改良的杏鲍菇液体发酵培养基以及利用其培养杏鲍菇液体菌种的方法

摘要

本发明涉及一种微生物培养基及培养方法，特别是指改良的杏鲍菇液体发酵培养基以及利用其培养杏鲍菇液体菌种的方法。选用有效量的葡萄糖，黄豆粉，玉米粉，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物培养基及培养方法，特别是指改良的杏鲍菇液体 发酵培养基以及利用其培养杏鲍菇液体菌种的方法。

背景技术

杏鲍菇是深受人们喜欢的营养和保健食品，近年来由于工厂化栽培技术 的迅猛发展，为缩短菌种制备周期，提高菌种质量和生产效率，国内外生产 厂家研究开发液体菌种用于替代目前杏鲍菇生产中普遍使用的固体菌种，并 在实际生产中开始应用。

杏鲍菇液体菌种是通过液体发酵工艺生产有活力的杏鲍菇菌丝体。目前， 国内尚未颁布统一的国家标准来规范杏鲍菇液体菌种的质量和品质，但是在 实际应用过程中人们总结应用效果制订了一些地方性标准，如辽宁省地方标 准-《DB21/T 1693-2008食用菌液体菌种生产技术规程》等，在这些标准中 明确规定，合格的食用菌液体菌种应该“可见特有的菌丝形态，球状和丛状 菌丝体大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀”“菌液稍粘稠，有大量 片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀”，也就是说优良的液体菌种菌丝球密度高、 直径小，分布均匀；另一方面，在实际生产应用中杏鲍菇液体菌种是通过生 产线接种机进行机械化接种操作，由于接种机喷口狭窄，为防止菌液堵塞管 道，还需要增加液体菌种接种前的预处理工艺(一般采用机械粉碎的方法使 菌液中的菌丝球直径变小，使菌液变均匀)。

因此申请人认为，杏鲍菇液体发酵菌丝球的大小、密度、均匀度等物理 特性是优质液体菌种的关键控制指标。

国内有关杏鲍菇液体培养的研究报道和专利技术基本集中在发酵工艺的 优化方面，对改善发酵菌丝球物理特性的研究和专利主要是依靠机械粉碎的 方法或者在液体培养基中添加玻璃珠、小弹簧通过打散菌丝球的方式来减小 发酵菌丝球直径，增加密度和均匀度。机械粉碎的方法工艺复杂，极易感染 杂菌导致栽培失败；添加玻璃珠和小弹簧的方法只适用于摇瓶发酵的小规模 生产，应用于工厂化发酵罐生产几乎不可操作。

发明目的

本发明的目的在于提供一种改良的杏鲍菇液体菌种发酵培养基以及利用 其培养杏鲍菇液体菌种的方法。可以有效减小菌丝球直径，增加菌丝球密度。

本发明的整体技术构思是：

改良的杏鲍菇液体菌种发酵培养基，该发酵培养基采用如下质量百分含 量的组分组成：葡萄糖1％-2％；黄豆粉1％-2％；玉米粉2％-3％；磷酸二氢钾 0.05％-0.2％；硫酸镁0.01％-0.05％；维生素B₁0.02g/l-0.05g/l，明胶、琼脂 中的一种或者二者的混合物0.1克/100ml-0.3克/100ml，余量为无菌水，pH 自然。

利用上述发酵培养基培养杏鲍菇液体菌种的方法，是将杏鲍菇菌种接种 于权利要求1的培养基中进行培养制成杏鲍菇液体菌种，其中培养条件为温 度为25±3℃，转速为180-200r/m；摇床震荡培养6-8d；所述的杏鲍菇菌种 选用选用杏鲍菇(Pleurotus eryngii)CICC 14011、杏鲍菇(Pleurotus  eryngii)ACCC 51678、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)ACCC 51330中的一种。

本发明中各项技术指标的测定方法如下：

1、杏鲍菇菌丝球密度计数法：均匀取1ml培养液，无菌生理盐水稀释至 10ml，混匀，取1mL稀释液置于平皿中，展开。平皿下衬黑色背景纸，计数。

2、杏鲍菇菌丝球干重法(生物量)：均匀取100ml培养液，经80目筛网 过滤，用无菌生理盐水洗涤，至洗涤液澄清。将菌丝球置于恒重的定性滤纸 上，60℃烘至恒重后称重。

3、菌丝球直径测定：随机取菌丝球20个，排列成直线，用游标卡尺测 其长度，计算得到20个菌丝球的平均直径(cm)，重复3次。

为确定增稠剂种类，申请人进行了如下实验：

一、增稠剂的选取以及增稠剂对杏鲍菇菌丝球生长的影响

(1)黄原胶、羟乙基纤维素及甲基纤维素对杏鲍菇菌丝球生长的影响

实验表明，在培养基中添加黄原胶，羟乙基纤维素或者甲基纤维素，抑 制了杏鲍菇菌丝球的生长。

查阅资料：黄原胶是一种由假单胞菌属产生的单胞多糖；近年来关于食 用菌细菌性病害的研究表明，大部分致病菌为假单胞菌属，故其代谢物对食 用菌的生长也有抑制作用。甲基纤维素、羟乙基纤维素会和营养物质上的羟 基结合，影响菌丝对液体培养基中营养物质的吸收利用。

(2)淀粉和羟甲基纤维素对杏鲍菇菌丝球生长的影响

实验表明(如图1-2所示)，在培养基中添加淀粉或者羟甲基纤维素，与 空白对照组进行对比，对菌丝球生长并没有明显影响。

(3)海藻酸钠对杏鲍菇菌丝球生长的影响

实验表明(如图3所示)，在液体培养基中添加了海藻酸钠之后，杏鲍菇 菌丝球的直径明显大于空白对照组，不符合生产对杏鲍菇菌丝球直径要小的 要求。

(4)琼脂和明胶对杏鲍菇菌丝球生长的影响

考察在培养基中添加不同浓度的琼脂，杏鲍菇菌丝球的生长情况，结果 如图4所示。当液体培养基中琼脂的含量超过0.4％时，液体培养基发生凝固， 无法进行摇床培养。当液体培养基中的琼脂含量为0.3％时，菌丝球直径最小， 为2.41mm，与空白对照组相比，降低了约18.9％，而此时，菌丝球的密度也 达到最大，为3.14×10⁴个/L,与空白对照组相比，提高了57.9％。此时菌丝球 干重也较高，为6.14g/100mL。

考察在液体培养基中添加不同含量的明胶，杏鲍菇菌丝球的生长情况， 如图5所示。当明胶浓度在0.2％时，菌丝球直径达到最小，为2.54mm，与空 白对照组相比，降低了约14.5％，此时，菌丝球密度也接近峰值，为3.03× 10⁴个/L，与空白对照组对比，提高了52.3％。菌丝球干重达到最大， 7.93g/100mL。

(5)添加0.3％琼脂、0.2％明胶与空白对照组的对比

根据上述第(4)条的结果，当添加的增稠剂为0.3％琼脂或者为0.2％明 胶时，得到的杏鲍菇菌丝球最符合实验最初要求，将两种浓度所得结果与空 白对照组进行对比，如图6所示，菌丝球直径，两者都小于空白对照组；菌 丝球密度，两者都大于空白对照组；而两者在直径和密度上差别不大。而在 菌丝球干重方面，0.2％明胶组优于空白对照组，空白对照组优于0.3％琼脂组。

(6)对0.3％琼脂组和0.2％明胶组杏鲍菇菌丝球进行活力测量

根据实验所得数据，做出图7、图8。得到在培养基中添加0.3％琼脂或者 0.2％明胶所得菌丝球在平皿上菌丝日生长速率线性方程：y＝0.5443x+ 1.3643，R²＝0.9088(添加0.3％琼脂)；y＝0.5411x+1.0257，R²＝0.9541(添 加0.2％明胶)。通过对比，发现0.3％琼脂组菌丝球活力略优于0.2％明胶组菌 丝球活力。且两者菌丝球活力都优于对照组。

二、申请人将利用本专利申请方法获得的杏鲍菇液体菌种与传统方法获 得的液体菌种菌丝形态进行了对比，结果如下。

如图9所示，其中与对照组(左图)相比较，利用本申请的方法获得的 液体菌种菌丝球直径明显变小，菌液密度提高，且均匀悬浮。

三、申请人对利用本申请的方法获得的杏鲍菇液体菌种的菌丝体进行了 显微观测，结果如下。

改良培养基发酵菌丝形态为球状或片状；在400倍显微镜下观察，菌丝 粗壮，菌丝细胞原生质充盈，均匀(图10)。

四、申请人对利用本申请的方法获得的杏鲍菇液体菌种与常规液体菌种 接种固体培养基后的菌丝生长活力进行了对比，结果如下。

使用常规培养基制备的杏鲍菇液体菌种接种固体培养料后，菌丝生长较 慢(白色部分为菌丝生长覆盖区域，较少)；使用改良后的培养基制备液体菌 种接种固体培养料后，菌丝生长发育快(白色部分为菌丝生长覆盖区域，较 多)，说明改良培养基制备的液体菌种活力旺盛，有应用价值。

本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：

本发明中的培养基各组分来源容易，添加明胶或琼脂后菌丝球直径明显 变小，菌液密度提高，且均匀悬浮。使用本方法制备的杏鲍菇液体菌种健壮， 接种固体培养基后生长活力优于传统方法液体菌种，生长速度快，菌丝粗壮， 菌丝细胞原生质充盈均匀。

附图说明

图1是不同淀粉浓度对杏鲍菇菌丝球生长的影响示意图。

如图1所示，在培养基中添加淀粉，与空白对照组进行对比，对菌丝球 生长并没有明显影响。

图2是不同羟甲基纤维素浓度对杏鲍菇菌丝球生长的影响示意图。

如图2所示，在培养基中添加羟甲基纤维素，与空白对照组进行对比， 对菌丝球生长并没有明显影响。

图3是不同海藻酸钠浓度对杏鲍菇菌丝生长的影响示意图。

如图3所示，在液体培养基中添加了海藻酸钠之后，杏鲍菇菌丝球的直 径明显大于空白对照组，不符合生产对杏鲍菇菌丝球直径要小的要求。

图4是不同琼脂浓度对杏鲍菇菌丝生长的影响示意图。

如图4所示，当液体培养基中琼脂的含量超过0.4％时，液体培养基发生 凝固，无法进行摇床培养。)当液体培养基中的轻质含量为0.3％时，菌丝球直 径最小，为2.41mm，与空白对照组相比，降低了约18.9％，而此时，菌丝球 的密度也达到最大，为3.14×10⁴个/l,与空白对照组相比，提高了57.9％。此 时菌丝球干重也较高，为6.14g/100ml。

图5是不同明胶浓度对杏鲍菇菌丝生长的影响示意图。

如图5所示，当明胶浓度在0.2％时，菌丝球直径达到最小，为2.54mm， 与空白对照组相比，降低了约14.5％，此时，菌丝球密度也接近峰值，为3.03 ×10⁴个/l，与空白对照组对比，提高了52.3％。菌丝球干重达到最大， 7.93g/100ml。

图6是添加0.2％明胶、0.3％琼脂培养的杏鲍菇菌丝与空白对照组对比示 意图。

如图6所示，菌丝球直径，两者都小于空白对照组；菌丝球密度，两者 都大于空白对照组；而两者在直径和密度上差别不大。而在菌丝球干重方面， 0.2％明胶组优于空白对照组，空白对照组优于0.3％琼脂组。

图7是0.3％琼脂菌丝球日生长速率图。

图8是0.2％明胶菌丝球日生长速率图。

根据实验所得数据，做出图7、图8。得到在培养基中添加0.3％琼脂或者 0.2％明胶所得菌丝球在平皿上菌丝日生长速率线性方程：y＝0.5443x+1.3643， R²＝0.9088(添加0.3％琼脂)；y＝0.5411x+1.0257，R²＝0.9541(添加0.2％明胶)。 通过对比，发现0.3％琼脂组菌丝球活力略优于0.2％明胶组菌丝球活力。且两 者菌丝球活力都优于原平板转接菌种。

图9是利用本专利申请方法获得的杏鲍菇液体菌种与传统方法获得的液 体菌种菌丝体形态(密度和直径)示意图。

如图9所示，其中与对照组(左图)相比较，利用本申请的方法获得的 液体菌种菌丝球直径明显变小，菌液密度提高，且均匀悬浮。

图10是利用本发明的方法的得到的杏鲍菇液体菌种菌丝体显微形态及菌 丝显微结构示意图。

其中图10左是利用本发明的方法的得到的杏鲍菇液体菌种菌丝体显微形 态示意图；图10右是利用显微镜观察采用本发明的方法的得到的杏鲍菇液体 菌种菌丝显微结构示意图。

如图10左所示，改良培养基发酵菌丝体形态为球状或片状；如图10右 所示，在400倍显微镜下观察，菌丝粗壮，菌丝细胞原生质充盈，均匀。

图11是采用本发明方法制备的杏鲍菇液体菌种与常规液体菌种接种固体 培养基后的菌丝生长对比情况示意图。

如图11左，使用常规培养基制备的杏鲍菇液体菌种接种固体培养料后， 菌丝生长较慢(白色部分为菌丝生长覆盖区域，较少)；如图11右，使用改 良后的培养基制备液体菌种接种固体培养料后，菌丝生长发育快(白色部分 为菌丝生长覆盖区域，较多)，说明改良培养基制备的液体菌种活力旺盛，有 实际应用价值。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本 发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技 术手段替换，均不脱离本发明的保护范围

实施例1

改良的杏鲍菇液体菌种发酵培养基，该发酵培养基采用如下质量百分含 量的组分组成：葡萄糖1％；黄豆粉1％；玉米粉2％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸 镁0.01％；维生素B₁0.02g/l，明胶0.1克/100ml，余量为无菌水，pH自然。

利用上述发酵培养基培养杏鲍菇液体菌种的方法，培养条件为温度为25 ±3℃，转速为180-200r/m；摇床震荡培养6-8d。

所述的杏鲍菇菌种选用杏鲍菇(Pleurotus eryngii)CICC 14011、杏鲍 菇(Pleurotus eryngii)ACCC 51678、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)ACCC 51330 中的一种。

实施例2

改良的杏鲍菇液体菌种发酵培养基，该发酵培养基采用如下质量百分含 量的组分组成：葡萄糖2％；黄豆粉2％；玉米粉3％；磷酸二氢钾0.2％；硫酸 镁0.05％；维生素B₁0.05g/l，琼脂0.3克/100ml，余量为无菌水，pH自然。

其余内容同实施例1。

实施例3

改良的杏鲍菇液体菌种发酵培养基，该发酵培养基采用如下质量百分含 量的组分组成：葡萄糖2％；黄豆粉1％；玉米粉2％；磷酸二氢钾0.2％；硫酸 镁0.05％；维生素B₁0.02g/l，明胶、琼脂的的混合物0.3克/100ml，余量为 无菌水，pH自然。

其余内容同实施例1。

实施例4

改良的杏鲍菇液体菌种发酵培养基，该发酵培养基采用如下质量百分含 量的组分组成：葡萄糖1.5％；黄豆粉1.5％；玉米粉2.3％；磷酸二氢钾0.1％； 硫酸镁0.04％；维生素B₁0.03g/l，明胶0.2克/100ml，余量为无菌水，pH自 然。

其余内容同实施例1。

实施例5

改良的杏鲍菇液体菌种发酵培养基，该发酵培养基采用如下质量百分含 量的组分组成：葡萄糖2％；黄豆粉1.5％；玉米粉2.5％；磷酸二氢钾0.1％； 硫酸镁0.04％；维生素B₁0.04g/l，琼脂0.25克/100ml，余量为无菌水，pH 自然。

其余内容同实施例1。