同时高效扩增CD3+CD56+CIK细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法

摘要

本发明公开了一种同时高效扩增CD3+CD56+CIK细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法，步骤为：用含自体血浆的无血清培养基调整分离的PBMC浓度加入Anti-CD16抗体、IL-2、IL-15后转入T175培养瓶中培养，后再加入Anti-CD3抗体、Anti-CD137抗体，根据细胞的生长情况，每隔2天补充含自体血浆、IL-2和IL-15的无血清培养基，控制细胞浓度约1.5×106/ml，培养14～21天后可同时获得大量较高纯度的CD3+CD56+CIK和CD3-CD56+NK细胞，且总细胞数量能达到临床用于肿瘤过继性细胞免疫治疗所需细胞数量的有效值。本发明简便、有效，细胞杀伤活性高。

说明书

技术领域

本发明属于免疫细胞体外培养领域，涉及一种由外周血单个核细胞(PBMC)同时高效扩 增CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病，其死亡率呈逐年上升趋势。肿瘤的传统治疗手 段主要包括手术、化疗及放疗。但传统的治疗手段对肿瘤细胞的杀伤缺乏特异性，对正常 的组织细胞亦有损伤，伴随着明显的毒副反应。近年来，随着免疫学及分子生物学技术的 发展，诞生了肿瘤治疗的第四种模式，即生物治疗。生物治疗能够更为特异性的杀灭肿瘤 细胞，对正常组织细胞无损伤，并且可通过激活患者自身的免疫系统产生免疫记忆效应进 而预防肿瘤的复发和转移，是手术、化疗、放疗的有益补充。

肿瘤的生物治疗中一种重要的方法就是过继性细胞免疫疗法(Adoptive cellular  immunotherapy，ACI)，即通过分离患者自身免疫细胞，体外经过多种细胞因子的诱导激活 或通过基因改造后扩增，获得大量具有强大抗肿瘤活性的免疫细胞并回输到患者体内通过 直接杀伤肿瘤细胞，或者通过激活机体的免疫反应而间接杀伤肿瘤细胞。细胞免疫治疗可 以，有效降低恶性肿瘤复发和转移的风险，综合扩增机体免疫功能对抗癌细胞，清除传统 治疗后微小残留病灶和体内游离癌细胞，显著改善患者的生活质量，有效延长患者的生存 期，而且无任何毒副作用和治疗痛苦，与传统治疗联合应用于临床治疗癌症效果极佳而越 来越受到关注。

生物治疗中应用的免疫细胞主要有:淋巴因子激活的杀伤细胞(lymPhokine activated  killer，LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)、细胞因子诱导的杀 伤细胞(cytokine induced killer cell，CIK)和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、NKT 细胞(Natural Killer T cells，NKT)等，以其杀伤肿瘤细胞活性高、杀伤谱广等优点，在肿瘤 的综合治疗中显示出重要的临床应用价值。

CIK细胞(细胞因子诱导的杀伤细胞)是以CD³⁺CD⁵⁶⁺双阳性细胞为主要效应细胞的一 群具有非特异性杀伤功能的细胞。由于其主要效应细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分 子，故又称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC 限制性杀瘤优点。由于CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可 高度扩增等特点，是临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。

NK细胞(自然杀伤细胞)，是属淋巴细胞谱系的一类非特异性免疫细胞，其无须预先 接触抗原即可杀伤被病毒感染的宿主细胞，是人体免疫系统的主要成员，不仅对抗病毒感 染起着重要的作用，而且活化后的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，与机体的抗肿瘤和 免疫调节功能密切相关，能广泛识别、迅速溶解、杀伤、摧毁癌细胞，对肿瘤转移和复发 的元凶——肿瘤干细胞具有显著的杀伤作用。

由于CIK、NK细胞具有强大的抗肿瘤活性，近年来，随着免疫细胞制备技术的进步和 人们对免疫细胞治疗的认知和接受度的提高，CIK及NK细胞在临床肿瘤治疗上都有广泛应 用，但均是通过体外对患者的CIK、NK免疫细胞分别进行扩增，采血量大，成本高等因素 成为多种细胞免疫治疗发展的瓶颈。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于 提出一种新的免疫细胞体外扩增的方法，该方法能够利用一个培养系统，于体外培养条件 下同时获得大量应用安全、纯度较高、活性强的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种同时高效扩增CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和 CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的方法。根据本发明实施例，该方法的步骤为：

第0天，取外周血，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将分离得到的PBMC用第一培 养基调整PBMC浓度为2×10⁶/ml,制成PBMC细胞悬液，然后往PBMC细胞悬液加入 Anti-CD16抗体、IL-2、和IL-15，之后转入培养瓶中于37℃、5％CO₂、100％湿度条件下 开始培养，所述第一培养基为含自体血浆的无血清培养基；

第1天，细胞培养24小时后加入Anti-CD3抗体,Anti-CD137抗体，在37℃、5％CO₂、 100％湿度条件下培养；

第3天，往细胞悬液中半量补加第二培养基，所述第二培养基为含自体血浆、IL-2、IL-15 的无血清培养基；

第5天，离心收集细胞，并用所述第二培养基将细胞重悬并调整细胞浓度至1.5× 10⁶/ml，转移至细胞培养装置中；

继续培养和收获：以后每隔2天取样计数细胞，根据计数结果往所述细胞培养装置中补 充所述第二培养基，调整细胞密度为1.5×10⁶/ml，37℃、5％CO₂、100％湿度条件下连续培 养14～21天后，离心收集获得的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞。

发明人惊奇地发现，利用本发明的方法仅利用一个培养系统，在一个培养步骤中即可 于体外培养条件下，从自体外周血单个核细胞(PBMC)同时高效扩增获得大量应用安全、纯 度较高、活性强的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞。此外，根据本发明的实施例， 本发明的方法简单易操作，且成本较低，适于广泛推广应用。

其中，需要说明的是，在本申请中所使用的术语“自体血浆”是指，与所述外周血来 源相同的供体的血浆。

根据本发明的实施例，所述第一培养基和所述第二培养基中自体血浆的浓度均为 1％-20％体积。根据本发明的一具体示例，所述第一培养基和所述第二培养基中自体血浆的 浓度均为1体积％。由此，目的细胞扩增效果好。

根据本发明的实施例，在所述第一培养基和所述第二培养基中，所述Anti-CD16抗体 的终浓度均为50ng～1mg/ml。根据本发明的一具体示例，在所述第一培养基和所述第二 培养基中，所述Anti-CD16抗体的终浓度均为500ng/ml。由此，目的细胞扩增效果好。

根据本发明的实施例，在所述第一培养基和所述第二培养基中，所述IL-2的终浓度均 为1000～6000U/mL。根据本发明的一具体示例，在所述第一培养基和所述第二培养基中， 所述IL-2的终浓度均为1000U/mL。由此，目的细胞扩增效果好。

根据本发明的实施例，在所述第一培养基和所述第二培养基中，所述IL-15的终浓度 均为1ng/ml～100ng/ml。根据本发明的一具体示例，在所述第一培养基和所述第二培养基 中，所述IL-15的终浓度均为20ng/ml。由此，目的细胞扩增效果好。

根据本发明的实施例，第1天，细胞培养24小时后加入的所述Anti-CD3抗体的终浓 度为10ng～1mg/ml。根据本发明的一具体示例，第1天，细胞培养24小时后加入的 Anti-CD3抗体的终浓度为50ng/ml。由此，目的细胞扩增效果好。

根据本发明的实施例，第1天，细胞培养24小时后加入的所述Anti-CD137抗体的终 浓度为10ng～1mg/ml。根据本发明的一具体示例，第1天，细胞培养24小时后加入的 Anti-CD137抗体的终浓度为500ng/ml。由此，目的细胞扩增效果好。

根据本发明的实施例，所述细胞培养装置是G-REX 100L培养装置。其中，需要说明 的是，所述细胞培养装置在培养过程中呈封闭状态。

根据本发明的实施例，在所述继续培养和收获的步骤中，当培养体系的总细胞计数不 小于5x10⁹时，离心收集获得的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞。由此，能够有效收 集获得目的细胞。

根据本发明的一些实施例，所述无血清培养可以是AIM-V无血清培养基、日本宝日医 的GCT551和LONZA的X-VIVO15，以色列BI公司的BIOTARGET-1 Without L-Glutamine培 养基的至少一种。

此外，根据本发明的实施例，通过本发明的方法获得的两种细胞，可以用于制备细胞 治疗产品，进而用于临床肿瘤过继性细胞免疫治疗。

本发明的同时高效扩增CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的方法，由于在一个培 养体系中就能同时诱导和扩增出2种效应细胞，相对于传统的方法需要对2种效应细胞同时 平行地实施培养步骤，其成本降低，方法简单，易于操作，扩增效率高，易于推广，相对 于应用广泛的常规方法培养的CIK细胞，细胞群的杀伤活性和细胞因子的分泌都有大幅度 提高。

其中，需要说明的是，本发明所述的“第0天”，指的是采样当天，第1天指的是采 样后的第一天，第3天，第5天……以此类推。

此外，本发明所述的“CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞”是指通过流式细胞仪检测细胞表面分子标 记为CD³⁺CD⁵⁶⁺的CIK细胞(即细胞因子诱导的杀伤细胞，又称为NK细胞样T淋巴细胞)， “CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞”是指通过流式细胞仪检测细胞表面分子标记为CD^3-CD⁵⁶⁺的NK细胞 (即自然杀伤细胞)。

根据本发明的一些具体示例，本发明的方法简便、有效、能在一个培养步骤中从自体 外周血单个核细胞(PBMC)同时高效扩增获得CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的方 法，并且与常规的培养方法相比，本发明至少具有如下优点：

1、步骤中采用了新型细胞培养装置G-rex 100L,其特殊的底部换气改善了常规方法用 细胞培养瓶或细胞培养袋培养过程由于培养基体积的不断增加而导致细胞呼吸困难等问 题，大幅度提升了细胞扩增效率。

2、步骤中仅仅通过Anti-CD3，Anti-CD16,Anti-CD137三种抗体组合，在一个培养系统 里实现了对CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的同时激活。CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK主要细胞是 通过诱导活化的T细胞分化而来，Anti-CD3抗体作为抗原刺激提供了T细胞活化的第一信号 来激活T细胞；CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞既不是T细胞,也不是B细胞,但CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞可表达 低亲和性的IgGFc受体FcγRⅢ(CD16)，CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞缺乏CD3分子,但它能表达CD3 的ζ链分子,并与CD16一起组成IgGFc低亲和力受体来激活NK细胞；而CD137/CD137L则是 TNFR/TNF超家族成员之一，与anti-CD3和anti-CD16抗体相互作用共同介导的共刺激信号同 样可刺激细胞的增殖。本发明所述的方法，通过三种单抗相互间的协同作用刺激T细胞和 NK细胞高通量地活化增殖，从而使得一个培养系统中同时获得满足临床需要的 CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞数量。

3、步骤中仅仅通过IL-2和IL-15两种细胞因子就实现了对CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和 CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的扩增，IL-2可刺激NK细胞表达大量的IL-2Rα链，从而使NK细胞大量 增殖，并且在IL-2刺激下NK细胞表达黏附分子，使CD^3-CD⁵⁶⁺NK胞质中的颗粒增加并促进 丝氨酸酯酶mRNA的表达，从而提高CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的细胞毒活性；IL-15是一种多功能 的细胞因子，是造血前体细胞向NK细胞定向发育的决定性因子，具有促进CD^3-CD⁵⁶⁺NK细 胞增生，上调NK细胞毒活性，促进NK细胞分泌各种细胞因子参与免疫调节和趋化作用， 通过两种因子间的相互协同作用，不但可以促进CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的扩增，还可以大幅度 提高CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞的毒活性。

4、利用细胞因子组合同时诱导扩增CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞技术，可以 提高传统CIK群体里的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞含量，协同和增强免疫细胞 的抗肿瘤疗效。

5、本发明方法所得到的细胞，具有杀伤活性和分泌细胞因子的能力，细胞培养全程采 用无血清培养基，保证细胞数量和活性外，增加了临床应用的安全性。

附图说明

图1为常规组和实验组两种不同方法所得细胞的培养天数与细胞增殖倍数的关系图；

图2中左图为流式细胞分析仪检测常规组细胞分别表达CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞及表达 CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞百分数图，右图为实验组细胞分别表达CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞及表达 CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞百分数图；

图3中左图为流式细胞分析仪检测实验组细胞与靶细胞作用后分泌细胞因子IFN-γ的 细胞百分数图，右图为实验组细胞自发分泌细胞因子IFN-γ的细胞百分数图；

图4中左图为流式细胞分析仪检测常规组细胞与靶细胞作用后分泌细胞因子IFN-γ的 细胞百分数图，右图为实验组细胞自发分泌细胞因子IFN-γ的细胞百分数图；

图5中左图流式细胞分析仪检测实验组细胞与靶细胞作用后分泌细胞因子CD107a的 细胞百分数图，右图为实验组细胞自发分泌CD107a的细胞百分数图；

图6中左图为流式细胞分析仪检测常规组细胞与靶细胞作用后分泌细胞因子CD107a 的细胞百分数图，右图为实验组细胞自发分泌CD107a的细胞百分数图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中 未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

一、从外周血PBMC细胞同时高效扩增CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的方法 (以下简称实验组)。

第0天：

1 采集健康人外周血(100ml)，用淋巴细胞分离液(Axis-Shield公司，挪威)通过梯 度离心法分离外周血单个核细胞，同时收集分离管上层黄色血浆作为自体血浆。

2 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(GIBCO公司，美国)，洗涤细胞两次，用台盼蓝(GIBCO 公司，美国)拒染法检测细胞活性并计数。

3 将分离所得的外周血单核细胞1.17x108细胞悬浮在含培养基体积1％自体血浆的 AIM-V无血清培养基中(GIBCO公司，美国)，使得细胞初始接种浓度为2.5X106/ml，共 47ml。

4 将步骤3所得外周血单核细胞(2.5X106/ml，共47ml)接种至一个175cm²细胞培养 瓶(Greiner Bio-one德国)中。

5 将Anti-CD16抗体以终浓度为500ng/ml添加至步骤4的细胞悬液中，在37℃，5％ CO2，100％湿度下培养24小时。

第1天：

6 细胞培养24小时后将Anti-CD3抗体、Anti-CD137抗体添加至细胞悬液中，使得 Anti-CD3抗体终浓度50ng/ml，Anti-CD137抗体终浓度500ng/ml，在37℃，5％CO₂，100％ 湿度下继续培养。

第2天：

7 每隔2天取样通过台盼兰拒染法计数细胞和统计活率，根据细胞计数情况，补加含

培养基体积1％自体血浆、1000U/ml IL-2和20ng/ml IL-15的AIM-V无血清培养基，调 整细胞密度为1.5×106/ml，37℃、5％CO₂、饱和湿度下继续培养。

第5天：

8 离心收集细胞，含培养基体积1％自体血浆、1000U/ml IL-2和20ng/ml IL-15的 AIM-V无血清培养基并将细胞重悬并调整细胞密度至1.5×106/ml，转入G-rex 100L(wilson 公司，美国)细胞培养装置中

第6-14天：

9 以后每隔2天取样计数细胞，根据计数结果往封闭的细胞培养装置中补加培养基含1 体积％自体血浆、1000U/ml IL-2和20ng/ml IL-15的AIM-V无血清培养基，调整细胞密度为 1.5×106/ml，37℃、5％CO₂、饱和湿度下继续培养至第14天。

二、从外周血PBMC细胞中常规扩增CIK培养方法(以下简称常规组)

将采集的外周血单个核细胞用AIM-V无血清培养基调整浓度为1×10⁶ U/ml，第0天加入 IFN-γ，使得IFN-γ在培养基中的终浓度为1000U/ml，随后将培养液置于37℃，CO₂浓度 为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时；

第1天加入IL-1α、IL-2以及Anti-CD³抗体，使得IL-1α、IL-2以及Anti-CD³抗体在 AIM-V无血清培养基中的终浓度分别为300U/ml、1000U/ml以及500U/ml，继续在37℃， CO₂浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养；

以后每隔2天取样计数细胞，根据计数结果添加含IL-2的新鲜AIM-V无血清培养基，使 得IL-2在新添加培养基中的终浓度为1000U/ml，调整细胞浓度保持在1.5×10⁶/ml，当培养体 积大于200ml后转入细胞培养袋培养至第14天。

三、结果测试

在第14天收集由本实施例所述实验组及常规组方法所培养的细胞用于各项测试。

从以下几个方面比较这两种制备方法获得的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞的 差异性，常规组是以本实施例步骤二所提供的方法制备的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和 CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞，实验组是以本实施例步骤一所提供的方法制备的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和 CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞。

1：细胞增殖倍数的测定

将取得的细胞用台盼蓝(GIBCO，美国)染色后再用血球计数板进行计数，将当前的 细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的扩增倍数。用此方法可以动态观察 细胞的增殖状况，具体情况见图1，从图1可以看出，实验组和常规组细胞增殖速度相当， 细胞总数能够满足临床应用。

2：流式检测两组细胞(表达CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞及表达CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞)表型分析

两组细胞在培养的第14天各取5×10⁵细胞至1.5ml离心管中，离心收集细胞，PBS洗涤2 次，加入100μl PBS重悬细胞，然后加入FITC Mouse Anti-Human CD³检测抗体20μl(BD  Pharmingen，美国)，PE Mouse Anti-Human CD⁵⁶检测抗体20μl(BD Pharmingen，美国) 进行双标记，于室温暗处孵育20分钟，PBS洗2次，洗去多余抗体，最后用500ul PBS将细 胞重悬，通过流式细胞分析仪(Millipore guava easyCyte 6HT-2L，美国)测定，结果见图2。 图2的结果显示，实验组的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细胞百分比例均比常规组有大 幅度的提高。

3：流式检测两组细胞中细胞因子IFN-γ的表达水平

取对数生长期的K562肿瘤细胞(中国典型培养物保藏中心，武汉)至无菌15ml离心管 中，1500rpm，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用含培养基体积10％FBS的1640培养基重悬， 调整细胞浓度为5×10⁶/ml，接种细胞于一个96孔平底板中，100μl/孔，接种2孔，置于37℃， CO₂浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时作为靶细胞待用；

分别收集培养14天的实验组和常规组培养细胞，用含培养基体积10％FBS的1640培养基 调整细胞密度为5×10⁶/ml，作为效应细胞。移液器吹打混匀细胞后各取100μl，5×10⁵细 胞加至前述96孔板中100μl的5×10⁵靶细胞中，使效靶比为1:1(效靶比：效应细胞数量与 靶细胞数量之比，以下同此)，按每ml细胞悬液加入BFA 1μl(Protein Transport  Inhibitor(Containing Brcfcldin A)，BD Pharmingen，美国)，并设未与肿瘤细胞反应的两组 细胞为效应细胞空白对照，37℃，5％CO₂共孵育4小时后各取混合细胞1x10⁶，PBS洗2次， 每管加入PE Mouse Anti-Human CD56检测抗体20μl(BD Pharmingen，美国)，室温孵育 30min，加固定剂500μl(fixation/permeabilization Kit，BD Pharmingen，美国)室温孵育 15min，PBS洗，加入破膜剂500μl(fixation/permeabilization Kit，BD Pharmingen，美国) 室温5Min,加入FITC Mouse Anti-HumanIFN-γ检测抗体20μl(BD Pharmingen，美国)， 室温孵育15min,PBS洗2次，最后用500μlPBS将细胞重悬，通过流式细胞分析仪测定CD⁵⁶⁺细胞内IFN-γ的表达水平，结果见图3，图4。

最终细胞表达IFN-γ百分数计算方法＝加靶细胞刺激的IFN-γ阳性率(％)-IFN-γ自 发表达率(％)

根据最终表达细胞IFN-γ百分数计算方法，从图3可以看出，实验组细胞中CD⁵⁶⁺效应 细胞表达IFN-γ的百分数为34.18％，而图4中常规组中CD⁵⁶⁺效应细胞表达IFN-γ的百分数 仅为1.28％，实验组细胞表达IFN-γ的细胞数是常规组的26.7倍，说明实验组细胞细胞因子 IFN-γ表达水平更高。

4：流式检测两组细胞的脱颗粒(表达CD107a)能力

溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1或CD107a)是一种高糖基化的蛋白，约占溶酶体膜蛋白 的50％。正常NK细胞及CIK表面几乎不表达CD107a分子，但当NK及CIK主要效应细胞杀伤 靶细胞时,毒性颗粒将到达浆膜面并与细胞膜融合,引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞 的死亡，随着脱颗粒的发生,CD107a分子被转运到细胞膜表面,且CD107a分子的表达上调 与穿孔素的分泌一致。因此,CD107a分子阳性表达的CD³⁺CD⁵⁶⁺CIK细胞和CD^3-CD⁵⁶⁺NK细 胞可代表具有杀伤活性的效应细胞。

取对数生长期的K562肿瘤细胞(中国典型培养物保藏中心，武汉)至无菌15ml离心管 中，1500rpm，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用含培养基体积10％FBS的1640培养基重悬， 调整细胞浓度为5×10⁶/ml，接种细胞于一个96孔平底板中，100μl/孔，接种2孔，置于37℃， CO₂浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时作为靶细胞待用；

分别收集培养14天的实验组和常规组培养细胞，用含培养基体积10％FBS的1640培养基 调整细胞密度为5×10⁶/ml，作为效应细胞。移液器吹打混匀细胞后各取100μl，5×10⁵细 胞加至前述96孔板中100μl的5×10⁵靶细胞中，使效靶比为1:1，按每ml细胞悬液加入莫能 霉素0.67μl(Protein Transport inhibitor(containing Monensin)，BD Pharmingen，美国)， 并设未与肿瘤细胞反应的两组细胞为效应细胞空白对照，37℃,5％CO₂共孵育1.5小时后， 各取混合细胞1x10⁶，PBS洗2次，每管加入APC Mouse Anti-Human CD56检测抗体20μl， PE Mouse Anti-Human CD107a检测抗体20μl(BD Pharmingen，美国)，室温孵育30 min, PBS洗2次，通过流式细胞分析仪测定CD⁵⁶⁺细胞内CD107a的表达水平，结果见图5和6。

最终细胞表达CD107a百分数计算方法＝加靶细胞刺激的CD107a阳性率(％)-CD107a 自发表达率(％)

根据最终细胞表达CD107a百分数计算方法，从图5可以看出，实验组细胞中CD56⁺效应 细胞表达CD107a的百分数为22.45％，而图6中常规组中CD⁵⁶⁺效应细胞表达CD107a的百分数 仅为6.32％，实验组细胞表达CD107a的细胞数是常规组的3.55倍，说明实验组细胞对肿瘤细 胞的杀伤作用更强大。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。