosetta感受态中，经IPTG诱导5h后，通过 SDS-PAGE分析发现，2CCM的表达量最高且为可溶性表达，因而选取2CCM作为 皮试诊断抗原，并在致敏豚鼠皮内检验其迟发型变态反应性，结果表明，串联抗原 肽2CCM组的迟发型变态反应反应性强于单个抗原肽组，2CCM组与CCM相比， 无明显差异。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反 应抗原表位多肽，其特征在于所述抗原表位多肽命名为C-P_C或C-P_B7，其氨基酸序 列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

编码所述的迟发型变态反应抗原表位多肽的核苷酸序列，优选的，所述的核苷 酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，更优选的，所述的核苷酸序列为经过 旨在提高表达宿主特异性的密码子利用率的基因优化改造后得到的核苷酸序列。

进一步的，本发明还提出了所述的牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原 表位多肽及其编码核苷酸序列在制备牛结核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应 用。

在上述研究的基础上，本发明的另一个目的是提供一种牛结核迟发型变态反应 皮试诊断抗原(单拷贝，命名为CCM)，其特征在于所述的皮试诊断抗原是通过将 所述的牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位多肽C-P_C和C-P_B7与经验证 具有较强迟发型变态反应性的MPT64抗原表位肽M-P₁₁经Linker序列串联后得到 的。

在本发明中，优选的，所述的MPT64抗原表位肽M-P₁₁的氨基酸序列如SEQ ID  NO.5所示。

在本发明的一个具体实施例中，所述皮试诊断抗原的氨基酸序列如SEQ ID  NO.6所示。

进一步的，本发明还提出了所述的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原在制备 牛结核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。

在上述研究的基础上，本发明的再一个目的是提供一种多拷贝的牛结核迟发型 变态反应皮试诊断抗原，其特征在于所述多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断 抗原是由2-12个以上所述的单拷贝皮试诊断抗原(CCM)经Linker序列串联后得 到。

在本发明中，优选的，所述的多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗原， 其特征在于所述皮试诊断抗原由2个单拷贝皮试诊断抗原(CCM)经串联后得到， 所述串联肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示(命名为2CCM)。

进一步的，本发明还提出了所述的多拷贝的牛结核迟发型变态反应皮试诊断抗 原在制备牛结核迟发型变态反应皮试诊断试剂中的应用。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1、选择CFP-10、MPT64作为牛结核DTH皮试诊断抗原表位来源

CFP-10和MPT64为牛结核分枝杆菌介导细胞免疫的主要优势抗原，在牛结核 分枝杆菌培养早期分泌到培养滤液中，大量动物试验表明，在牛结核感染早期，两 种蛋白均具有出现时间早，分泌量大，持续时间长，介导细胞免疫水平高等特点， 因而具有较好的疫苗开发及诊断试剂研发的潜力。而且由于在BCG和非典型分枝 杆菌中该两种蛋白基因缺失，因而可以解决PPD存在的特异性差的问题，以达到鉴 别牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的目的；

2、通过构建串联肽提高诊断的敏感性

将筛选出的2个具有DTH反应性的抗原肽C-P_C、C-P_B7及经验证具有DTH反 应性的抗原肽M-P₁₁，采用Linker(GGGGS)串联构建的皮试诊断抗原，具有活动 性好，易于折叠等优点。利用某些特定限制性内切酶酶切消化后具有相同的粘性末 端，即同尾酶原理，构建多拷贝串联肽，提高了诊断的敏感性，同时，为了提高表 达量，对其进行基因优化，使其在大肠杆菌中更加高效的表达，便于未来大量生产；

3、采用原核表达方式制备新型皮试诊断抗原

采用原核表达方式制备新型皮试诊断抗原，生产周期短，仅需几天就可获得大 量蛋白，而且操作简便，易于大量生产，这解决了PPD的生产周期长等方面的问题， 更重要的是避免了生产过程中工作人员受到病原菌威胁的风险，这对诊断试剂的生 产提供很大的方便，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为第一轮筛选时的CFP-10短肽分段设计图；

图2为第二轮筛选时的CFP-10短肽分段设计图；

图3为串联肽CCM设计示意图；

图4为融合蛋白rCFP-10表达及纯化后的SDS-PAGE分析；

M.蛋白质分子量标准；1.Rosetta-pET-32a IPTG诱导5h后；2.

Rosetta-pET-32a-CFP-10诱导前；3.Rosetta-pET-32a-CFP-10IPTG诱导5h后；4.

Rosetta-pET-32a IPTG诱导5h后；5.未纯化的rCFP-10；6.纯化的rCFP-10

图5为重组蛋白rCFP-10致敏豚鼠DTH皮试；

A.2μg rCFP-10；B.1μg rCFP-10；C.0.5μg rCFP-10；

D.4μg rCFP-10；E.10IU PPD；F.4μg pET32a空载体蛋白对照

A.2μg rCFP-10；B.1μg rCFP-10；C.0.5μg rCFP-10；

D.4μg rCFP-10；E.10IU PPD；F.Negative control of 4μg pET32a

图6为重组蛋白rCFP-10致敏豚鼠DTH皮试；

图7为融合蛋白C-P_A1～P_A4的表达及纯化后的SDS-PAGE分析；

M.蛋白质分子量标准；1～4.Rosetta-pET-32a-C-P_A1～P_A4IPTG诱导5h；5.

Rosetta-pET-32a IPTG诱导5h；6～9.纯化的C-P_A1～P_A4

图8为重组蛋白C-P_A1～P_A4在致敏豚鼠的DTH皮试；

图9为融合蛋白C-P_B1～P_B8的表达及纯化后的SDS-PAGE分析；

M.蛋白质分子量标准；1.Rosetta-pET-32a IPTG诱导5h；

2～9.Rosetta-pET-32a-C-P_B1～P_B8IPTG诱导5h；10～17.纯化的C-P_B1～P_B8

图10为重组蛋白C-P_B1～P_B8在致敏豚鼠的DTH皮试；

图11为融合蛋白C-P_C的表达及纯化后的SDS-PAGE分析；

M.蛋白质分子量标准；1.Rosetta-pET-32a-C-P_C IPTG诱导5h；2.纯化的C-P_C

图12为重组蛋白C-P_C在致敏豚鼠的DTH皮试；

图13为5段合成肽在致敏豚鼠的DTH皮试；

图14为融合串联肽的表达及纯化后的SDS-PAGE分析；

M.蛋白质分子量标准；1.Rosetta-pET-30a IPTG诱导5h；

2.Rosetta-pET-30a-CCM IPTG诱导5h；3.Rosetta-pET-30a-2CCM IPTG诱导5h；4.

Rosetta-pET-30a-4CCM IPTG诱导5h；5.Rosetta-pET-30a-6CCM IPTG诱导5h；6.

Rosetta-pET-30a-8CCM IPTG诱导5h；7.Rosetta-pET-30a-12CCM IPTG诱导5h；8.

pET30a-2CCM诱导后裂解上清；9.pET30a-2CCM诱导后裂解沉淀；10.

pET30a-4CCM诱导后裂解上清；11.pET30a-4CCM诱导后裂解沉淀

图15为重组蛋白CCM、2CCM在致敏豚鼠的DTH皮试。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所涉及的实验材料：

1、质粒、载体、菌种

牛分枝杆菌68001基因组由哈药集团生物疫苗有限公司惠赠、表达载体 pET-30a(+)和pET-32a(+)、Ecoli.TG1及Ecoli.Rosetta(DE3)pLysS均由本实验室保存。

2、实验动物

豚鼠(250g-300g)购自哈药集团生物疫苗有限公司。

3、工具酶

ExTaq DNA聚合酶，rTaq DNA聚合酶，T4DNA Ligase购自New England  BioLabs(NEB)，限制性内切酶类EcoR Ⅰ、HindⅢ、BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ等购 自宝生物工程(大连)有限公司。

4、分子生物学试剂

Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker、Trans2K DNA Marker、Uist Protein Marker、dNTP 等购自北京全式金生物科技有限公司；His蛋白纯化填料介质购自南京金斯瑞生物 技术有限公司；质粒小量提取及小量胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)和蛋 白纯化柱均购自北京百泰克生物公司。

5、其他试剂

IPTG购自宝生物工程(大连)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自德美生物 有限公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、十二烷基磺酸钠(SDS)为 Sigma公司进口分装；丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、 甘氨酸、过硫酸氨、Tris-base、Tris-Cl、四甲基乙二胺(TEMED)等购自哈尔滨宝 泰克生物科技公司；考马斯亮蓝R250购自哈尔滨万太生物科技公司。

磷酸氢二钾、EDTA、磷酸氢二钠、甲醇磷酸二氢钠均购自天津光复精细化工 研究所；氯化钠、氯化钾、氯仿、无水乙醇均购自天津市天力化学试剂有限公司； 琼脂粉购自万太生物有限公司；所有化学试剂均属于分析纯。

6、主要实验仪器设备

超净工作台：DL-CJ-2N型，北京东联哈尔滨有限公司

电泳仪：Savant PS4000型，LINE VOLTAGE公司

凝胶分析仪：Multilmage^TM Light Cabinet Alpha Innotech Corporation

PCR仪：Eppendorf mastercyclerep gradients

纯水仪：Millipore Milli-QII

电热恒温培养箱：LTI-700型，上海爱朗仪器有限公司

离心机：5418型，eppendorf

pH计：METTER TOLEDO MP 220

电热恒温水槽：DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司

电子天平：METTER AE260型，Deltalange公司

微量移液器：Eppendorf、GILSON

高压灭菌器：HICLAVE HVE-50型，日本Hirayama公司

实施例1牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位的鉴定

方法：

1、牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应性鉴定

1.1牛分枝杆菌CFP-10基因的扩增的引物设计

根据GenBank中登录的牛分枝杆菌H37Rv株(NC_000962.3)CFP-10基因序列 设计1对引物，在正向上游引物5’端引入保护性碱基及EcoRI酶切位点，反向下游 引物5’端引入保护性碱基、HindⅢ酶切位点及终止密码子(见表1)，下划线部分为 引入的限制性内切酶的酶切位点，引物由北京华大基因公司合成。

表1牛分枝杆菌CFP-10基因扩增引物

1.2PCR反应及PCR产物回收

利用梯度PCR进行扩增，反应体系(25μL)如下：

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火59℃30s，延伸72℃30s， 30个循环；终延伸72℃10min；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。然后，利用百 泰克胶回收试剂盒对CFP-10基因片段的PCR产物进行纯化回收。

1.3表达载体的构建

用EcoRI、HindⅢ双酶切pET-32a(+)表达载体和CFP-10基因的PCR纯化产物，具 体酶切体系(50μL)如下：

将pET-32a表达载体酶切产物和CFP-10基因酶切产物，利用百泰克胶回收试剂 盒进行纯化。-20℃保存备用。

将纯化后的pET-32a表达载体酶切产物与纯化后的CFP-10基因酶切产物片段连 接，16℃连接过夜，连接体系(10μL)如下：

参照《分子克隆实验指南》(第三版)，将连接产物转化入感受态TG1中，于 每种转化平板内随机挑取4个菌落，接种至含有氨苄青霉素的LB液体培养基内， 37℃震荡10h后，碱裂解法提取质粒。

对重组质粒进行PCR及EcoR Ⅰ，HindⅢ双酶切鉴定。用琼脂糖凝胶电泳检测 酶切片段的大小。

PCR反应体系(25μL)：

EcoR Ⅰ，HindⅢ双酶切反应体系(10μL)：

37℃水浴酶切1.5h，取5μL酶切产物进行琼脂糖(0.8％)凝胶电泳检测。

重组质粒经酶切鉴定正确后，命名为pET-32a-CFP-10。将阳性菌送至北京华大 基因公司进行测序。

1.4目的蛋白的诱导表达及纯化

将经测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌感受态Rosetta(DE3)pLysS，将阳 性质粒pET-30a-CFP-10的菌液和空载体质粒pET-32a的菌液同时接种到含有 1‰Amp的LB液体培养基中，37℃培养到菌液的OD_600nm为0.4～0.6时，加入终浓 度为1.0mmol/L的IPTG进行诱导表达，测定诱导5h后的阳性菌和阴性菌的OD_600nm值。当OD_600nm值在1.2～1.4之间时，收集菌液，12000r/min离心5min，菌体沉淀 用0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液重悬，重悬用PBS(μL)＝菌液OD₆₀₀值×50， 加入等体积含DTT的2×SDS上样缓冲液，沸水中裂解10min，12000r/min离心2min 后备用。参照《分子克隆实验指南》(第三版)中的制胶方法进行重组蛋白SDS-PAGE 分析。

使用亲和层析过柱方式进行目的蛋白的纯化，通过SDS-PAGE分析蛋白纯化情 况。

1.5豚鼠致敏

以液体石蜡为佐剂，制备灭活牛分枝杆菌致敏原，与PPD同时使用，对25只 豚鼠单侧大腿内侧肌肉注射0.5mL致敏原，并在致敏后35d检验其致敏效果。

1.6皮试最佳注射剂量的确定

豚鼠躯干两侧背部去毛后，将纯化后的重组蛋白rCFP-10以每点100μL(含 0.5μg、1μg、2μg、4μg蛋白)的剂量在致敏豚鼠皮内注射，在注射后第24-48h观 察其DTH反应结果，并测量其DTH反应红斑直径，以PPD作为标准对照，用量为 每个注射点10IU，以无关蛋白BSA和PBS作为阴性对照，以确定致敏豚鼠皮试的 最佳注射剂量。

1.7目的蛋白在致敏豚鼠皮内的DTH鉴定

确定皮内最佳注射剂量为2μg/100μL，将纯化后的重组蛋白rCFP-10以每点 100μL(含2μg蛋白)的剂量在致敏豚鼠皮内注射，在注射后第24-48h观察其DTH 反应结果，并测量其DTH反应红斑直径，以PPD作为阳性对照，以无关蛋白BSA 和PBS作为阴性对照。

2、牛分枝杆菌CFP-10迟发型变态反应性抗原表位的初步筛选

2.1CFP-10分段设计与引物合成

牛分枝杆菌CFP-10抗原表位的初步筛选设计示意图如图1所示。设计4个覆盖 CFP-10的短肽片段，大小为38-42aa，相互重叠20aa。设计并合成了4对引物，在 正向上游引物5’端引入保护性碱基及EcoRI酶切位点，反向下游引物5’端引入保护 性碱基、HindⅢ酶切位点及终止密码子(见表2)，引物由北京华大基因公司合成。

表2CFP-10分段表达引物

2.2目的基因的获取及表达载体的构建

(1)目的基因的获取

利用梯度PCR进行扩增，反应体系同1.2

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火(温度见表2-2)30s， 延伸72℃30s，30个循环；终延伸72℃10min；4℃保存,然后利用百泰克胶回收试 剂盒对4个片段的PCR产物进行纯化回收，备用。

(2)表达载体的构建

用EcoRI、HindⅢ双酶切pET-32a(+)表达载体和C-P_A1～P_A4的PCR纯化产物，具 体酶切体系、产物回收及重组表达载体的构建方法参考1.3。

(3)对重组质粒进行EcoRⅠ单酶切及EcoRⅠ，HindⅢ双酶切鉴定。用琼脂糖 凝胶电泳检测酶切片段的大小。具体酶切体系如参照1.3。

重组质粒分别经酶切鉴定后，命名为pET-32a-C-P_A1～P_A4。将阳性菌送至北京华 大基因有限公司进行测序。

2.3目的蛋白的诱导表达、纯化及其DTH鉴定

将阳性质粒pET-32a-C-PA1～PA4的菌液和空载体质粒pET-32a的菌液按照1.4 的方法，进行诱导表达及纯化。

按照1.6节的方法，对表达纯化后的4段重组蛋白在致敏豚鼠皮内作DTH检测， 以PPD和纯化后的rCFP-10作为阳性对照，以无关蛋白BSA和PBS作为阴性对照。

3、牛分枝杆菌CFP-10的DTH抗原表位的第二轮筛选

3.1引物设计与合成

根据第一轮筛选结果，对C-P_A3和C-P_A4两个短肽合并为一段进行第二轮抗原表 位筛选。设计8个大小为25-27aa短肽片段，相互重叠20aa(见图2)，并合成了8 对引物，在正向上游引物5’端引入保护性碱基及EcoRI酶切位点，反向下游引物5’ 端引入保护性碱基、HindⅢ酶切位点及终止密码子。(见表3)。由北京华大基因有 限公司合成。

3.2目的基因的获取及表达载体的构建

(1)目的基因的获取

利用梯度PCR同行扩增，反应体系同1.2。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火(引物序列见表3)30s， 延伸72℃30s，30个循环；终延伸72℃10min；4℃保存。PCR产物用百泰克胶回收 试剂盒回收，同1.2。

(2)表达载体的构建

用EcoRI、HindⅢ双酶切pET-32a(+)表达载体和C-P_B1～P_B8的PCR纯化产物，具 体酶切体系、产物回收体系及重组表达载体的构建方法参考1.3。

(3)对重组质粒进行EcoR Ⅰ单酶切及EcoR Ⅰ，HindⅢ双酶切鉴定。用琼脂糖 凝胶电泳检测酶切片段的大小。具体酶切体系如参照1.3。

重组质粒分别经酶切鉴定后，命名为pET-32a-C-P_B1～P_B8。将阳性菌送至北京华 大基因有限公司进行测序。

表3CFP-10分段表达引物

3.3目的蛋白的诱导表达、纯化及其DTH鉴定

将阳性质粒pET-32a-C-P_B1～P_B8的菌液和空载体质粒pET-32a的菌液按照1.4的 方法，进行诱导表达及纯化。

按照1.6节的方法，对表达纯化后的8段重组蛋白在致敏豚鼠皮内作DTH检测， 以PPD和纯化后的rCFP-10作为阳性对照，以无关蛋白BSA和PBS作为阴性对照。

4、牛分枝杆菌CFP-10抗原表位的第三轮筛选

4.1第三轮筛选的寡聚核酸片段的合成

根据第二轮筛选结果，需对C-P_B2与C-P_B3的重叠段进行第三轮鉴定。确定其重 叠段是否仍然具有DTH反应性，大小为20aa，命名为C-P_C。根据表4所示引物， 有北京华大基因公司合成，合成后的两个核苷酸片段，可退火后合成双链核苷酸片 段。

表4CFP-10第三轮鉴定引物

4.2短肽C-P_C表达载体的构建

(1)寡聚核酸片段的磷酸化与退火反应

将合成的寡聚核酸片段，正义链和反义链5’末端加磷反应，反应体系(20μL)：

37℃水浴30min，95℃退火5min后降至室温，即为退火合成的具有黏性末端的基 因片段。

(2)C-P_C基因与表达载体pET-32a载体连接反应

反应体系(10μL)：

轻轻混匀后，16℃连接过夜，连接产物命名为pET-32a-C-P_C。

(3)连接产物pET-32a-C-PC的转化和质粒的提取，方法参见1.3。

(4)重组质粒pET-32a-C-PC的鉴定，方法参见1.3。

4.3目的蛋白的诱导表达、纯化及其DTH鉴定

将阳性质粒pET-32a-C-PC的菌液和空载体质粒pET-32a的菌液按照1.4的方法， 进行诱导表达及纯化。

按照1.6节的方法，对表达纯化后的重组蛋白C-PC在致敏豚鼠皮内作DTH检 测，以PPD和纯化后的rCFP-10作为阳性对照，以无关蛋白BSA和PBS作为阴性 对照。

5、合成肽的迟发型变态反应原性验证

采用合成肽方法，选取文献中报道的5段具有迟发性变态反应原性的抗原肽段， 由武汉明皓生物技术有限公司合成，如表5所示，分别为M-P11(Oettinger T,Holm  A,Mtoni I M,et al.Mapping of the delayed-type hypersensitivity-inducing epitope of  secreted protein MPT64from Mycobacterium tuberculosis[J].Infection and immunity, 1995,63(12):4613-4618.)、E-P8(Elhay M J,Oettinger T,Andersen P.Delayed-type hypersensitivity responses to ESAT-6and MPT64from Mycobacterium tuberculosis in  the guinea pig[J].Infection and immunity,1998,66(7):3454-3456.)、BCG-a-P(Minden  P,Houghten R A,Spear J R,et al.A chemically synthesized peptide which elicits  humoral and cellular immune responses to mycobacterial antigens[J].Infection and  immunity,1986,53(3):560-564.)、38G(Vordemeier H M,Harris D P,Roman E,et al. Identification of T cell stimulatory peptides from the 38-kDa protein of Mycobacterium  tuberculosis[J].The journal of Immunology,1991,147(3):1023-1029.)、T18(Mackall J  C,Bai G H,Rouse D A,et al.A comparison of the T cell delayed-type hypersensitivity  epitopes of the 19-kD antigens from Mycobacterium tuberculosis and Myco. intracellulare using overlapping synthetic peptides[J].Clinical&Experimental  Immunology,1993,93(2):172-177)，并在致敏豚鼠皮内验证其迟发型变态反应原性。

表5合成肽序列

结果：

1、牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应性鉴定

1.1CFP-10基因的PCR扩增结果

利用合成的1对引物，以牛分枝杆菌基因组为模板，经PCR反应扩增得到了 长度在300bp左右的1个基因片段。

1.2表达载体pET-32a-CFP-10的构建

获得的重组质粒进行PCR和酶切鉴定，PCR结果(300bp左右)和酶切结果 (5400bp和300bp两条带)与预期相符。阳性克隆送交北京华大基因公司测序，分 析比对测序结果后，证实基因正确，备用。

1.3CFP-10基因的诱导表达及纯化

SDS-PAGE结果表明，CFP-10在Rosetta菌中获得了表达，大小与预期相符， 如图4A所示。表达的融合蛋白纯化后，SDS-PAGE结果表明，融合蛋白rCFP-10 得到了有效的纯化，如图4B所示。

1.4最佳注射剂量的确定

纯化后的重组蛋白rCFP-10以每点100μL(含0.5μg、1μg、2μg、4μg蛋白)的 剂量在致敏豚鼠皮内注射后24-48h的DTH反应结果，如图5所示，注射剂量大于 2μg时期DTH红斑直径基本不变，并且其红斑直径接近于PPD注射点，因而，确 定100μL含有2μg重组蛋白rCFP-10作为DTH皮试诊断的最佳注射剂量。

1.5目的蛋白rCFP-10在致敏豚鼠皮内的DTH鉴定

将纯化后的重组蛋白rCFP-10，以100μL(含2μg蛋白)剂量，在致敏豚鼠皮 内作DTH检测，以验证其DTH反应强度，结果显示其DTH反应性接近PPD，皮 试DTH红斑直径可达9mm左右，PPD阳性对照组为13mm左右，如图6所示。

2、牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位的初步筛选

2.1C-P_A1～P_A4基因的PCR扩增结果

利用合成的4对引物，以pET-32a-CFP-10为模板，经PCR反应扩增得到了长 度在100bp左右的4个基因片段，其大小与预期相符，将PCR产物回收后连入pET32a 载体。

2.2表达载体pET-32a-C-P_A1～P_A4的构建

获得的重组质粒进行PCR鉴定，PCR结果与预期相符，为100bp左右。阳性 克隆送交北京华大基因公司测序，分析比对测序结果后，证实基因正确，备用。

2.3C-P_A1～P_A4基因的诱导表达及纯化

SDS-PAGE结果表明，融合蛋白C-P_A1～P_A4在Rosetta菌中获得了表达，大小 与预期相符，如图7A所示。表达的融合蛋白纯化后，SDS-PAGE结果表明，融合 蛋白C-P_A1～P_A4均得到了有效的纯化，如图7B所示。

2.4目的蛋白C-P_A1～P_A4在致敏豚鼠皮内的DTH鉴定

将纯化后的重组蛋白C-P_A1～P_A4，以100μL(含2μg蛋白)剂量，在致敏豚鼠皮 内作DTH检测，结果表明：C-P_A1、C-P_A2在致敏豚鼠皮内的DTH反应性较弱，C-P_A3、 C-P_A4显示了较强的DTH反应性，其DTH皮试红斑直径可达8mm左右，如图8所 示。

3、牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应性抗原表位的第二轮

3.1C-P_B1～P_B8基因的PCR扩增结果

利用合成的8对引物，以pET-32a-CFP-10为模板，经PCR反应扩增得到了长 度在75bp左右的8个基因片段。

3.2表达载体pET-32a-C-P_B1～P_B8的构建

获得的重组质粒进行PCR及酶切鉴定，PCR及酶切结果结果与预期相符。阳 性克隆送交北京华大基因公司测序，分析比对测序结果后，证实基因正确，备用。

3.3C-P_B1～P_B8基因的诱导表达及纯化

SDS-PAGE结果表明，融合蛋白C-P_B1～P_B8在表达宿主菌Rosetta中获得了大 量表达，大小与预期相符。表达的融合蛋白纯化后的SDS-PAGE结果表明，融合蛋 白C-P_B1～P_B8均得到了有效的纯化，如图9所示。

3.4目的蛋白C-P_B1～P_B8在致敏豚鼠皮内的DTH鉴定

将纯化后的重组蛋白C-P_B1～P_B8，以100_μL(含2_μg蛋白)剂量，在致敏豚鼠皮 内作DTH检测，结果表明：C-P_B2、C-P_B3、C-P_B7(EISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALS，SEQ ID NO.2所示)在致敏豚鼠皮内的 DTH反应性较强，其DTH皮试红斑直径均可达8mm左右，如图10所示。

4、牛分枝杆菌CFP-10的迟发型变态反应抗原表位第三轮筛选

4.1目的蛋白C-P_C的表达与纯化

退火合成的C-P_C基因连入pET32a后，经鉴定并测序分析正确，在大肠杆菌 Rosetta中表达，并得到了有效的纯化，如图11所示。

4.2目的蛋白C-P_C在致敏豚鼠皮内的DTH鉴定

将纯化后的重组蛋白C-P_C(AQAAVVRFQE AANKQKQELD，SEQ ID NO.1所 示)，在致敏豚鼠皮内作DTH检测，结果表明：C-P_C在致敏豚鼠皮内的DTH反应 性较强，其DTH皮试红斑直径均可达8mm左右，如图12所示。

4.3合成肽的迟发型变态反应原性验证

将合成的5段短肽，均以100μL(含2μg蛋白)的剂量，在致敏豚鼠皮内验证 其迟发型变态反应原性的结果如图13所示，其中M-P₁₁表现了较强的DTH反应性。

实施例2牛结核新型皮试诊断抗原的制备及初步应用

方法：

1、皮试诊断抗原基因的设计、优化及合成

将已鉴定出的DTH抗原肽C-P_C(SEQ ID NO.1所示，20aa)和C-P_B7(SEQ ID  NO.2所示，25aa)与M-P₁₁(SEQ ID NO.5所示，25aa)进行串联，如图3所示， 在B位置，即抗原肽之间以Linker(氨基酸序列为GGGGS)连接，在串联肽末端 (C位点)也引入Linker，但不同的是，其编码Linker最后两个氨基酸(GS)的核 苷酸序列必须为BamHⅠ酶切位点。此外，在串联肽核苷酸序列的前端(A位点) 引入BglⅡ酶切位点，末端(E位点)引入XhoⅠ酶切位点，XhoⅠ酶切位点前(D 位点)引入终止密码子TAA。

将经如上改造后的基因序列，在不改变A、C、D、E位点的酶切位点和终止密 码子，且在其他位置不出现以上3种酶切位点核苷酸序列的前提下，进行基因优化， 使其在大肠杆菌中大量表达。优化后的基因如SEQ ID NO.7所示，由南京金斯瑞生 物科技有限公司合成。

2、皮试诊断抗原表达载体的构建

合成的基因命名为CCM，将其连入pET30a体系参见实施例1(1.3节)，重组 质粒pET30a-CCM经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ回收pET30a-CCM片段，相同质粒经BglⅡ 和XhoⅠ双酶切回收CCM片段，利用BglⅡ和BamH Ⅰ酶切位点基因序列被各自限 制性内切酶消化后具有互补的粘性末端的特点，将pET30a-CCM片段与CCM片段 连接，连接后产生的重组质粒即为pET30a-2CCM，同理，获得质粒pET30a-4CCM、 pET30a-6CCM、pET30a-8CCM、pET30a-12CCM。

3、皮试诊断抗原的表达及纯化

将重组质粒经酶切鉴定正确后，送北京华大基因有限公司测序，测序均正确后， 将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta感受态中，通过IPTG诱导表达，表达后的蛋白进 行SDS-PAGE分析。

根据SDS-PAGE结果，将表达量较大的串联肽进行超声裂解菌体，进行 SDS-PAGE分析，并分析其表达形式。

4、皮试诊断抗原在致敏豚鼠皮内的DTH鉴定

根据SDS-PAGE结果，串联肽2CCM的表达量最大，且以可溶性形式表达。按 照实施例1第1.6节的方法，对表达纯化后的重组蛋白CCM、2CCM在致敏豚鼠皮 内作DTH检测，以PPD、rCFP-10、C-P_C、C-P_B7作为阳性对照，以无关蛋白BSA 和PBS作为阴性对照。

结果：

1、单拷贝及多拷贝皮试诊断抗原基因表达载体的构建

获得的重组质粒进行单酶切及双酶切鉴定，酶切结果均与预期相符。阳性克隆 经北京华大基因公司测序并分析后证实基因正确，备用。

2、单拷贝及多拷贝皮试诊断抗原的表达及纯化

SDS-PAGE结果表明，融合蛋白CCM(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)、2CCM (氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)、4CCM、6CCM在Rosetta菌中获得了表达， 有明显的目的条带，且大小与预期相符，但是8CCM、12CCM未见明显表达条带， 如图14所示。

3、单拷贝及多拷贝皮试诊断抗原在致敏豚鼠皮内的DTH鉴定

将纯化后的串联抗原肽CCM、2CCM，在致敏豚鼠皮内作DTH检测，结果表明： CCM、2CCM在致敏豚鼠皮内的DTH反应性较强，强于C-P_C、C-P_B7、M-P₁₁单独 的作用，其DTH皮试红斑直径均可达10mm左右，但CCM与2CCM组无显著差 异，如图15所示。