一种 DDR2 小分子抑制剂抗肺纤维化应用

摘要

本发明公开了一种DDR2小分子抑制剂抗肺纤维化应用，属于生物医药技术领域。在DDR2基因缺失小鼠模型中，在同时给予博莱霉素和DDR2小分子抑制剂D856的情况下，D856可以显著改善肺纤维化状况，即使是在恢复表达DDR2的纯合子小鼠中，抑制剂也发挥减轻肺纤维化的作用。在细胞水平，抑制剂D856加入，下调了α-SMA的含量。在不同天数开始给予抑制剂的实验中，发现即使从第14天开始给予抑制剂D856，肺纤维化仍然可以得到显著的缓解，DDR2的小干扰RNA也验证得到相同的结果。因此，本发明的实验结果充分支持DDR2小分子抑制剂D856在制备抗肺纤维化药物和/或保健品的制备中应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及肺纤维化防治领域，具体涉及DDR2小分子抑制剂在制备抗肺纤维化药物中的应用。

背景技术

各型肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)皆以成纤维细胞(fibroblast,Fb)增殖及大量细胞外基质(ECM)聚集为特征。多种因素均可引起肺纤维化，如职业性粉尘(SiO₂等)、放射性损伤及某些药物(博莱霉素)等，此外还有一类不明病因的肺纤维化——特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)。虽然起因不同，但纤维化的发展与结局基本相似，即由下呼吸道炎症细胞浸润起始，逐步引起肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，并伴有肌成纤维细胞(myofibroblast,MF)和Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖的细胞因子等的释放，致细胞外基质蛋白和胶原沉积，最终引起肺结构的损害。肺纤维化晚期多引起心、肺功能衰竭而死亡，对人类危害极大。目前肺纤维化发生的确切机制尚不清楚，早期防治亦未获得突破性进展。

DDR2分子属于酪氨酸蛋白激酶受体家族成员，DDR2小分子抑制剂D856由中国科学院广州生物医药与健康研究院丁克教授课题组研发，DDR2小分子抑制剂D856的结构如下所示：

DDR2介导细胞与细胞外基质之间的信号转导，广泛参与细胞增殖分化，个体发育及生殖等生理病理过程。DDR2通过调控p38和AKT的活性参与肺纤维化过程。目前尚无DDR2小分子抑制剂在肺纤维化中的应用报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DDR2小分子抑制剂抗肺纤维化应用，该DDR2小分子抑制剂在制备抗肺纤维化药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

DDR2小分子抑制剂在制备抗肺纤维化药物和/或保健品中的应用，所述DDR2小分子抑制剂的结构如下：

所述的药物和/或保健品为抑制α-SMA蛋白表达的药物。

所述的药物和/或保健品为抑制Fibronectin蛋白表达的药物。

所述的药物和/或保健品为抑制TGF-β1诱导的纤维化相关分子的蛋白表达的药物。

所述的药物和/或保健品为抑制博来霉素诱导的肺组织血管生成的药物。

所述的药物和/或保健品为抑制肺组织中促血管生成因子Vegf-a、Ang-1或Fgf-2表达的药物。

所述DDR2小分子抑制剂的动物给药量为10～50mg/kg。

所述DDR2小分子抑制剂的细胞给药量为10μM～50μM。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了DDR2小分子抑制剂在制备抗肺纤维化药物和/或保健品中的应用，DDR2参与整个肺纤维化进程，DDR2的表达先下降后上升，磷酸化水平逐渐升高，p38、AKT的磷酸化水平在野生型的小鼠中也逐渐升高。在DDR2基因缺失小鼠模型中，在同时给予博莱霉素和DDR2小分子抑制剂D856的情况下，D856可以显著改善肺纤维化状况，即使是在恢复表达DDR2的纯合子小鼠中，抑制剂也发挥减轻肺纤维化的作用。在细胞水平，抑制剂D856加入，下调了α-SMA的含量。在不同天数开始给予抑制剂的实验中，发现即使从第14天开始给予抑制剂D856，肺纤维化仍然可以得到显著的缓解，DDR2的小干扰RNA也验证得到相同的结果。本发明的实验结果充分支持DDR2小分子抑制剂D856在制备抗肺纤维化药物和/或保健品的制备中应用。且DDR2小分子抑制剂D856的细胞给药量至少为10μM；DDR2小分子抑制剂D856的动物给药量为10～50mg/kg。

附图说明

图1为不同浓度D856对DDR2酪氨酸磷酸化活化的影响结果图；

图2-1为预防性给予D856改善野生鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(HE和组化染色)结果图；

图2-2为预防性给予D856改善野生鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(羟脯氨酸含量)结果图；

图2-3为预防性给予D856改善过表达DDR2的slie鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(Masson染色)结果图；

图2-4为预防性给予D856改善过表达DDR2的slie鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(羟脯氨酸含量)结果图；

图2-5为D856抑制胶原诱导的纤维化相关分子的蛋白如α-SMA、Fibronectin的蛋白表达结果图；

图2-6为D856抑制TGF-β1诱导的纤维化相关分子的蛋白表达结果图；

图2-7为D856抑制博来霉素诱导的肺组织的血管生成结果图；

图2-8为D856抑制肺组织中主要的促血管生成因子Vegf-a、Ang-1、Fgf-2的表达结果图；

图3-1为早中期给予D856改善野生鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(Masson和组化染色)结果图；

图3-2为早中期给予D856改善野生鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(羟脯氨酸含量)

图3-3为早中期给予D856抑制纤维化相关分子如α-SMA、Fibronectin的蛋白表达结果图；

图4-1为晚期给予D856的实验设计图示；

图4-2为晚期给予D856改善野生鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(HE染色)结果图；

图4-3为晚期给予D856改善野生鼠中博来霉素诱导的肺纤维化(羟脯氨酸含量)结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

用博莱霉素制作的肺纤维化模型，其病理组织学和生理学改变与人类肺纤维化近似，因此成为肺纤维化造模的常用药物。博莱霉素经鼻腔滴注给药可诱导C57小鼠发生肺纤维化，对照为PBS经鼻腔滴注给药的C57小鼠。

1、DDR2小分子抑制剂D856鉴定

1.1DDR2小分子抑制剂D856由中国科学院广州生物医药与健康研究院丁克教授课题组研发，D856的化学结构式如下：

1.2为了验证抑制剂D856的靶向性，本发明借助KINOMEscan公司的激酶筛选平台，对体外386种蛋白激酶平行测试来验证其选择性。结果如表1所示：

表1

其中，Ctrl％代表化合物与蛋白结合的强弱，S-score评价化合物选择性的强弱，S-score值越小说明选择性越强。0％代表着100％的结合，S(10)表示抑制率达90％的条件下，化合物对激酶的选择性参数S-Score。

1.3将人胚肾成纤维细胞293T铺种于六孔板上，待细胞密度达到70％时，撤去上清，加入含Ad-DDR2的D-培养液(1x10⁶pfu/mL)，对照孔加不含Ad-DDR2的D-培养液。4h感染完成后换回正常含血清的培养液。24h后按照图1所示，加入10μg/mL的胶原和不同稀释浓度的D856。共同处理2h后，弃去上清液，PBS洗两次后，加100μL的1x loading buffer，细胞刮刮下细胞后移入1.5mL EP管中，100℃加热10min，12000rpm离心1min。将得到的样品进行Western Blot实验，分离胶浓度为10％。4G10(05-321,Millipore)抗体检测DDR2酪氨酸磷酸化，DDR2(BAF2538,R&D)检测DDR2总蛋白的表达。结果如图1所示，D856抑制DDR2的磷酸化存在浓度依耐性，随着D856浓度的递增，DDR2的活化明显降低，10μM浓度已达到半数以上抑制。

2、在同时给予博莱霉素和抑制剂D856的情况下，D856可减轻肺纤维化

小鼠博来霉素诱导的肺纤维化模型的建立：取6-8周成年小鼠，腹腔注射1％戊巴比妥钠100uL左右，将其放于笼中，让其自然晕倒，左手揪住小鼠颈部皮肤，使其仰卧在手心上，小指夹住尾巴固定住小鼠，采用加样枪通过鼻腔给药的方式给予博来霉素(5mg/k体重)或者PBS，给药的过程中不时观察小鼠的呼吸频率，以免小鼠窒息死亡导致实验失败。将它们置于实验室条件下4周(即通气良好的20℃恒温环境中，每12小时光照与黑暗交替，水粮足量，自由取用)，4周后取小鼠肺脏组织，石蜡包埋固定。

2.1取6-8周成年C57小鼠20只，采用随机分组的办法，将小鼠随机分为四组，按照如上所述的方法建模，在开始建模后第一天开始灌胃10mg/kg、25mg/kg不同剂量的D856小分子抑制剂，PBS组则灌胃ddH₂O作为对照。至第28天停止灌胃。处死小鼠后，收集小鼠肺组织，用PBS冲洗2次，去除表面残余的血液。用数码相机留下全肺的照片，右肺行10％中性甲醛固定，用以后续的形态学染色，如HE染色、α-SMA组化染色等；左肺则直接放置液氮里，用于后续的蛋白检测和羟脯氨酸含量的测定。

结果如图2-1所示，即使在低浓度10mg/kg D856的处理，肺组织损伤部位已经明显降低(左/中)，肌成纤维细胞的阳性细胞数也显著减少(右)。肌成纤维细胞为参与肺纤维化的重要效应细胞，它的减少提示，D856的处理可以显著缓解肺纤维化的形成。

2.2肺纤维化晚期，间质中堆积大量的胶原。胶原含量的多少大致代表了肺纤维化的水平。而羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，因此羟脯氨酸的含量能反映肺纤维化过程中胶原堆积的情况，进而反应肺纤维化程度。

羟脯氨酸含量的测定：采用南京建成的羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒(碱水解法)可以准确测定肺组织中羟脯氨酸的含量，步骤如下：准确称取肺组织的重量；调PH至中性，定容至10mL,加活性碳离心；取上清1mL加R1静置10分钟，加R2静置5分钟，加R3，60℃水浴15分钟；3500转/分离心10分钟，取上清550nm波长测定吸光度值。

结果如图2-2所示，由图可见，博来霉素诱导的肺纤维化组织内羟脯氨酸含量较PBS对照组明显升高，而D856处理后，羟脯氨酸的含量降至几乎与对照组持平，且两组之间有显著性差异，说明DDR2小分子抑制剂D856显著缓解了博来霉素诱导的肺纤维化状况。

2.3从美国Jackson Laboratory购入的DDR2自发缺失的纯合型小鼠slie是研究DDR2在肺纤维化作用的重要小鼠模型，研究结果表明，DDR2缺失后，博来霉素诱导的肺纤维化程度明显降低，那么在肺组织中回复DDR2的表达后，D856的作用如图2-3所示，Masson染色结果表明，博来霉素诱导后，灌胃D856可以显著降低因过表达DDR2导致的肺纤维化的加重。

2.4与图2-3结果类似的是：羟脯氨酸含量结果表明，如图2-4所示，博来霉素诱导后，灌胃D856可以显著降低因过表达DDR2导致的肺纤维化的加重，与对照组相比，二者有显著统计学差异。

2.5I型胶原为受体DDR2的配体，对于活化DDR2以及下游信号通路的传递起着至关重要的作用。从野生型小鼠肺组织中原代分离得到肺成纤维细胞，将其铺于6孔板上，细胞长至60％后，加入含Ad-DDR2的DMEM无血清培养基培养4h，4h感染完成后换回正常含血清的培养液。24h后，6孔全部加入10μg/ml的胶原，同时按图2-5所示加入10μm、50μm的D856(DMSO溶解)。共同处理24h后，弃去上清液，PBS洗两次后，加100μL的1x loadingbuffer，细胞刮刮下细胞后移入1.5mL EP管中，100℃加热10min，12000rpm离心1min。将得到的样品进行Western Blot实验。

结果如图2-5所示，由图可见，D856显著抑制胶原诱导的α-SMA和fibronectin的表达。

2.6TGF-β1被公认为纤维化形成与发展的启动枢纽,是关键性细胞因子，前期的实验结果表明，DDR2参与了TGF-β1诱导的非经典通路p38/AKT的活化。从野生型小鼠肺组织中原代分离得到肺成纤维细胞，将其铺于6cm皿上，细胞长至60％后，加入含Ad-DDR2的DMEM无血清培养基培养4h，4h感染完成后换回正常含血清的培养液。24h后，按图2-6孔所示加入10ng/mL的胶原以及10μm、50μm的D856(DMSO溶解)。共同处理24h后，弃去上清液，PBS洗两次后，加100μL的1x loading buffer，细胞刮刮下细胞后移入1.5mLEP管中，100℃加热10min，12000rpm离心1min。将得到的样品进行Western Blot实验。

结果如图2-6所示，由图可见，D856显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA和fibronectin的表达。

2.7病理性的血管生成是肺纤维化等疾病的关键环节，这种持续、无控性、无规则的新血管生成推动了疾病的发展。CD31抗原广泛表达于血管的各种细胞上，免疫荧光检测指标可作为机体血管生成的标志。

经灌胃D856处理的肺组织切片进行抗CD31抗体免疫荧光染色，具体步骤如下：切片二甲苯脱蜡入梯度酒精，PBS漂洗5min，0.5％Triton穿孔15min；PBS漂洗2次，每次5min；1％BSA封闭30min；加入PBS稀释的一抗(1:200)，放置于湿盒4℃过夜；PBS漂洗2次，每次5min；加入PBS稀释的二抗，于室温杂交1h；PBS漂洗2次，每次5min；5ug/mL DAPI染色10min；抗淬灭封片剂封片；Nikon共聚焦显微镜采集。

结果如图2-7所示，由图可见，博来霉素诱导的模型组可见新生小血管增多，排列紊乱，形态不规则；而D856处理组可见新生小血管明显减少，可见D856显著抑制博来霉素诱导的新生血管生成。

2.8CD31染色作为血管生成的指标外，实时定量PCR测定组织中血管生成因子Vegf-a、Ang-1、Fgf-2等的表达，也可以间接反映肺纤维化过程中的血管生成状况。

取已冻存的肺组织，采用Trizol法抽提出RNA，Nanodrop测定RNA浓度和纯度，TAKARA反转录试剂盒(DRR037S)将RNA反转录成cDNA，最后实时定量PCR反应测定Vegf-a、Ang-1、Fgf-2的表达变化。

结果如图2-8所示，由图可见，博来霉素诱导的模型组较PBS对照组Vegf-a、Ang-1、Fgf-2的表达明显上调；而D856处理组相较博来霉素诱导组，Vegf-a、Ang-1、Fgf-2的表达明显下调，间接的反映了D856显著抑制博来霉素诱导的新生血管生成。

3、在给予博莱霉素刺激后的不同天数开始给予抑制剂D856，仍可显著改善肺纤维化

3.1取6-8周成年C57小鼠20只，全部给予滴鼻给药博来霉素后，采用随机分组的办法，将小鼠随机分为四组：对照组(只灌胃H₂O)、D856/1(从模型第1天开始灌胃D856直至第28天)、D856/7(从模型第7天开始灌胃D856直至第28天)和D856/14(从模型第14天开始灌胃D856直至第28天)。按照如上所述，从不同时间点开始灌胃10mg/kg剂量的D856小分子抑制剂至第28天停止灌胃。处死小鼠后，收集小鼠肺组织，用PBS冲洗2次，去除表面残余的血液。右肺行10％中性甲醛固定，用于后续的形态学染色，如HE染色、α-SMA组化染色等；左肺则直接放置液氮里，用于后续的蛋白检测和羟脯氨酸含量的测定。

结果如图3-1所示，与对照组相比，第一天，第7天，即使第14天，给予10mg/kg D856的处理，肺纤维化状况明显改善(上)，肌成纤维细胞的阳性细胞数也显著减少(下)，提示即使在纤维化早中期给予D856的处理，仍然可以显著缓解肺纤维化的形成。

3.2羟脯氨酸的含量能反映肺纤维化过程中胶原堆积的情况，进而反应肺纤维化程度。结果如图3-2所示，由图可见，与对照组相比，第一天，第7天，即使第14天，给予10mg/kg D856的处理，组织内羟脯氨酸含量，较对照组明显降低，且对照组与D856/14两组之间有显著性差异，说明早中期给予DDR2小分子抑制剂D856可显著缓解博来霉素诱导的肺纤维化状况。

3.3肌成纤维细胞是肺纤维化过程中的重要的效应细胞，α-SMA的表达间接反应肺纤维化状况。将肺组织用剪刀煎碎，加入3倍体积的RIPA裂解液，用玻璃匀浆器充分匀浆(冰上进行)，4℃12000rpm，离心20分钟，取上清，蛋白定量后加5x Loading Buffer 100℃加热10min，12000rpm离心1min。将得到的样品进行Western Blot实验。结果如图3-3所示，由图可见，与对照组相比，第一天，第7天，即使第14天，给予10mg/kg D856的处理，组织中α-SMA和fibronectin的表达较对照组明显降低，间接说明早中期给予DDR2小分子抑制剂D856可显著缓解博来霉素诱导的肺纤维化状况。

4.DDR2小分子抑制剂D856可限制肺纤维化晚期进程

4.1如图4-1所描述实验设计：取成年C57小鼠15只，滴鼻给药博来霉素(5mg/kg)21天后，随机处死其中5只小鼠，剩下10只小鼠中，5只小鼠开始给予D85610mg/kg体重剂量，另5只小鼠灌胃ddH₂O，7天后收集肺组织，行切片染色及羟脯氨酸含量测定，观察D856是否可以限制肺纤维化晚期的进程。

4.2如图4-2所示，HE染色结果表明，与21天小鼠组相比，灌胃给予D8567天，可以部分的局限肺纤维化晚期的进程。

4.3如图4-3所示，羟脯氨酸含量测定表明灌胃给予D8567天，羟脯氨酸含量与不灌胃D856相比，显著下降，进一步证明了D856可以部分局限肺纤维化晚期的进程。