褐飞虱生长发育相关的NlAKTIP基因、编码蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种褐飞虱生长发育相关的 Nl AKTIP 基因、编码蛋白及其应用。调控褐飞虱生长发育的AKT互作蛋白编码基因 NlAKTIP ，含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列及其同源突变序列，该基因在维持褐飞虱正常的生长发育过程中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱生长变缓，体型变小，成虫羽化时间推迟。所述的褐飞虱 NlAKTIP 基因编码的蛋白，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列及其同源突变序列，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱生长变缓，体型变小，成虫和羽化时间推迟。所述的褐飞虱 NlAKTIP 基因的RNA干扰在控制褐飞虱方面的应用。本发明对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的生长发育受到明显抑制，体型减小，体重减轻，成虫羽化时间延迟。

说明书

技术领域

本发明涉及一种褐飞虱生长发育相关的基因、编码蛋白及其应用。

背景技术

褐飞虱(Nilaparvata)是一种远距离迁飞性水稻害虫，主要以刺吸韧皮部 汁液和传播水稻病毒的方式为害水稻植株。近年来，褐飞虱已发展成为亚洲稻区的重要害虫， 常年危害面积在2,000万hm2以上，造成稻谷产量损失数十亿公斤(林拥军等，2011)。目 前，针对褐飞虱的主要应急防治措施为喷施化学农药。化学农药的大量滥用，不仅严重污染 环境，而且长期施用化学农药可诱使褐飞虱产生抗药性(王鹏等，2013)。在防治褐飞虱的农 药中，曾经发挥过较好效果的有效农药，如氟虫腈、吡虫啉、噻嗪酮等，均已淘汰出局或限 制使用，而近年出现的取代农药品种数量不多，很多地方在开展防治时，在农药的选择上感 到策手无策，化学防治面临防不胜防的尴尬局面。究其原因，此类化学农药多以大规模高强 度杀灭害虫为目标，但是，由于褐飞虱种群遗传多样性非常复杂等现实原因，其中往往有部 分个体能够存活下来，高选择压的作用结果，最终会导致适应性更强的种群形成。另一方面， 化学农药在杀死害虫的同时，也会危及包括天敌在内的非靶标生物，不可避免的会给农田生 态系统造成负面影响，生态防治功能没有等到应有的发挥。因此，调整目前的褐飞虱防治策 略势在必行。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种在褐飞虱生长发育中发挥重要作用的基因 NlAKTIP、编码蛋白及其应用。对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的生长发育受到 明显抑制，体型减小，体重减轻，成虫羽化时间延迟。

本发明首先在研究思路上进行创新，即改变了现有化学防治以“杀灭”为目标的褐飞虱 防治策略，可以避免高选择压力下，强抗药性种群的形成。本发明注重从整体上弱化害虫种 群的致害能力，而不以杀灭为目标。一方面，通过抑制害虫的生长发育，控制褐飞虱体型， 减少害虫取食的直接为害；另一方面，根据褐飞虱的迁飞特性，在防控区适宜爆发的时间窗 口有限等特点，通过延迟成虫的羽化时间，减少害虫的世代更替速度，控制种群基数，降低 在适宜气候条件下虫害爆发的风险。

本发明的技术方案如下：

一种调控褐飞虱生长发育的AKT互作蛋白编码基因NlAKTIP，含有SEQ ID NO:1所示 的核苷酸序列及其同源突变序列，该基因在维持褐飞虱正常的生长发育过程中发挥重要功能， 其功能受到抑制会导致褐飞虱生长变缓，体型变小，成虫羽化时间推迟。

所述的褐飞虱NlAKTIP基因编码的蛋白，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列及其同源 突变序列，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱生长变缓，体型变小，成虫和羽化时间推迟。

一种所述的褐飞虱NlAKTIP基因的RNA干扰在控制褐飞虱方面的应用。

所述NlAKTIP基因的RNA干扰抑制褐飞虱的生长，导致褐飞虱体型变小，体重减轻， 减轻褐飞虱的取食量和危害程度。

所述NlAKTIP基因的RNA干扰迟滞褐飞虱的羽化，延长世代周期，抑制种群增长速度， 减轻褐飞虱危害程度。

所述的应用，基于该核酸和蛋白序列用于农药研发和生物防治。

本发明的有益效果：(1)褐飞虱生长受到抑制，体型减小，可以减轻害虫取食对水稻作 物的直接危害。(2)褐飞虱为r-对策者，采取最大生殖策略，因此，世代更替速度对种群的 放大具有非常重要的作用。本发明可以迟滞褐飞虱的羽化时间达到8天以上，减缓了褐飞虱 世代更替的速度，降低了在有限时间窗口虫灾爆发的风险。(3)本发明虽然抑制了褐飞虱的 生长发育，但对害虫的存活率没有造成显著影响，可以避免喷施农药实践中高选择压导致强 抗药性种群的后果。(4)本发明避免对天敌等非靶标生物的伤害，有望在实现抑制害虫的同 时，充分发挥生态防治的功能。

附图说明

图1是褐飞虱AKTIP 5’RACE电泳图。

图中，产物-627bp，M表示DNA分子量标准。

图2是褐飞虱AKTIP 3’RACE电泳图；

图中，产物-499bp，M表示DNA分子量标准。

图3是褐飞虱AKTIP全长cDNA电泳图；

图中，cDNA964bp，M表示DNA分子量标准。

图4是AKTIP在不同褐飞虱种群怀卵雌虫中的表达规律分析。

图5是AKTIP基因干扰片段dsRNA的电泳图；

图中，M表示DNA分子量标准；合成的dsAKTIP 390bp；合成的dsGFP 350bp。

图6是褐飞虱取食营养液，dsGFP，dsAKTIP后mRNA表达量变化；

图中，数值为平均值±标准误；“*”和“**”分别表示统计分析表明饲喂营养液与饲喂dsAKTIP 存在显著(T检验，P<0.05)和极显著差异(T检验，P<0.01)。

图7是褐飞虱取食营养液，dsGFP，dsAKTIP对存活率的影响；

图中数值为平均值±标准误；“*”和“**”分别表示统计分析表明饲喂营养液与饲喂dsAKTIP 存在显著(T检验，P<0.05)和极显著差异(T检验，P<0.01)。

图8是褐飞虱取食营养液，dsGFP，dsAKTIP对羽化速率的影响；

图中，数值为平均值±标准误；“*”和“**”分别表示统计分析表明饲喂营养液与饲喂dsAKTIP 存在显著(T检验，P<0.05)和极显著差异(T检验，P<0.01)。

图9是取食营养液，dsGFP，dsAKTIP褐飞虱的体重大小；

图中，数值为平均值±标准误；“*”和“**”分别表示统计分析表明饲喂营养液与饲喂dsAKTIP 存在显著(T检验，P<0.05)和极显著差异(T检验，P<0.01)。

图10是不同类型营养液喂养的褐飞虱体型比较；

图中，上：背面，下：腹面；从左往右分别是：营养液，dsGFP，dsAKTIP0.02，dsAKTIP0.1， dsAKTIP0.5。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1

1.材料与方法

1.1实验材料

供试虫源为本实验室长期饲养于水稻品种TN1上的褐飞虱种群，室内饲养温度为 26±2℃，相对湿度80％±5％，光周期16L:8D。

1.2主要试剂

RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；RACE试剂盒(BD SMART RACE  Amplification Kit)购自Clontech公司；凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)购自Axygen公 司；反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser)、荧光定量PCR试剂SYBR  Premix EX Taq、PCR相关试剂、pMD-18T vector、DL2000DNA Marker购自TaKaRa公司； 体外转录试剂盒(MEGAscript T7High Yield Transcription Kit)购自Ambion公司；Ampicillin， DEPC购自BBI公司。

1.3主要仪器

荧光定量PCR仪(ABI step one plus)；PCR仪(Bio-Rad My Cycler)；核酸电泳仪 (Bio-Rad)；微量移液器(eppendorf、Rainin)；蛋白核酸定量分析仪Nanodrop2000(Thermo)； 凝胶成像分析系统(GeneGenius)；超低温冰箱；冷冻离心机(eppendorf)；电子天平；高 压灭菌锅；超净工作台。

1.4引物

根据转录组测序提供的AKT互作蛋白基因NlAKTIP核心序列及后续测序信息，应用 Primer Premier 5.0和Oligo7.55软件设计引物(表1)。引物送铂尚生物技术(上海)有限公 司合成。

表1克隆、荧光定量PCR及合成dsRNA所涉及到的引物

1.5褐飞虱AKT互作蛋白基因NlAKTIP的克隆

1.5.1褐飞虱总RNA的提取

(1)吸虫器吸取20～40头龄期不同的褐飞虱(重量约为150mg)，迅速放入液氮中速冻，并 转移至置于遇冷的玻璃匀浆器中，加1mL Trizol试剂，冰上充分匀浆；

(2)将匀浆液转移至DEPC水处理过的离心管中，冰上静置5min。4℃，冷冻离心12,000×g， 离心10min；

(3)取上清移至新离心管中，冰上放置5min；悬空加入200μL的氯仿，轻柔上下颠倒混匀 20次，冰上放置15min；

(4)冷冻离心机4℃12,000×g下离心15min；

(5)轻轻吸取400μL上清液至新的离心管，加入400μL的异丙醇并上下颠倒混匀20次， 冰上放置15min，4℃，12,000×g冷冻离心15min；

(6)弃上清，加入1mL遇冷的DEPC水配置的75％无水乙醇，移液枪抽打漂洗；

(7)冰上放置5min后，4℃，7500×g，离心5min；

(8)弃上清，用移液枪将残留的液体吸干，并倒扣在吸水纸上干燥5min，加入的RNase-free  H₂O溶解沉淀；

(9)使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000(Thermo)进行RNA纯度及完整性检测；

(10)将提取的褐飞虱总RNA置于-80℃冰箱中保存备用。

1.5.2褐飞虱NlAKTIP核心片段的克隆

1.5.2.1褐飞虱cDNA的合成

采用反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser)及附带引物Oligo(dT) 合成褐飞虱总RNA的cDNA。具体操作步骤如下：

(1)将以下试剂混匀加入RNase-free的离心管，去除RNA中的基因组DNA：

(2)42℃反应2min后，放置冰上。

(3)在步骤(1)的反应液中加入一下试剂

(4)漩涡震荡混匀，快速离心后37℃反应15min，85℃，5s，冰上放置。

(5)将反转录所得cDNA模板贮存于-20℃备用。

1.5.2.2PCR扩增

利用上述反转录的cDNA作为模板进行PCR扩增，扩增体系如下：

反应程序为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s，退火温度55℃,30s，延伸72℃， 1min，35个循环；延伸72℃，10min。取10μL PCR产物，加2μL 6×loading buffer混合上 样，由1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5.2.3产物割胶回收

将电泳特异性条带目的条带割下，根据凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)说明，进行 目的条带产物回收。

1.5.2.4产物连接

将割胶回收产物与pMD-18T质粒载体连接，pMD-18T，1μL，割胶回收产物，4μL，再 加入5μL Solution I均匀混合至10μL体系。16℃过夜连接。

1.5.2.5质粒转化

取出冰冻的JM109感受态细胞，冰上融化；将过夜连接的产物用移液枪轻轻沿管壁加入 感受态细胞中，用指尖轻轻弹匀，放置冰上30min；热激42℃，2min后，冰上放置3-5min； 在超净工作台中加入800μL液体LB培养基，37℃，180～200rpm，活化1～1.5h；将培养液 低速离心后，去掉400μL液体，并将剩余培养液混匀后取100μL培养液均匀涂布在固体LB 平板(含100μg/mL氨苄青霉素)；正放30min待培养液吸收后，倒置放37℃恒温培养箱 培养过夜。

1.5.2.6阳性克隆菌株的筛选

用白色小枪头从37℃过夜培养的LB平板中挑选5～8个单菌落个体，并放入含800μL 的LB培养液的1.5mL离心管中，37℃，180～200rpm，恒温培养8～10h。从LB培养液中取 2μL作模板进行菌液PCR检测。PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出3个 目的片段的单菌落，送上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.5.3褐飞虱NlAKTIP RACE克隆

通过上述方法得到的褐飞虱NlAKTIP的核心序列并依据试剂盒的要求设计特异性的引 物，采用BD SMART RACE Amplification Kit试剂盒进行cDNA末端的快速扩增(RACE) 克隆褐飞虱的AKT互作蛋白基因NlAKTIP的全长cDNA。

1.5.3.15’RACE和3’RACE cDNA第一链的合成

(1)在0.5mL PCR离心管中加入下列试剂：

(2)加入RNase Free ddH2O至终体积为5μL；

(3)漩涡震荡仪上混合后于离心机上短暂离心，并置于70℃下孵育2min后迅速放冰上冷 却2～3min；

(4)在以上两个反应体系中分别加入5×First-Strand Buffer，2μL；DTT(20mM)，1μL；dNTP  Mix(10mM)，1μL；BD PwerScript Reverse Transcriptase，1μL至总体积10μL；

(5)轻轻弹动离心管，并短暂离心使试剂聚集管底，42℃孵育1.5h；

(6)加入100μL Tricine-EDTA缓冲液来稀释反应产物，置于72℃孵育7min；

(7)将所得产物放置于–80℃保存备用。

1.5.3.25’RACE的合成

NlAKTIP 5’RACE采用两轮降落巢式PCR进行克隆。采用5O-NlAKTIP与通用引物10× Universal Primer A Mix(UPM)，以5’RACE cDNA为模板进行外围PCR。采用5I-NlAKTIP 与通用引物Nested Universal Primer A(NUP)，以外围PCR产物为模板进行内围PCR。

外围PCR反应体系如下：

反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，退火温度63℃每个循环降落0.5℃， 72℃延伸2min，10个循环；94℃变性30s，退火温度58℃，30s，72℃延伸2min，24 个循环；延伸72℃，10min。取10μL PCR产物，加2μL 6×loading buffer混合上样，由1％ 琼脂糖凝胶电泳进行检测。

内围PCR反应体系如下：

反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，退火温度63℃每个循环降落0.5℃， 72℃延伸2min，10个循环；94℃变性30s，退火温度58℃，30s，72℃延伸2min，24 个循环；延伸72℃，10min。取50μL PCR产物，加10μL 6×loading buffer混合上样，由1％ 琼脂糖凝胶电泳检测后割胶回收连接转化并送公司测序。

1.5.3.33’RACE的合成

NlAKTIP 3’RACE采用两轮降落巢式PCR进行克隆。采用3O-NlAKTIP与通用引物UPM， 以3’RACE cDNA为模板进行外围PCR。采用3I-NlAKTIP与通用引物NUP，以外围PCR产 物为模板进行内围PCR。

外围PCR反应体系如下：

反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，退火温度63℃每个循环降落0.5℃， 72℃延伸2min，10个循环；94℃变性30s，退火温度58℃，30s，72℃延伸2min，24 个循环；延伸72℃，10min。取10μL PCR产物，加2μL 6×loading buffer混合上样，由1％ 琼脂糖凝胶电泳进行检测。

内围PCR反应体系如下：

反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，退火温度63℃每个循环降落0.5℃， 72℃延伸2min，10个循环；94℃变性30s，退火温度58℃，30s，72℃延伸2min，24 个循环；延伸72℃，10min。取50μL PCR产物，加10μL 6×loading buffer混合上样，由1％ 琼脂糖凝胶电泳检测后割胶回收连接转化并送公司测序。

1.5.4褐飞虱cDNA全长序列的确定及分析

将NlAKTIP的核心片断，3’RACE和5’RACE测序片段通过DNAMAN软件拼接起来。 拼接比对后获得完整序列的全长cDNA序列。根据拼接所得cDNA序列分别从该序列的5’端 和3’端重新设计特异性引物NlAKTIP-FL-F和NlAKTIP-FL-R，操作步骤见2.2.2。

根据验证过的NlAKTIP全长cDNA序列信息，利用开放阅读框分析软件(ORF finder http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmL)预测开放阅读框及蛋白质翻译情况，使用NCBI Blastx 进行氨基酸序列同源性比对，使用在线工具ExPASy(http://web.expasy.org/protparam)对蛋 白质的分子量、理论等电点等进行预测，采用SignalP 3.0(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)进行信号肽的预测，采用在线工具InterProScan(http:// www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)对蛋白质功能域进行预测。将同源性较高的物种氨基酸序列 下载并利用MEGA5.05软件的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。

1.6褐飞虱NlAKTIP基因不同发育时期转录水平

1.6.1褐飞虱材料的采集

将40头怀卵的褐飞虱置于健康强壮的水稻产卵，产卵一天后取出雌虫，10天后褐飞虱 孵化，取1龄褐飞虱50头，孵化3天后取2龄若虫40头，孵化6天后取3龄若虫20头，孵 化8天取4龄若虫20头，孵化11天取5龄若虫15头，羽化1天褐飞虱取10头，羽化3-7 天褐飞虱每天取2头。所取样品均于液氮中速冻，并置于-80℃保存备用。

1.6.2褐飞虱RNA的提取及cDNA的合成

褐飞虱不同发育时期的总RNA提取步骤和方法参见2.2.1。反转录cDNA获取步骤和方 法参见2.2.2.1，反转录cDNA后进行4倍稀释，作为荧光定量的模板。

1.6.3荧光定量PCR特异性引物的设计

根据NlAKTIP全长cDNA序列信息设计荧光定量特异性引物QNlAKTIP-F和 QNlAKTIP-R(表2.1)；以β-actin基因作为内参基因^[90]，特异性引物Actin-F和Actin-R(表 2.1)，用于褐飞虱NlAKTIP表达规律的检测。

1.6.4褐飞虱AKT互作蛋白基因NlAKTIP的表达分析

采用Real-time PCR确定褐飞虱不同发育时期的表达量变化，探明该基因在褐飞虱发育过 程中发挥作用的关键时期，为后续目标基因的干扰提供明确的时间信息。

(1)NlAKTIP和β-actin特异性引物扩增效率的摸索

以褐飞虱cDNA为模板，4倍梯度进行稀释，设置5个稀释梯度。以6个稀释梯度cDNA 作为模板，分别以特异性目的引物QNlAKTIP-F和QNlAKTIP-R及特异性内参引物Actin-F 和Actin-R进行Real-time PCR。荧光定量PCR采用10μL体系：SYBR(TaKaRa Code: DRR420A)5μL，引物(10μmol/L)各0.2μL，ROX Reference(50×)0.2μL，cDNA模板 1μL，加ddH2O补齐至10μL。PCR采用两步法进行：95℃预变性30s；95℃，5s，57℃， 45s，40次循环。

(2)NlAKTIP mRNA在不同发育时期的mRNA水平的检测

验证引物扩增效率在95％～110％，扩增温度适宜后，分别以不同发育时期的褐飞虱4倍 稀释后的cDNA为模板，扩增体系和扩增条件同(1)。

数据导出Excel 2010进行分析，采用2^-ΔΔCt法分析数据，以褐飞虱1龄若虫作为参照，将 表达量定义为1，研究目标基因在褐飞虱不同发育时期的表达情况。数据处理后为平均值±标 准误(n＝3)。

1.7RNAi技术研究褐飞虱NlAKTIP基因的功能

1.7.1褐飞虱材料的采集及人工饲料的配置

1.7.1.1褐飞虱人工饲料的配方及装置

褐飞虱人工饲料的配方采用FU等(2001)的配方，将dsRNA加入配成不同浓度的人工饲 料供褐飞虱取食。

褐飞虱人工饲料的装置也采用Fu(2001)的设计，将玻璃管两端用双层Parafilm膜封住， 在两层膜中间加入20μL人工饲料，将玻璃管体用毛巾盖住，两端有光方便褐飞虱向两端取 食；在玻璃管两端分别放两盆清水，以确保湿度。

1.7.1.2褐飞虱材料的采集

将50头怀卵的褐飞虱雌虫置于健康强壮的水稻产卵，产卵一天后取出亲本，将孵化出的 褐飞虱放置于双通管中用人工饲料饲养。

1.7.2褐飞虱NlAKTIP dsRNA的合成

根据已获得的NlAKTIP全长cDNA序列信息设计靶向NlAKTIP的双链RNA干扰片段 (dsNlAKTIP)，同时根据绿色荧光蛋白GFP(登录号：AF234298)序列信息设计用于对照 的dsGFP。为了提高转录的效率，设计引物参照Milligan等(1987)并在特异性引物5'端加 保护碱基(GGATCC)及T7启动子(TAATACGACTCACTATA)，用于干扰的片段dsNlAKTIP 位于NlAKTIP的50bp-424bp，dsGFP位于GFP的281bp-630bp，不包含荧光定量PCR检 测的片段，以免影响RNAi后转录水平的检测。利用普通PCR扩增后进行割胶回收并送菌液 测序，提取已加保护碱基和T7启动子的质粒作为PCR模板，再次进行PCR并割胶回收，将 割胶回收的产物作为转录的模板。

体外转录体系为：ATP、GTP、UTP、CTP各2μL，Eneyme 2μL，模板(DNA)5μL， 10×Reaction buffer 2μL，加RNAase free water补齐至10μL，反应为37℃16h。最后在反应 体系加1μL TURBO DNase，37℃15min去多余的DNA模板。合成的dsRNA使用琼脂糖凝 胶电泳和Nanodrop 2000(Thermo)进行质量及浓度检测，并保存于-80℃备用。

1.7.3饲喂法进行RNAi

每个双通玻璃管放入20头发育一致的5龄褐飞虱，两端用双层Parafilm膜封住，在两层 膜中间加入20μL含不同终浓度dsRNA的营养液(D-97)，dsRNA终浓度设置3个梯度， 分别为0.02μg/μL，0.1μg/μL，0.5μg/μL。每天更换营养液，观察表型变化、发育畸形，并 统计褐飞虱存活率等。同时，于饲喂dsRNA后的3、5、7、9d，分别随机取3头发育一致的 褐飞虱进行RNA的提取，反转录为cDNA并5倍稀释，-20℃保存，用于后续荧光定量PCR 检测目标基因的干扰效果。荧光定量PCR的体系如上，AKTIP和内参基因β-actin的反应条 件均为：95℃预变性30s；95℃，5s，58℃，34s，40次循环。

1.7.4RNAi后表型变化，死亡率及后代个体统计

以纯营养液为空白对照(CK)，以添加终浓度0.5μg/μL dsGFP的营养液作为非靶标对 照组(dsGFP)，以添加浓度0.02μg/μL dsAKTIP，0.1μg/μL dsAKTIP，0.5μg/μL dsAKTIP 的营养液作为试验组，分别对褐飞虱进行人工饲喂，同样每个浓度设置3个重复，统计其雌 性羽化率，雌性死亡率。喂食9天后，即对照1营养液羽化7天，对雌成虫进行称重记录。

饲喂9天后分别取饲喂营养液，0.5μg/μL的dsGFP，0.02μg/μL的dsAKTIP，0.1μg/μL的 dsAKTIP，0.5μg/μL的dsAKTIP上的雌性褐飞虱，即对照营养液羽化7天的褐飞虱雌成虫； 将褐飞虱装入EP管在置于冰上30S，使其冻晕，再置于载玻片上，用体视显微镜(Sony， SMZ1500)进行拍照。

将营养液，0.5μg/μL的dsGFP，0.02μg/μL的dsAKTIP，0.1μg/μL的dsAKTIP，0.5μg/μL 的dsAKTIP营养液饲喂9天的的褐飞虱一头雌虫一头雄虫进行配对，然后放置于玻璃大试管 (3cm×25cm)的TN1水稻上，试管底部(水稻根)加3cm高的水，口用纱布封住防止褐飞 虱逃逸。褐飞虱在水稻上产卵5天后，将褐飞虱移至另外一株用玻璃大试管装的TN1水稻上 在产卵5天，并将对应的编号标记好以备统计后代的个体数量。

2.结果与分析

2.1褐飞虱AKTIP基因的克隆与分析

2.1.1AKTIP RACE PCR扩增及全长cDNA的PCR验证

根据表达谱核心序列测序结果设计RACE引物(表1)进行cDNA全长的克隆，5'RACE 获得627bp的特异性序列(图1)，3'RACE获得499bp的特异性序列(图2)，序列经过 DNAMAN拼接得到的AKTIP基因序列全长为964bp。并设计全长验证引物AKTIPqc-F， AKTIPqc-R，验证全长序列(图3)。

2.1.2AKTIP cDNA全长序列的分子特征

经ORF finder分析表明，cDNA全长序列(如SEQ ID NO:1所示)含有一个完整588bp 的ORF，编码195个氨基酸，5'-UTR共196bp，3'-UTR共180bp，具有典型的polyA结构， 预测分子量为22.19KDa，理论等电点为7.69。

2.1.3AKTIP cDNA预测的氨基酸序列分析

经InterPro:protein sequence analysis&classification预测表明，AKTIP cDNA编码的氨基 酸序列(如SEQ ID NO:2所示)属于：

(1)第52-192个氨基酸为Ubiquitin-conjugating enzyme/RWD-like；

(2)第72-192个氨基酸为Ubiquitin-conjugating enzyme,E2；

(3)第37-192个氨基酸为Ubiquitin-conjugating enzyme,E2家族的AKT-INTERACTING  PROTEIN亚家族。

2.1.4褐飞虱AKTIP基因的同源性分析

同源性比对结果发现褐飞虱AKTIP基因推导的氨基酸序列同其它物种的AKTIP同源性较 低(表2)，表明该基因具有种的特异性。

表2褐飞虱AKTIP基因与其它物种AKTIP氨基酸序列的比较

2.2从TN1-RHT 1-5代-RHT水稻上褐飞虱不同发育时期AKTIP的表达规律分析

在TN1-RHT水稻1-5代-RHT水稻上褐飞虱不同发育阶段进行转录水平的定量，结果表 明AKTIP基因在所有龄期褐飞虱中均有表达，在怀卵雌虫时表达量达到最高，而在雄成虫体 内表达量很低，说明该AKTIP基因在褐飞虱怀卵时期高表达。利用荧光定量PCR对AKTIP 基因在怀卵期进行转录水平的定量，发现AKTIP基因从TN1-RHT 1-5代-RHT上怀卵雌虫总 体上呈现下降的趋势(图4)，说明该基因表达在从感性水稻TN1上到抗性水稻RHT受到抑 制，可能与褐飞虱致害性变异相关。

2.3褐飞虱dsRNA的合成及RNA干扰

2.3.1褐飞虱dsRNA的合成

利用引物dsAKTIP-F、dsAKTIP-R和dsGFP-F、dsGFP-R(表1)分别合成用于AKT互 作蛋白基因AKTIP RNA干扰的片段dsAKTIP及非靶标对照干扰片段dsGFP，结果获得预期 大小的片段，其中dsAKTIP为390bp，dsGFP为350bp(图5)。

2.3.2饲喂dsRNA对褐飞虱mRNA表达水平的影响

以纯营养液为空白对照(CK)，以添加终浓度0.5μg/μL dsGFP的人工饲料作为非靶标 对照组(dsGFP)，以添加浓度0.02μg/μL dsAKTIP，0.1μg/μL dsAKTIP，0.5μg/μL dsAKTIP 的人工饲料作为试验组。

对RNA干扰的褐飞虱按期取样，以饲喂营养液3d为对照组(羽化1d)的转录水平为标 准参照，将其表达量设为1，比较饲喂dsAKTIP和dsGFP对靶标基因转录水平的影响。结果 表明，随着喂食天数褐飞虱AKTIP基因表达量也随之增加；营养液喂养与0.5μg/μL dsGFP 的营养液和0.02μg/μL dsAKTIP之间差异不显著；营养液与0.1μg/μL dsAKTIP在喂食第 5天和第9天存在显著差异；营养液与0.5μg/μL dsAKTIP在喂食第3,5,9存在显著差异，其 中第5天存在极显著差异；在第7天喂食营养液与0.1μg/μL dsAKTIP和0.5μg/μL dsAKTIP 的褐飞虱AKTIP基因表达差异不明显，分析原因可能是由于营养液褐飞虱AKTIP基因表达 量个体间差异比较大引起，但总体上看其表达量相差还是比较大的(图6)。

2.3.3饲喂dsRNA对褐飞虱死亡率的影响

分别用纯营养液，以添加终浓度0.5μg/μL dsGFP的营养液(dsGFP)，以添加浓度 0.02μg/μL dsAKTIP，0.1μg/μL dsAKTIP，0.5μg/μL dsAKTIP的营养液饲喂褐飞虱，每天统 计存活率。结果表明，存活率随着饲喂天数的增加，纯营养液存活率100％，而其他均有死亡 (图7)，与AKTIP表达量相关系数为0.66(相关性较低不做进一步统计分析)，说明死亡 可能是不是该基因被干扰引起，可能是dsRNA中某些成分导致其死亡。

2.3.4饲喂dsRNA对褐飞虱羽化速率的影响

分别用纯营养液，以添加终浓度0.5μg/μL dsGFP的营养液(dsGFP)，以添加浓度 0.02μg/μL dsAKTIP，0.1μg/μL dsAKTIP，0.5μg/μL dsAKTIP的营养液饲喂褐飞虱，每天统 计羽化速率。结果表明(图8)，喂食营养液和dsGFP的褐飞虱在第4天时全部羽化，喂食 0.02μg/μL dsAKTIP的大部分羽化，而喂食0.1μg/μL dsAKTIP和0.5μg/μL dsAKTIP的褐飞虱 羽化速率较低，在后面几天羽化的数量也较少，与饲喂营养液存在极显著差异，与AKTIP表 达量相关系数为0.85，随着dsAKTIP浓度的增大，羽化速率越低，说明AKTIP基因与褐飞 虱的羽化发育相关。

2.3.5AKTIP的RNA干扰对褐飞虱体重及体型的影响

分别用纯营养液，以添加终浓度0.5μg/μL dsGFP的营养液(dsGFP)，以添加浓度 0.02μg/μL dsAKTIP，0.1μg/μL dsAKTIP，0.5μg/μL dsAKTIP的营养液饲喂褐飞虱，第9天 称量体重并进行拍照。结果分析，喂食营养液和dsGFP的褐飞虱不存在差异，而喂食dsAKTIP 的均存在极显著差异，同时随着dsAKTIP浓度升高，褐飞虱的体重逐渐下降(图9)，体型 逐渐减小(图10)，同时不同组褐飞虱体重与AKTIP表达量相关系数为0.92，相关性较高， 说明AKTIP基因与褐飞虱的生长快慢相关。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国计量学院

 

<120>  褐飞虱生长发育相关的NlAKTIP基因、编码蛋白及其应用

 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  964

<212>  DNA

<213>  Nilaparvata lugens Stal

 

<400>  1

acatgggaga caataacaca taacctcaaa aaatcaatat gaagctcaaa ataagtatta       60

 

actaatttgt ttactactat ctttaaaaac ttcgttacaa ataataaaaa tattcatagc      120

 

ttggagttat ctagaaaaat cttagcaaat aagagagttt gtagaatttg aggtaatcaa      180

 

tcaagtaaac tgtgtcatgg cttcaggtag tttcaaaaag ggttctgagg caacagagac      240

 

aaatgaacct ttcaaacggc aaggctcatt gcgaaaagtt cttcctccta aacaatatgg      300

 

agaatcaatg cttagcatgt ctgccaaaat gatcgaacgt ccacaacaat cttcttcgca      360

 

aacaagtctt tacaagcaag cttacagtcc attcttccaa gagtatagta taatgagtga      420

 

atacaaccta ctgactaaga aatgtcttcc agggctctat gttatgccct ccgcttcttc      480

 

tcctttatta tggtttggtg tattgttcat caaaaaaggg ctctatcatg gaggtatctt      540

 

tcgtttcaat ttggaaactc ccgagacctt tcctgattgc acatgtccga aagttgtatt      600

 

cgagtctaaa gtcttccatc ctagtataga cattgcaact ggcgaagttt tcttgaatca      660

 

aacatttccg gagtggaaga aagacgtgaa ccatttatgg caaatacttg aacacgtatt      720

 

gcagttgttt ctcagcattg acgtcaagga tgcagtcaac caagaagcat ctatctctat      780

 

gtgaacgata tggatgcctt cgtcaaccga gtgaaagaga gtgtagactc ttctcagaat      840

 

aatttgttcg acgaaccgac gtcaagtgat cctactatct ccgattcaat caatatgatg      900

 

aaaccctcca taagacagca agagaagctt taaagtcgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960

 

aaaa                                                                   964

 

 

<210>  2

<211>  195

<212>  PRT

<213>  Nilaparvata lugens Stal

 

<400>  2

 

Met Ala Ser Gly Ser Phe Lys Lys Gly Ser Glu Ala Thr Glu Thr Asn

1               5                   10                  15     

 

 

Glu Pro Phe Lys Arg Gln Gly Ser Leu Arg Lys Val Leu Pro Pro Lys

            20                  25                  30         

 

 

Gln Tyr Gly Glu Ser Met Leu Ser Met Ser Ala Lys Met Ile Glu Arg

        35                  40                  45             

 

 

Pro Gln Gln Ser Ser Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Lys Gln Ala Tyr Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Pro Phe Phe Gln Glu Tyr Ser Ile Met Ser Glu Tyr Asn Leu Leu Thr

65                  70                  75                  80 

 

 

Lys Lys Cys Leu Pro Gly Leu Tyr Val Met Pro Ser Ala Ser Ser Pro

                85                  90                  95     

 

 

Leu Leu Trp Phe Gly Val Leu Phe Ile Lys Lys Gly Leu Tyr His Gly

            100                 105                 110        

 

 

Gly Ile Phe Arg Phe Asn Leu Glu Thr Pro Glu Thr Phe Pro Asp Cys

        115                 120                 125            

 

 

Thr Cys Pro Lys Val Val Phe Glu Ser Lys Val Phe His Pro Ser Ile

    130                 135                 140                

 

 

Asp Ile Ala Thr Gly Glu Val Phe Leu Asn Gln Thr Phe Pro Glu Trp

145                 150                 155                 160

 

 

Lys Lys Asp Val Asn His Leu Trp Gln Ile Leu Glu His Val Leu Gln

                165                 170                 175    

 

 

Leu Phe Leu Ser Ile Asp Val Lys Asp Ala Val Asn Gln Glu Ala Ser

            180                 185                 190        

 

 

Ile Ser Met

        195