检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因芯片以及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因芯片和试剂盒。本发明基因芯片包括它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1或2所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，SEQ ID NO：3或4所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO：5或6所示任意一个或者两个寡核苷酸片段。本发明试剂盒包括前述基因芯片与扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因的试剂。本发明基因芯片和检测试剂盒可以准确、有效的检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状 病毒的基因芯片以及试剂盒。

背景技术

随着集中化养猪的规模日益扩大，猪的腹泻疾病变得日趋严重。而引起 仔猪腹泻疾病的病原研究证实有而且还在不断增加大肠杆菌、沙门氏菌、魏 氏梭菌、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、温和猪瘟、 猪痢疾、猪球虫等。而由猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状 病毒引起的仔猪病毒性腹泻疾病日趋增多，该三类疫病能引起仔猪的高发病 率和高死亡率，且有部分地区已经呈现出混合感染和继发感染的现象，对养 猪业造成了极大的损失。鉴于这三种病毒在生产中对仔猪危害极大，包括我 国在内的许多国家和地区为预防和控制这三种主要的腹泻类疫病，投入了大 量的人力、物力、财力，但却收效甚微。

由于该三类腹泻类疫病在临床症状及流行趋势上都极其相似，尚无有效 疫苗能将疫情控制，因此在临床诊断、治疗，以及防治上有极大的难度。临 川症状具体表现在：一般2周龄以内的仔猪感染后12-24小时会出现呕吐， 继而出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈黄色，常夹有未消化的凝乳块，恶 臭，体重迅速下降，仔猪明显脱水，发病2-7天死亡，死亡率达100％；在 2-3周龄的仔猪，死亡率在0-10％；断乳猪感染后2-4天发病，表现水泻，呈 喷射状，粪便呈灰色或褐色，个别猪呕吐，在5-8天后腹泻停止，极少死亡， 但体重下降，常表现发育不良，成为僵猪；一些耐过猪和呈隐形感染的猪群 往往也是带毒猪。

传统的检测这三种疾病的方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过 长。最近国外和国内均建立了RT-PCR/PCR检测方法，以及多重PCR检测方 法，在大规模批量检测中往往也有一定局限性。为此，有必要建立一种共检 芯片技术对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒进行鉴别诊断，以 实现对这3种病的快速且准确的检测，为尽快采取有效的针对性防治措施， 减少这些疾病对养猪业造成的损失做好铺垫。综上所述，用共检芯片检测技 术对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒进行别诊断方法是十分必 要的。

伴随分子生物学理论和技术的发展，芯片技术在检测方面具有高通量、 多样性、微型化和自动化的优势特点。在对各种病原体的分子检测中，往往 针对病原体的基因进行检测。而芯片技术能对各种病原体的RNA、DNA进 行定性和定量的分析，从而帮助诊断者明确疾病的种类及疾病的感染程度。 因此芯片技术在传染性疾病的诊断和病原体的筛查上发挥着越来越重要的作 用。

基因芯片，又称DNA微阵列，其原理是通过将cDNA或寡核苷酸探针 密集固定于固相表面，再与已经标记好的靶基因序列进行杂交反应。经过扫 描仪扫描显示图像和软件处理分析数据，从而获得检测样品中包含的特定分 子信息，结合图像和数据判定对应检测样品的是否含有、含有量的多少。传 统的检测技术耗时费力，且难以以多病原共同检测模式进行相关检测。利用 基因芯片技术将多种病原的特异性保守序列片段分别固定在芯片表面，与要 检测的样品经过处理后杂交，便可获得多种病原的检测信息。这种检测方法 对大规模批量检测开辟了一个新的局面，为动物疫病的综合防治提供了有效 且快速的诊治平台。

邓俊花等，“TGEV-PEDV-PRV基因芯片探针的构建”，中国畜牧兽医学会 畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文 集，2008年7月，公开了可能用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎 病毒和猪轮状病毒的探针，但是未公开具体的基因芯片以及检测试剂盒，也 未公开其是否可以特异、灵敏地检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病 毒和猪轮状病毒。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可同时检 测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因芯片和试剂 盒。

本发明检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基 因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ  ID NO：1或2所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，SEQ ID NO：3或4 所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO：5或6所示任意一 个或者两个寡核苷酸片段。

基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomic  DNA、多肽、抗体、抗原等)固着于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝 胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集 成化、平行化和高通量。

优选地，它还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO：19所示的基因片 段。

本发明检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试 剂盒，它包括前述的基因芯片与扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病 毒和猪轮状病毒的基因的试剂，其中，扩增猪流行性腹泻病毒基因的试剂包 括SEQ ID NO：7～8和/或SEQ ID NO：9～10所示引物对；扩增猪传染性胃 肠炎病毒基因的试剂包括SEQ ID NO：11～12和/或SEQ ID NO：13～14所示 引物对；扩增猪轮状病毒基因的试剂包括SEQ ID NO：15～16和/或SEQ ID  NO：17～18所示引物对。

优选地，所述引物对中，SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17所示上游 引物与SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18所示下游引物的摩尔比为1:40。

SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO： 13～14、SEQ ID NO：15～16和SEQ ID NO：17～18所示引物对以及SEQ ID NO： 1～6所示寡核苷酸片段。

SEQ ID NO：1或2所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，SEQ ID NO： 3或4所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO：5或6所示 任意一个或者两个寡核苷酸片段在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃 肠炎病毒和猪轮状病毒的基因芯片中的用途。优选地，它还包括定位探针， 定位探针是SEQ ID NO：19所示的基因片段。

SEQ ID NO：7～8和/或SEQ ID NO：9～10所示引物对、SEQ ID NO：11～12 和/或SEQ ID NO：13～14所示引物对以及SEQ ID NO：15～16和/或SEQ ID  NO：17～18所示引物对，与SEQ ID NO：1～2所示任意一个或者两个基因片 段、SEQ ID NO：3～4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQ ID NO：5～6 所示任意一个或者两个基因片段在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃 肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂；SEQ ID  NO：1～6为检测探针。

所述试剂盒还包括SEQ ID NO：20～21所示引物对以及SEQ ID NO：19 所示定位探针。

本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃 肠炎病毒和猪轮状病毒，敏感性高，三种病毒的最低检测浓度依次为 10³copies/μL、10⁴copies/μL、10⁴copies/μL，特异性强，耗时短，检测快速， 具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的 详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。 凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1  检测微阵列四个重复检测区的分布及矩阵排列情况。

图2  正向引物与反向引物按不同比例的不对称PCR扩增凝胶电泳图 (1-11分别代表1：1、1：10、1：20、1:40、1：50、1:80、1:160、1:200， 阴性对照)。

图3  正向引物和反向引物按1:1，1:10,1:20,1:40比例共检芯片杂交图。

图4  1-6h杂交时间下不同探针的共检芯片扫描数据。

图5  44-52℃杂交温度下不同探针的共检芯片扫描数据。

图6  特异性实验结果。

图7  灵敏度实验结果，A:稀释10⁵倍；B:稀释10⁶倍；C:稀释10⁷倍； D:稀释10⁸倍；E:P探针稀释10⁹倍。

图8  单张芯片重复使用结果。

具体实施方式

一、实验材料和仪器

材料准备

毒株：

猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，猪 轮状病毒(PoRV毒株)，购自中国兽药监察所。

试剂：

总RNA抽提试剂盒，为天根(北京)生化科技有限公司产品； PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)，为宝生物工程(大连)有 限公司产品；小量质粒提取试剂盒、小量胶回收试剂盒，均为OMEGA(美 国)生物技术公司产品。

氨基载玻片、2×点样缓冲液、预杂交缓冲液、杂交缓冲液,均购自上海百傲科技有限公司；Cy3-dCTP：25nmol，PA53021， Lot300989，Amersham Biosciences，UK；洗液Ⅰ：0.1％SDS 2×SSC；洗液Ⅱ： 0.1％SDS 0.2×SSC；洗液Ⅲ：0.2×SSC；洗液4：双蒸水。

仪器：

超净工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；

超纯水仪：Milli Qplus，法国产；

梯度PCR仪：P×2，Thermo hybaid，美国产；

高速冷冻离心机3K18型：德国产；

Mini-SUB凝胶电泳装置：意大利产；

电泳仪:POWER Pac300，意大利产；

凝胶电泳图像分析系统2000型：意大利产；

恒温摇床：Thermo Forma，美国产；

核酸蛋白检测仪：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010；

分子杂交仪：Thermo，美国产；

多样品围栏、多样品围栏粘贴工具、多样品围栏盖片，芯片杂交盒均为 北京博奥生物公司；

SmartArrayer^TM 48，微阵列芯片点样系统：Capitalbio Corporation， 北京博奥生物公司；

LuxScan^TM 10K微阵列芯片扫描仪：Capitalbio Corporation，北京 博奥生物公司；

真空机：SinBo，香港；

CO2恒温培养箱：Thermo，美国产。

实施例1 本发明基因芯片的制备

1、材料和仪器

同前述实验材料和仪器。

2、实验方法

2.1PCR引物、检测探针的制备

(1)设计病原特异性探针：通过对GenBnak中收录的猪流行性腹泻病 毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒的核酸序列对位排列分析，选定保守 区域序列：PEDV M、S；TGEV N、S；PoRV NSP4、VP7。针对保守序 列设计检测多对探针，从中挑选出特异性强的探针序列。

(2)设计探针序列的特异性引物：针对上述保守探针序列，利用生物信 息学软件DNAman、Primer5.0等设计特异性引物。特异性引物由上海生物工 程公司合成。

(3)探针制备：用总RNA抽提试剂盒提取猪流行性腹泻病毒、猪传染 性胃肠炎病毒、猪轮状病毒，利用上述特异性引物对三种病原核酸进行 RT-PCR扩增，纯化浓度测定。

反转录体系及条件(参照PrimeScript RT reagent Kit的方法)

PCR扩增体系及条件：

反应条件如下：

4、探针的筛选:将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点 在氨基化玻璃基片上制成共检芯片，通过杂交试验进行探针筛选，最终得到 用于制备本发明检测DNA微阵列所需的特异、灵敏的探针：PEDV M、S； TGEV N、S；PoRV NSP4、VP7。

5、探针基因组的建立：将胶回收纯化的PEDV M、S；TGEV N、S；PoRV  NSP4、VP7用pMD 19-T Vector进行连接，连接体系为pMD 19-T Vector 0.5ul， 胶回收探针5.0ul，连接液4.5ul，总量10.0ul。连接反应在16℃下进行16h； 将10.0ul探针连接产物加入氯化钙法制备的200ul感受态细胞DH5α中，轻 轻混匀后冰浴30min，42℃热休克90s后立即放入冰浴中冷却5min，加入800ul LB液体培养基，37℃轻微振荡培养3h。取200ul培养物涂布于含有X--Gal、 IPTG、含氨苄的LB琼脂平板培养基，37℃培养过夜，挑选白色菌落进行增 菌培养及质粒PCR鉴定并送宝生物公司测序。

6、探针基因组的保存：将测序正确的质粒进行扩增培养，并用20％脱 脂牛奶作为保护剂进行冻干，至于-80℃保存。

引物和探针的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO：1(PEDV-M)

源基因来源：PEDV分离株

基因大小及序列：421bp

CTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTATTTTGTCAAT AGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTG AAACTGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCAT TCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGT ACATTGTTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTC AATTGCCTGATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTA TGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCT TTCTATGTCCGGTCAAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGA GTGCGGTTCTCACAGATAGCGAGAAAGTGC

SEQ ID NO：2(PEDV-S)

源基因来源：PEDV分离株

基因大小及序列：474bp

CGCTAGGCTTGAGTCTGTTGAAGTTAACTCTATGCTTACTATTTCTG AAGAGGCTCTACAGTTAGCTACCATCAGTTCGTTTAATGGTGATGGATAT AACTTTACTAATGTGCTGGGTGTTTCCGTGTACGACCCTGCAAGTGGCA GGGTGGTACAAAAAGGGTCTTTTATTGAAGACCTGCTTTTTAATAAAGT GGTTACTAATGGCCTTGGTACTGTTGATGAAGACTATAAGCGCTGTTCTA ATGGTCGCTCTGTGGCAGATCTAGTCTGTGCGCAGTATTACTCTGGTGT CATGGTACTACCTGGCGTTGTTGACGCTGAGAAGCTTCAAATGTATAGT GCGTCTCTCATCGGTGGTATGGCGCTAGGAGGTCTTACTACTGCAGCGG CATTGCCTTTTAGCCATGCTGTTCAAGCGAGGCTCAATTATCTTGCTTTA CAGACGGATGTTCTACAGCGGAACCAGCAATT

SEQ ID NO：3(TGEV-N)

源基因来源：TGEV分离株，SC-H株

基因大小及序列：362bp

TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGC AGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGCCAAG GATGGTGCCATGAACAAACCAACCACGCTTGGTAGTCGTGGTGCTAATA ATGAATCCAAAGCTTTGAAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCGAATTTCA ACTTGAAGTTAATCAATCAAGAGACAATTCAAGGTCACGCTCTCAATCT AGATCTCGGTCTAGAAATAGATCTCAATCTAGAGGCAGGCAACAATTCA ATAACAAGAAGGATGACAGTGTAGAACAAGCTGTTCTTGCCGCACTTA AAAAGTTAGGTGTTGACACAGAA

SEQ ID NO：4(TGEV-S)

源基因来源：TGEV分离株,SC-H株

基因大小及序列：276bp

AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATGCACAAGTTGACAGGCTGATC ACAGGAAGACTTACAGCACTTAATGCATTTGTGTCTCAGACTCTAACCA GACAAGCGGAGGTTAGGGCTAGTAGACAACTTGCCAAAGACAAGGTT AATGAATGCGTTAGGTCTCAGTCTCAGAGATTCGGATTCTGTGGTAATG GTACACATTTGTTTTCACTCGCAAATGCAGCACCAAATGGCATGATTTT CTTTCACACAGTGCTATTACCAACGGCTTATGAAACT

SEQ ID NO：5(PoRV-NSP4)

克隆基因的源基因来源：PoRV,OSU株

基因大小及序列：270bp

GAACAGGTTACTACTAAGGATGAAATTGAACAACAGATGGACAGA ATTGTTAAGGAGATGAGGCGTCAACTGGAAATGATTGACAAATTGACA ACTCGTGAAATTGAACAAGTTGAATTACTTAAGCGTATACATGACAAAT TAGCTGCTAGACCAGTTGATGCTATAGATATGTCGAAGGAATTTAATCAG AAAAATATTCGAACGCTAGATGAATGGGAAAGTGGAAAAAATCCATATG AACCGTCGGAAGTAACTGCGTCTATGTGA

SEQ ID NO：6(PoRV-VP7)

源基因来源：PoRV，OSU株

基因大小及序列：381bp

TTGAATGAATGGCTATGTAATCCAaTGgATATAATGCTATATTATTATC AGCAAACAGATGAAGCTAATAAATGGATATCAATGGGTACATCATGTAC GATTAAAGTATGTCCTCTAAATACGCAGACTCTCGGGATAGGATGTTCG ACTACAGACATAAATTCATTTGAAACAGTGGCCAATGCAGAGAAATTAG CTATAACTGATGTTGTCGATGGAGTCAATCATAAATTAGACGTAACAAC GAGTACATGTACTATAAGAAATTGTAAAAAACTTGGACCAAGAGAAAA TGTCGCTGTAATTCAGGTAGGAGGTCCAAACATACTCGACATAACAGCT GATCCAACAACTGCACCACAAACTGAAAGAATGATGCGT

SEQ ID NO：7～8(PM-primer)

F 5`-CTTATGGCTTGCATCACT-3`

R 5`-GCACTTTCTCGCTATCTG-3`

SEQ ID NO：9～10(PS-primer)

F 5`-CGCTAGGCTTGAGTCTGTTG-3`

R 5`-AATTGCTGGTTCCGCTGTAG-3`

SEQ ID NO：11～12(TN-primer)

F 5'-TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTA-3'

R 5`–TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTT-3`

SEQ ID NO：13～14(TS-primer)

F 5`-AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATG-3`

R 5`-AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGC-3`

SEQ ID NO：15～16(NSP4-primer)

F 5`-GAACAGGTTACTACTAAGGATG-3`

R 5`-TCACATAGACGCAGTTACTTCC-3`

SEQ ID NO：17～18(VP7-primer)

F 5`-TTGAATGAATGGCTATGTAATCC-3`

R 5`-ACGCATCATTCTTTCAGTTTGT-3`

定位基因的序列(SEQ ID NO：19)

aaagcgaggc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt ggaatgaaca atggaagtca acaaaaagca gctggctgac attttcggtg cgagtatccg taccattcag aactggcagg aacagggaat gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa tgaggtgctt tatgactctg ccgccgtcat aaaatggtat gccgaaaggg atgctgaaat tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga agaactgcgg caggccagcg aggcagatct ccagccagga actattgagt acgaacgcca tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca ggaactgaag aatgccagag actccgctga agtggtggaa accgcattct gtactttcgt gctgtcgcgg atcgcaggtg aaattgccag tattctcgac gggctccccc tgtcggtgca gcggcgtttt ccggaactgg aaaaccgaca

SEQ ID NO：20～21(定位基因互补序列的扩增引物)

F：AAAGCGACGCAATGAGGCACT

R：GTTCCACGACCGCAACTGC

2.2标准质粒的构建

2.2.1基因组的抽提

总RNA抽提采用天根的总RNA提取试剂盒，参照说明，具体操作方法 如下：

1)直接取200μL病毒尿囊液于1.5mL离心管中，加入600μL裂解液， 充分振荡混匀；

2)将匀浆样品在15-30℃放置5min；

3)4℃，12000r/min离心5min，把上清液吸到新离心管中；

4)加200μL氯仿，剧烈上下振荡15sec，室温静置3min；

5)4℃，12000r/min离心10min，样品会产生分层，轻轻地将最上层无 色的水相转到新管中；

6)加0.5倍体积无水乙醇，混匀，转移到吸附柱内，4℃，12000r/min 离心30sec；

7)加500μL去蛋白液，4℃，12000r/min离心30sec；

8)加600μL漂洗液，静置2min，4℃，12000r/min离心30sec；重复 一次

9)4℃，12000r/min离心2min，弃掉残余液体；

10)将吸附柱转到RNase-Free离心管中，加50μL RNase-Free超纯水， 室温静置2min，4℃，12000r/min离心2min。离心液即得到的病毒RNA， 于-20℃下保存备用或直接进行反转录。

2.2.2探针基因的RT-PCR及PCR扩增

以抽提的RNA为模板，以Random 6primers为引物合成cDNA，反应体 系如下：

RT Enzyme Mix 0.5μL Random 6primers 0.5μL 5×PrimeScript RT Buffer 2.0μL RNA 2.0μL RNase-Free 超纯水 5.0μL Total 10.0μL

将上述体系混匀后按下面程序进行cDNA合成：反应程序为37℃， 15min；85℃，5sec；4℃，保存。

以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μL cDNA/DNA 2.0μL 上游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 下游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 超纯水 9.5μL Total 25.0μL

反应条件如下：

PCR完毕后，分别取7μL扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2.2.3探针基因的胶回收

探针基因的胶回收，采用OMEGA小量胶回收试剂盒，参照说明进行 回收操作，步骤如下：

1)取20μLPCR产物进行电泳，6V/cm，25min，紫外灯下切胶，称重。 按照试剂盒说明进行胶回收；

2)按1:1的比例加入Binding Buffer(XP2)，55℃-60℃水浴直到胶全部 融化，期间每隔2-3min上下颠倒离心管；

3)将液体加入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

4)加入300Binding Buffer(XP2)，室温12000r/min离心1min，倒掉 滤液；

5)加入700mL漂洗液SPW，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

6)室温12000r/min空离2min，倒掉滤液；

7)将吸附柱放于新离心管中，加入30mL洗脱缓冲液，室温静置1min；

8)室温12000r/min离心2min，取7μL回收产物进行电泳，验证回收 效果，其余回收产物于-20℃保存备用。

2.2.4探针基因的连接重组

采用pMD19-T Simple Vector克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具 体步骤按说明进行。连接体系如下：

pMD19-T Simple载体 0.5μL 胶回收PCR产物 5.0μL Solution I 4.5μL Total 10.0μL

4℃连接过夜，连接产物用于转化DH5α感受态细胞。

2.2.5感受态细胞的制备及保存

参考《分子克隆实验指南》氯化钙法^[56]制备DH5α感受态细胞，制备好 的感受态细胞分装为100μL/管，直接用于转化或于-70℃保存。

2.2.6连接产物的转化

将100μL感受细胞放在冰上，向其中加10μL连接产物，冰浴30min；42℃ 水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min；立即加入600μL 37℃预热的LB液体 培养基(无需冰上操作)，37℃，150r/min振荡培养1h，使受体菌恢复正常 生长状态；取150μL培养物均匀涂布于LB平板(含100mg/mL Amp)，晾干， 于37℃培养约12h，挑取菌落进行鉴定。

2.2.7探针质粒菌的鉴定及保存

2.2.7.1探针质粒菌的DNA抽提

将阳性质粒菌接种于5mL LB(含100mg/mL Amp)液体培养基中，37℃ 振荡培养12h；按Omega小量质粒提取试剂盒说明方法提取质粒。具体步骤 如下：

1)吸1mL菌液到离心管中，室温12000r/min离心1min，吸弃上清；

2)加入250μL Solution I(4℃储存)，振荡使菌体悬浮；

3)加入250μL Solution II，轻轻地颠倒混匀，静置2min；

4)加入350μL Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀物，室温 12000r/min，离心10min；

5)将上一步的液体转入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤 液；

6)向其加500μL Buffer HB，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

7)向其加700μL Buffer Wash Buffer，室温12000r/min离心1min，倒 掉滤液；重复一次；

8)室温12000r/min空离2min，将柱子装于一个干净的离心管中，向其 加30μL Elution Buffer，静置2min，12000r/min离心1min，收集的离心液 即为提取的质粒DNA。

2.3.7.2探针质粒菌的PCR鉴定

对提取的探针质粒菌分别进行PCR鉴定，同时以pMD19-T Simple空白 载体作阴性对照，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix 7.5μL 上游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 下游特异性引物(25.0μmol/L) 0.5μL 质粒(50倍稀释) 2.0μL 超纯水 4.5μL Total 15.0μL

反应程序同上。反应完毕，分别取5μL于2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳 分析。

2.2.8探针质粒菌的序列测定和分析

采用Sanger双脱氧末端终止法对经过PCR鉴定为阳性的探针质粒菌进 行序列测定，序列测定工作交由上海杰李生物技术有限公司完成。

得测序正确的质粒菌T/PEDV-M、T/PEDV-S、T/TGEV-N、T/TGEV-S、 T/PoRV-NSP4、T/PoRV-VP7，分别包含SEQ ID NO：1(PEDV-M)、SEQ ID  NO：2(PEDV-S)、SEQ ID NO：3(TGEV-N)、SEQ ID NO：4(TGEV-S)、 SEQ ID NO：5(I PoRV-NSP4)、SEQ ID NO：6(PoRV-VP7)所述基因片段。

2.2.9探针质粒菌的保存

把序列测定正确的探针质粒菌扩大培养，然后以20％脱脂奶粉作为保护 剂冻干，-70℃保存。

2.3芯片制备

(1)芯片矩阵的设计：如图1所示，每张芯片分为四个区，四个区为四 个重复阵列，用杂交围栏隔开，以便同时进行四个不同样品的杂交反应。每 个阵列参数为：每排探针基因和定位基因均为9个样点，各样点中心间距 650um，样点直径为220um。

(2)共检芯片的制备：

用点样缓冲将包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病 毒探针、定位基因定量至使用浓度即为600ng/ul。

按芯片设计要求在96(384)孔载样板孔内加入定量的猪流行性腹泻病 毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒\探针、定位基因、空白阴性质控基因， 封住孔板，用基因芯片点样系统(Microarray Printing System，SpotArrayTM 16) 在氨基化基片上进行接触式点样。点样环境相对湿度为70％。

点制好的芯片置于80℃的原位PCR仪上烘干8h，然后用60-80℃水合处 理4s，，紫外交联30s后，以0.2％SDS洗液静置洗涤5min，快速离心干燥， 真空密封、4℃保存备用。

实施例2 本发明检测方法

1、核酸抽提病毒RNA的抽提：使用天根(北京)生化科技有限公司 RNA提取试剂盒。按该试剂盒说明抽提RNA：

取处理好的病料液300ul置于离心管中，加入500ul RV液后剧烈振荡 2min后室温静置5min；

加入750ul异丙醇，轻轻摇匀；

移取800ul至吸附柱中，4℃下12000r离心30s；

弃收集管中液体，将剩余的裂解物移入吸附柱中，4℃下12000r离心30s；

弃收集液后加入500ul RP液，4℃下12000r离心30s去除蛋白质；

加入500ul W3液，静置lmin后，4℃下12000r离心15s；

重复步骤上一步骤；

将吸附柱转移到另一干净的离心管中，在吸附膜中央加入30ul超纯水， 室温静置2min；

12000×g离心2min，离心液为提取的RNA，-70℃保存备用。

病毒RNA的反转录：宝生物工程(大连)有限公司提供的反转录试剂 盒。反转录体系10.0ul体系：

反转录反应程序为:

42℃，反转录30min；85℃，灭活30s；4℃保持。

2、cDNA的不对称PCR标记扩增，其中正向引物和反向引物的比例为1： 1,1:10,1:20,1:40，1:50，1:80,1:100，1:160,1:200。结合凝胶电泳图和芯片杂交 分析。

加入正向引物及以后操作均在暗室中进行。按如下程序进行扩增反应程 序为反应条件，反应程序如下：

实验结果如图2～3以及表1所示：

表1 正向引物和反向引物按1:1，1:10,1:20,1:40比例共检芯片扫描结果

结果表明，正向引物与反向引物在1:40比例下，杂交效率最优。本发明 试剂盒中正向引物与反向引物的摩尔比优选为1:40。

3、检测

芯片的预杂交：取制备保存的DNA微阵列，95-100℃双蒸水中变性 1-2min.其间上下抽提以免在玻片表面形成气泡，立即置预冷的95％乙醇中 快速冷却后离心干燥，将微阵列置于杂交舱中，于微阵列检测区加入预杂交 液25ul，将盖玻片轻放其上，以免形成气泡，使预杂交液均匀覆盖微阵列检 测区，将芯片置于密封的湿盒内于42℃下预杂交1h。

芯片的杂交：吸除预杂交液，利用不对称PCR标记扩增的核酸样品于 95℃变性3min后，立即置冰中冷却5min，再与一定量预冷的杂交缓冲液混 匀，取该混合液50ul加到微阵列检测区，以盖玻片轻放其上，将微阵列放 入杂交舱内于一湿盒内避光杂交，于40、44、48、52℃杂交温度下杂交1、2、 3、4、5、6h时间。如图4～5所示，在48℃杂交温度下杂交3h杂交时间条 件最优。

共检芯片的洗涤干操：杂交完毕后，轻轻移去芯片的盖玻片，将芯片放 置在玻片架上，立即用温热的洗液1、洗液2、洗液3、洗液4、洗液5分析 洗涤5min，.离心干燥后扫描分析。洗涤过程在暗示中完成。

扫描分析离心干燥的共检芯片用基因芯片扫描仪4000扫描 检测。扫描参数为Laserpower 95％，PMT550，分辨率10um，扫描结果以16 位TIFF和BMP格式保存图像。

数据输出与处理：根据结果判定样品的阴阳性。

实施例3 特异性试验

一、试验方法

采用实施例1制备的基因芯片，按照实施例2的方法(正向引物与反向 引物的摩尔比例为1:40，杂交温度为48℃，杂交时间为3h)，检测PoRV、 TGEV、PEDV、PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、CSFV(猪瘟病毒)、 JEV(猪乙型脑炎病毒)、PRV(猪伪狂犬病毒)7种病毒，以验证本发明基 因芯片和试剂盒的特异性。

二、结果

实验结果如图6所示，采用本发明方法检测，PoRV、TGEV和PEDV 的检测结果呈阳性，PRRSV、CSFV、JEV、PRV的检测结果均呈阴性。

本发明方法只会检出本发明3种病毒，不会检出其他病毒，说明本发明 试剂盒和基因芯片的特异性强。

实施例4 灵敏度试验

一、试验方法

取实施例1制备的质粒T/PEDV-M、T/PEDV-S、T/TGEV-N、T/TGEV-S、 T/PoRV-NSP4、T/PoRV-VP7，核酸蛋白仪测定各质粒的OD₂₆₀，换算成DNA 的拷贝数，浓度分别为T/PEDV-M(1.29×10¹¹copies/μL)、T/PEDV-S(1.15 ×10¹¹copies/μL)、T/TGEV-N(1.26×0¹¹copies/μL)、T/TGEV-S(1.22× 10¹¹copies/μL)、T/PoRV-NSP4(1.39×10¹¹copies/μL)，T/PoRV-VP7(1.46× 10¹¹copies/μL)，分别作10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹倍比稀 释后，采用实施例1制备的基因芯片，按照实施例2的方法检测(正向引物 与反向引物的摩尔比例为1:40，杂交温度为48℃，杂交时间为3h)。

二、结果

结果如图7和表2所示：

表2 不同质粒浓度稀释倍数的荧光扫描信号结果

结果表明，T/PEDV-M质粒检测的最低浓度为1.29x10³copies/μL， T/PEDV-S质粒最低检测浓度为1.15×10³copies/μL，即PEDV的最低检测浓 度为10³copies/μL；T/TGEV-N质粒最低检测浓度为1.26×10⁴copies/μL、 TGEV-S质粒最低检测浓度1.22×10⁴copies/μL，即TGEV的最低检测浓度为 10⁴copies/μL；T/PoRV-NSP4质粒最低检测浓度1.39×10⁴copies/μL， T/PoRV-VP7质粒最低检测浓度1.46×10⁴copies/Μl，即PoRV的最低检测浓度 为10⁴copies/μL。

实验结果说明，采用本发明试剂盒和基因芯片检测，PEDV、TGEV、 PoRV的最低检测浓度依次为10³copies/μL、10⁴copies/μL、10⁴copies/μL，灵 敏度高。

实施例5 重复性试验

1、实验方法

同批次芯片的重复性：选取PEDV-M(简称PM)和PEDV-S(简称PS) 靶基因用不对称PCR直接标记产物，取同批次芯片5张分别与其杂交。评价 该检测微阵列的稳定性。

单张芯片的重复性：取一张制备好的芯片进行杂交，扫描分析后，立即 将该芯片再次进行下一次杂交，继续扫描分析，如此重复N次。评价该检测 微阵列的最高重复使用次数。

2、实验结果

同批次芯片的重复性结果如下表所示：

表3 批间重复使用结果

PM探针杂交信号中位值为8801.80±492.58，变异系数为5.58％，SNR 值为22.12±1.21，变异系数为5.47％。PS探针杂交信号中位值为 8949.60±584.13，变异系数为6.52％％，SNR值为22.09±1.57，变异系数为 7.10％。结果表明该基因芯片检测稳定性高。

单张芯片的重复性的结果如图8所示：结果表明该基因芯片最多可重复 利用7次，稳定性好。

实施例6 采用本发明基因芯片检测病料

一、检测方法

1、病料的采取与预处理：

1)病料的采取：收集了来自四川省绵阳、阿坝茂县、彭州、资阳安岳、 眉山、广安、攀枝花、巴中通江56份有腹泻症状的仔猪小肠及内容物。

2)病料的预处理：

器脏组织的处理：将采集的病料用灭菌PBS研磨，37℃下作用30分钟， 反复冻融3次并用超声波处理，离心，上清液-20℃保存。

2、采用实施例2的方法检测(正向引物与反向引物的摩尔比例为1:40， 杂交温度为48℃，杂交时间为3h)

二、检测结果

检测结果如下表所示：

表4 56份小肠样品的检测结果

感染类型 共检芯片(Y) 检测感染率 PEDV 38/56 68％ TGEV 4/56 7％ PEDV+PoRV 2/56 3％ 合计 44/56 78％

采用试剂盒和基因芯片，检测到56份样品中，有38份样品中含有猪流 行性腹泻病毒，4份样品含有猪传染性胃肠炎病毒，2份样品同时含有猪流行 性腹泻病毒和猪轮状病毒，其余样品未检出。

实验结果说明，本发明试剂盒和基因芯片可以有效检测猪流行性腹泻病 毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒。

综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测猪流行性腹泻病毒、猪传 染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速， 具有良好的应用前景。