双夹心ELISA检测禽网状内皮组织增生病病毒抗原试剂盒及其应用

摘要

双夹心ELISA检测禽网状内皮组织增生病病毒（REV）抗原的试剂盒，属于生物技术检测领域，该试剂盒用于REVP30蛋白抗原检测，最低可以检测到10

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及对禽网状内皮组织增生病病毒（REV）抗原的一种检测技术领域。

背景技术

禽网状内皮组织增生病作为一种致瘤性和免疫抑制性疾病，其对家禽养殖业造成的危害不言而喻。但是由于种种原因，该病在许多国家和地区并未得到足够的重视。近年来，禽网状内皮组织增生病病毒（REV）在家禽的感染和流行有增加的趋势，与其它致瘤性疾病间的混合感染往往严重损伤禽群的生产能力并导致一定的经济损失，对家禽养殖业造成不利影响。

自1958年以来，REV已经通过多种途径传播到多个国家和地区的禽群中，呈现世界性分布。根据近年来在韩国、埃及、台湾和美国进行的血清学检测显示，多个鸡群和火鸡群中都存在REV抗体阳性，阳性率从34%到92%不等。在国内，上个世纪80年代该病仅在鸡群和鸭群中呈散发性分布，近年来，随着更多关于该病流行病学调查的开展，在很多鸡群中发现有较高的REV抗体阳性率。PCR和抗原检测显示，在肉鸡、蛋鸡、水禽中均存在不同程度的REV感染，我国大陆地区鸡群中REV的检出率，在所有检测样品中是最高的。

REV和其他几种免疫抑制病包括MDV、ALV和CAV混合感染的情况十分普遍，是导致鸡群出现严重免疫抑制、增强其他病原致病性的重要原因之一。在ALV-J和REV共感染的鸡群，虽然针对REV的免疫应答不会有明显抑制，但是针对ALV-J的免疫应答则会严重抑制，而且持续时间可长达7周，严重影响鸡群的生产能力，也妨碍了给ALV-J种群净化工作，在实验条件下，REV和MDV的混合感染可降低机体产生IFN-γ的能力，抑制了机体针对病毒的天然免疫能力。

除此之外，REV病毒核酸在其他病毒基因组内的插入也是近年来学术界关注的重点之一。在鸡痘病毒和马立克病毒基因组内，均出现部分REV基因组LTR序列或仅缺失部分3’端LTR的REV基因组大段插入其病毒DNA基因组的现象。在鸡痘病毒中，和未插入REV片段或插入片段数量较少的鸡痘病毒相比，插入REV基因组数量较多的鸡痘病毒在宿主体内的复制能力和毒力有明显增强。而在插入REV基因片段的马立克病毒中，删除REV的LTR片段后其生长及免疫抑制能力有所增强，但是MDV的水平传播能力却明显减弱，提示REV片段的插入在MDV的传播过程中具有重要意义。

病原的分离和鉴定是最经典、最可靠的REV检测方法，一般使用待检禽类的脏器研磨液、全血或血浆接种易感细胞，再使用含有1%小牛血清的维持液，在易感细胞上盲传2~3代，每代约一周时间，然后再使用针对REV的单克隆抗体进行免疫荧光、免疫组化、补体结合实验等对细胞培养物中可能存在的的病毒进行检测。该过程耗时长，而且灵敏度、简便性也不强，但是结果可靠，常常作为其他检测方法的金标准用作参考。以单克隆抗体或多抗血清为基础的夹心ELISA或抗体捕捉ELISA方法能够在短时间内直接对大批量包括肛拭子和蛋清在内的可疑样本中的REV env或p³⁰抗原成分进行检测，而且无需事先在易感细胞上进行病毒扩增，简便高效、经济方便，具有很高的使用价值。但在实验条件下，以多抗为基础的ELISA检测方法仍存在较高假阳性率，采用单克隆抗体能够解决这一问题。

血清学检测，可采用多种方法对可疑血清、蛋清或卵黄中REV抗体或抗原进行检测，但其出现的频率和持续时间并不一致。可以用固定的感染REV的易感细胞为抗原，对可疑血清样本进行IFA检测，也可以用病毒中和实验、琼脂凝胶沉淀实验（AGP）、或以gp⁹⁰为抗原的间接ELISA或阻断ELISA实验等进行检测，其中琼脂凝胶沉淀实验可用于抗原及抗体的检测但灵敏性不高。

因此目前需要开发高效、快捷、便利、经济成本较低并且能够用于大规模田间样品检测的诊断方法。

发明内容

本发明目的是建立一种双夹心ELISA检测禽网状内皮组织增生病病毒抗原的试剂盒，以适应高效、快捷、便利、经济成本较低的诊断需要。

本发明包括捕捉抗体REVp³⁰-2C8和酶标抗体REVp³⁰-5G6。

经鉴定，这些单抗均能与REV HA1101株和SNV株感染的CEF裂解产物中的P30反应，而不与正常CEF细胞、ALV-J、CAV、MDV或HVT等病毒感染的CEF细胞裂解产物反应。本发明建立的试剂盒，采用ELISA方法最低可以检测到10^1.82个TCID₅₀的REV HA1101或SNV所携带的P30抗原。采用本试剂盒，可使检测实现高效、快捷、便利、经济，并且能够用于大规模田间样品中禽网状内皮组织增生病病毒（REV）的检测。

本发明另一目的是提出双夹心ELISA检测禽网状内皮组织增生病病毒（REV）抗原试剂盒的应用。

本发明采用ELISA检测方法，特点是：将待检的细胞培养物、泄殖腔试子或蛋清作，以及体外表达的REV P30重组产物等样本，适当稀释后，加入该试剂盒酶标板中，可以检测样本中是否含有REV或REV的P30抗原。

采用以上方法，可快速、高效地判断样品中是否含有禽网状内皮组织增生病病毒（REV）或REV的P30抗原。

附图说明

图1 为PCR 扩增REV HA1101株p30基因的凝胶电泳分析图。

图2为重组蛋白的诱导表达分析图。

图3为REVp³⁰-2C8和REVp³⁰-5G6的单克隆抗体细胞上清IFA结果图片。

图4为试剂盒检测REV HA1101或SNV的病毒滴度与检测效果关系图。

图5 为试剂盒检测不同病毒或体外表达产物的反应结果图。

具体实施方式

一、REV HA1101株p30基因PCR扩增结果

用PCR扩增REV HA1101株p30基因，PCR产物经80V，1%琼脂糖凝胶电泳1h后，在凝胶成像系统下观察，如图1所示。图1中M表示1Kb DNA Marker；1表示正常CEF细胞基因组的PCR扩增结果。2，表示REV HA1101株感染CEF 细胞基因组的PCR扩增结果，大小约为627bp左右的条带。

二、REV p30测序结果及其分析

经Lasergene软件对pGEM-T-p30阳性克隆的测序结果进行分析，整个目的片段包括全部p30编码区，含有627个核苷酸，编码209个氨基酸，同样除了美国SNV株和中国HA9901株，该片段在核酸水平上与其他REV毒株间的同源性均超过99%；而在氨基酸水平上，和其他所有毒株的p30相比，仅在89位氨基酸处由苏氨酸变为丙氨酸，与各个毒株间的同源性均达到了99.5%。

三、pGEX-6p-1-p30原核表达载体的构建

取测序结果正确的pGEM-T-p30和表达载体pGEX-6p-1分别用EcoR I和Xho I双酶切后，将p30和原核表达载体pGEX-6p-1连接后，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单个菌落接种液体培养基，SDS碱裂解法提取质粒，再分别用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，质粒pGEX-6p-1-p³⁰酶切产物出现一条大小约为627bp的目的条带和一条大小约为4.9Kb的条带，与预计结果相符。

四、重组蛋白的诱导表达

取测序结果正确的质粒pGEX-6p-1-p30转化进大肠杆菌BL21（DE3），同时将未插入外源片段的质粒pGEX-6p-1转化进大肠杆菌BL21（DE3）所得的空载体菌分别在Amp+ 2×YT 液体培养基中，加入IPTG（其终浓度达到1mM），37℃诱导表达5h；然后分别收集细菌沉淀，超声破碎后分别收集裂解上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。

图2中，M为非预染蛋白标准；1为重组菌裂解上清；2为重组菌裂解沉淀；3为非重组菌诱导产物。

从图2可见：质粒pGEX-6p-1-p30转化进大肠杆菌BL21（DE3）后取得的重组融合蛋白GST- p30在诱导表达后，其裂解上清和沉淀中均出现了一条分子量约为49KD的蛋白条带，而未插入外源片段重组菌中仅出现了一条分子量约为27KD的GST标签蛋白条带。

五、单克隆抗体的研制

以上述重组融合蛋白GST-p30作为免疫原，免疫6周龄Balb/c小白鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞经过两次融合，共获得五株能够分泌与GST-p30反应但不与GST-Tag反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经检测发现，其中两株分泌的单克隆抗体均能与感染了REV HA1101或SNV株感染的CEF裂解产物中的p30反应，荧光信号同样特征性地集中在细胞浆内（见图3所示），分别命名为REVp³⁰-2C8和REVp³⁰-5G6。

两株单克隆抗体的保藏信息分别为：

REVp³⁰-2C8的保藏号为：CGMCC No.9218，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2014年5月7日。

REVp³⁰-5G6的保藏号为：CGMCC No.9217，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2014年5月7日。

六、捕捉抗体和酶标抗体组合的确定

如以下针对REV-p³⁰的双夹心配对组合表所示，在所有不同捕捉抗体与酶标抗体的配对组合中，以REVp³⁰-2C8为捕捉抗体，REVp³⁰-5G6^E为酶标抗体的组合，在所有不同捕捉抗体浓度梯度下，OD₄₅₀均为最高，故确定以REVp³⁰-2C8为捕捉抗体，REVp³⁰-5G6^E为酶标抗体建立针对REV群特异性抗原p30的双夹心ELISA。

 

七、检测限的探索

按照上述方法，制作REV HA1101或SNV的病毒滴度与TCID₅₀的吸收值的变化关系图，如图4可见：本发明建立的双夹心ELISA方法最低可以检测到10^1.82个TCID₅₀的REV HA1101或SNV所携带的p30抗原。

八、试剂盒检测应用

以建立的双夹心ELISA方法分别对REV HA1101、SNV、GST-p30、正常CEF细胞、ALV-J、CAV、MDV或HVT感染的CEF细胞裂解产物进行反应，取得各TCID₅₀的吸收值的变化关系图，如图5所示。

结果显示：按照上述确定的阳性标准，本发明建立的双夹心ELISA方法只与REV HA1101、SNV和GST-p30有阳性反应，与其余病原或正常CEF细胞无交叉反应性。