一种具有抗癌活性的化合物及抗癌组合物

摘要

本发明公开了一种具有抗癌活性的化合物及抗癌组合物。所述化合物为一氧化氮(NO)供体化合物，具有抗癌活性，能应用于制备抗癌药物。所述抗癌组合物为本发明提供的化合物其作为辅药与化疗药物组合，诱导肿瘤细胞凋亡，增强其抗肿瘤活性的应用。

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物领域，更具体地，涉及一种具有抗癌活性的化合 物及抗癌组合物。

背景技术

目前多数常见实体瘤如肺癌、肝癌、结肠癌及胰腺癌等还缺乏有效药 物，不少抗癌药在临床应用过程中产生耐药性。现有的抗癌药物主要是干 扰核酸生物合成、直接影响DNA结构与功能、干扰转录过程和RNA合成、 或者干扰蛋白质合成与功能。

但现有药物在临床实用中存在许多不尽如人意的地方，仅有5％的恶性 肿瘤有可能通过化学治疗得到治愈，而且抗癌药物普遍存在选择性差的缺 点，所以就需要提高药物浓度以达到药效，因此具有明显的细胞毒性，对 正常组织也有较为严重毒副作用。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种具有抗癌活 性的化合物及抗癌组合物，其目的在于通过合成一类生物可降解且胶束稳 定性良好的NO供体化合物，提高抗癌药物疗效，由此解决目前抗癌要素毒 副作用明显技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种具有抗癌活性 的化合物，所述化合物具有式(I)的结构：

其中R₀为一氧化氮供体。

优选地，所述化合物，其一氧化氮供体为通过-CO-(CH2)_3～6-、-(CH2)_2～12- 连接的或直接连接的含氮基团。

优选地，所述化合物，其含氮基团为

按照本发明的另一方面，提供了本发明提供的化合物应用于制备抗癌 药物。

优选地，所述化合物应用于制备抗癌纳米乳液，其中所述化合物浓度 为2mg/ml至8mg/ml。

按照本发明的另一方面，提供了一种抗癌组合物，含有所述化合物以 及抗癌药物或抗癌药物前药，所述抗癌药物或抗癌药物前药和所述化合物 的质量比例在1:1至1:4之间。

优选地，所述抗癌组合物，其抗癌药物为阿霉素，所述抗癌药物前药 为阿霉素前药或紫杉醇前药。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够 取得下列有益效果：

本发明通过利用产生NO活性的含氮结构对维生素E聚乙二醇琥珀酸酯 (TPGS)进行修饰，设计了一种NO供体药物。TPGS是一种多功能辅料，借 助其两亲性的结构，可以形成稳定的胶束结构，提升了NO供体在体内的稳 定性。在体内释放高浓度的NO，诱导肿瘤细胞凋亡，阻止肿瘤细胞的扩散 和转移从而起到抗癌作用，避免严重的毒副作用。除此之外，此化合物更 是一个很好的辅助药物，当与化疗药物联合使用时，释放出的NO通过多种 信号通路提高了肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度，有效地增强了化疗药物 对肿瘤的抑制效果。同时，此辅助药物还产生了调节血管舒张和血液循环 的效果，延长了药物在体内的半衰期，使化疗药物在低剂量时更有效的抑 制肿瘤，从而减轻高浓度化疗药物所产生的毒副作用。

附图说明

图1是实施例1中TPGS、中间化合物(TBr)和TNO₃化合物的核磁共 振氢谱；

图2是实施例7中TNO₃化合物胶束在不同pH值的PBS中的水合粒径变 化曲线；

图3是实施例7中TNO₃化合物在不含或含10mM GSH的PBS中的NO累 加释放曲线；

图4是实施例7中TNO₃化合物在HepG2肿瘤细胞中的NO累加释放曲线；

图5是实施例7中通过激光共聚焦检测NO在HepG2细胞中的释放情况；

图6是实施例7中通过流式细胞仪检测NO在HepG2细胞中的释放；

图7是实施例7中GTN和TNO₃的24、48、72小时细胞毒性实验结果；

图8是实施例8中阿霉素和阿霉素&TNO₃的细胞摄取实验中的激光共聚 焦显微镜观察结果；

图9是实施例8中阿霉素和阿霉素&TNO₃的细胞摄取实验中的流式细胞 仪结果及其平均荧光强度；

图10是实施例8中阿霉素和阿霉素&TNO₃组合药物的24、48、72小时 细胞毒性实验结果；

图11是实施例8中对空白对照组(图11a)、GTN(图11b)、TNO₃(图 11c)、阿霉素(图11d)和阿霉素&TNO₃(图11e)组合药物的细胞凋亡检 测；

图12是实施例8中SD大鼠尾静脉注射阿霉素或阿霉素&TNO₃后的时间- 药物浓度曲线；

图13是实施例8中H22荷瘤小鼠尾静脉注射阿霉素或阿霉素&TNO₃后的 肿瘤组织内阿霉素浓度变化；

图14是实施例8中H22荷瘤小鼠尾静脉注射生理盐水、GTN、TPGS、 TNO₃、阿霉素和阿霉素&TNO₃后肿瘤体积的变化(图14A)、相对体重的变化 (图14B)、肿瘤重量(图14C)和肿瘤瘤体图像(图14D)；

图15是实施例8中H22荷瘤KM小鼠尾静脉注射生理盐水(图15A)、 GTN(图15B)、TPGS(图15C)、TNO₃(图15D)、阿霉素(图15E)和阿 霉素&TNO₃(图15F)后肿瘤组织的H&E染色切片；

图16是实施例9中H22荷瘤KM小鼠尾静脉注射生理盐水、阿霉素、 TPGS-C＝N-阿霉素、TPGS-C＝N-阿霉素&TPGS-NNO(1:1)、TPGS-C＝N-阿霉 素&TPGS-NNO(1:2)和TPGS-C＝N-阿霉素&TPGS-NNO(1:4)后肿瘤体积的 变化和相对体重的变化；

图17是实施例10中为S180荷瘤KM小鼠尾静脉注射生理盐水、Taxol、 TPGS-S-S-PTX、TPGS-ONO、TPGS-S-S-PTX&TPGS-ONO(1:1)、TPGS-S-S-PTX& TPGS-ONO(1:2)和TPGS-S-S-PTX&TPGS-ONO(1:4)后肿瘤体积的变化(图 17A)和相对体重的变化(图17B)；

图18是实施例11中为H22荷瘤KM小鼠尾静脉注射生理盐水、GTN、 TPGS、TPGS-[N(O)NO]、阿霉素和阿霉素&TPGS-[N(O)NO]后肿瘤体积的变 化(图18A)、相对体重的变化(图18B)、肿瘤重量(图18C)和肿瘤瘤 体图像(图18D)；

图19是实施例12中阿霉素和阿霉素&TPGS-SNO组合药物的24(图 19a)、48(图19b)和72(图19c)小时细胞毒性实验结果；

图20是实施例12中阿霉素和阿霉素&TPGS-SNO的细胞摄取实验中的 激光共聚焦显微镜观察结果；

图21是实施例3中TPGS和TPGS-NNO化合物的红外光谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图 及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的 本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可 以相互组合。

本发明提供的具有抗癌活性的化合物，具有式(I)的结构：

其中R₀为一氧化氮供体。所述一氧化氮供体为通过-CO-(CH2)_3～6-、-(CH2)_2～12- 连接或直接连接含氮基团。-CO-(CH2)_3～6-、-(CH2)_2～12-链使得所述化合物具 有良好的NO释放能力和成胶束性能。

所述含氮基团优选

硝酸酯类NO供体型TPGS衍生物可用式(II)表示：

其中，R₁为-CO-(CH2)_3～6-或-(CH2)_2～12-，即R₀为通过-CO-(CH2)_3～6-、-(CH2)_2～12- 连接

其合成路线如下：

亚硝酸类NO供体型TPGS衍生物，其通过如下步骤合成；

N-亚硝胺类NO供体型TPGS衍生物，其通过如下步骤合成：

N-亚硝胺类NO供体型TPGS衍生物，其通过如下步骤合成：

二醇二氮烯类NO供体型TPGS衍生物，其通过如下步骤合成：

本发明提供的化合物可应用于抗癌药物的制备。优选的所述抗癌药物 为纳米乳液，其中本发明提供的化合物浓度在2mg/ml至8mg/ml之间具有 良好的抗癌活性和安全性。

本发明提供的抗癌组合物，含有本发明提供的具有抗癌活性的化合物， 及现有的抗癌药物或抗癌药物前药。抗癌药物可以是已知的各种抗癌药物， 包括但不限于紫杉醇(PTX)、多西紫杉醇、多柔比星(DOX)、表柔比星、 长春碱、长春新碱、高三尖杉酯碱及喜树碱等。抗癌药物前药可以是具有 各种化学敏感键的化疗药物前药，包括但不限于紫杉醇(PTX)、多西紫杉 醇、多柔比星(DOX)、表柔比星、长春碱、长春新碱、高三尖杉酯碱及喜 树碱前药中的一种。所述抗癌药物或抗癌药物前药和所述化合物的质量比 例在1:1至1:4之间。

优选地，所述抗癌药物为阿霉素，所述抗癌药物前药为阿霉素前药或 紫杉醇前药。

以下为实施例：

表1实施例1至6中化合物结构

实施例1

一种具有抗癌活性的化合物，具有式(I)的结构，其中R₀为 为一氧化氮供体，其结构式见表1式(1)。

其制备方法如下：准确称取6.05g(4mmol),溶于20mL二氯甲烷中， 加入4-溴丁酰氯1.11g(6mmol)，吡啶0.47g(6mmol)，在冰浴中搅拌 24h，浓缩反应液，滴加在冰乙醚中析出沉淀，将沉淀用50％乙醇水溶液透 析24h，然后再用纯水透析24h，将透析产物于冷冻干燥机中冻干，得中 间产物TPGS-BrC(TBr)。

准确称取6.76g中间产物(4mmol),溶解于10mL乙腈中，加入硝酸银 1.36g(8mmol)，避光反应12h，过滤，浓缩，在乙醚中沉淀，沉淀产物于 乙腈溶液中透析24h，除去未反应的硝酸银，然后再用纯水透析24h，将透 析产物于冷冻干燥机中冻干，得到目标化合物(TPGS-NO₃，TNO₃)。

实施例2

一种具有抗癌活性的化合物，具有式(I)的结构，其中R₀为为一氧化氮供体，其结构式见表1式(2)。

其制备方法如下：准确称取TPGS 6.05g(4mmol),溶于15mL丙酮中， 加入1,2-二溴乙烷1.13g(6mmol)，三乙胺0.61g(6mmol)，室温24h，浓 缩反应液，滴加在冰乙醚中析出沉淀，将沉淀用50％乙醇水溶液透析24h， 然后再用纯水透析24h，将透析产物于冷冻干燥机中冻干，得中间产物。

准确称取6.60g中间产物(4mmol),溶解于10mL四氢呋喃中，加入硝酸 银1.36g(8mmol)，避光反应24h，过滤，浓缩，在乙醚中沉淀，沉淀产 物于乙腈溶液中透析24h，除去未反应的硝酸银，然后再用纯水透析24h， 将透析产物于冷冻干燥机中冻干，得到目标化合物TPGS-2-NO₃。

实施例3

一种具有抗癌活性的化合物，具有式(I)的结构，其中R₀为为一氧化氮供体，其结构式见表1式(3)。

其制备方法如下：将0.5g TPGS加在100mL圆底烧瓶里，加入10mL三 氯甲烷和58μL亚硝酸叔丁酯，并做避光处理；在无水环境中，室温搅拌 12h；所得产物用分子量1000的透析袋在无水乙醇溶剂中透析24-48h，透 析完毕后挥干乙醇即得亚硝酸类NO供体型TPGS衍生物(TPGS-ONO)。

实施例4

一种具有抗癌活性的化合物，具有式(I)的结构，其中R₀为一氧化氮供体，其结构式见表1式(4)。

其制备方法如下：

(1)TPGS的活化：用5-10mL二氯甲烷(DCM)溶解0.5g TPGS，加入 134mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和75mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在 无水环境中，室温下搅拌反应24h。

(2)连接N-甲基-N-亚硝基甘氨酸：在100mL的圆底烧瓶中加入58mg 的N-甲基-N-亚硝基甘氨酸，用5-15mL DCM溶解；将步骤(1)得到的产物 过滤，滤液加至N-甲基-N-亚硝基甘氨酸溶液中；在无水环境中，室温下搅 拌48h；所得产物用分子量为1000的透析袋在无水乙醇中透析24-48h，透 析完毕后挥干乙醇即得N-亚硝胺类NO供体型TPGS衍生物(TPGS-NNO)。

实施例5

一种具有抗癌活性的化合物，具有式(I)的结构，其中R₀为 为一氧化氮供体，其结构式见表1式(5)。

其制备方法如下：

(1)TPGS羟基的活化：称取0.5g TPGS,130mg对硝基氯甲酸苯酯， 溶解于10mL无水二氯甲烷中，再加入105μL吡啶，室温搅拌3h，滴加 至10倍体积冰乙醚中，5000rpm离心10min，洗涤沉淀、离心。沉淀真空 干燥1h，得活化后的TPGS。

(2)连接二乙烯三胺(DETA)：将步骤(1)中活化后的样品溶解于 无水二氯甲烷中，并加入67mg DETA，氮气保护下室温搅拌24h，反应后 溶液滴加至10倍体积的冰乙醚中析出沉淀，离心得到沉淀并且干燥，干 燥后沉淀用分子量为1000的透析袋在无水乙醇中透析24-48h，透析完毕 后挥干乙醇即得TPGS-DETA。

(3)TPGS-DETA和5.4mM甲醇钠溶解于2mL甲醇水混合溶剂中，转移 至帕尔加氢容器中并在5-10s内快速加入氩气，随后持续补充氩气10min 以除去溶液中的氧气，最后通入NO气体并保持10个大气压强，3天后反应 完成，进行通氩气排气操作后可得到二醇二氮烯类NO供体型TPGS衍生物 (TPGS-[N(O)NO])。

实施例6

一种具有抗癌活性的化合物，具有式(I)的结构，其中R₀为 为一氧化氮供体，其结构式见表1式(6)。

其制备方法如下：将0.5gTPGS、100.5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐(EDC)和75mg NHS加入50mL的圆底烧瓶里，加入5-10mL 的无水二氯甲烷溶解，并加入200mg亚硝基谷胱甘肽，并做避光处理，室 温搅拌24h；所得产物用分子量为1000的透析袋在无水乙醇中透析24-48h， 透析完毕后挥干乙醇即得亚硝基硫醇类NO供体型TPGS衍生物(TPGS-SNO)

实施例7

实施例1中制备化合物的表征和抗癌效果测定

(一)、胶束稳定性研究

1、溶液的制备

将表1中的TNO₃化合物溶解在乙醇中，缓慢滴至pH 7.4的PBS中， 边滴边搅拌，过夜搅拌挥干其中的乙醇。

2、评价指标

(1)TNO₃化合物胶束在不同环境下的稳定性

按照上述1中所述溶液的制备方法，并调节样品溶解pH值，观察样品 在不同pH值下的粒径变化。

参见图2，在各个pH的溶解中，TNO₃化合物胶束的粒径都没有明显的 改变，说明化合物TNO₃的胶束具有很好的稳定性。

(二)、TNO₃化合物体外NO释放情况检测

1、TNO₃化合物在PBS中的NO释放情况检测

将按上述方法制备好的TNO₃化合物胶束分别配成两组化合物浓度为 1mg/mL的溶液，一组为pH 7.4的PBS溶液，第二组为pH 7.4的PBS溶液， 且加入10mM的谷胱甘肽(GSH)，在37℃恒温条件下，分别在0.5h、1h、 2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、144h时间点测定溶液中NO的含 量。

如图3所示，在孵育144h后，化合物TNO₃在PBS中只释放了 11.13±0.40％的NO，而在加入了还原性谷胱甘肽之后，TNO₃化合物大量的 释放出将近92.68±5.11％的NO。说明在有还原性物质的存在时，可以间接 促进TNO₃化合物中NO的大量释放。

2、TNO₃化合物在HepG2细胞中的NO释放情况检测

将细胞按一定数量接种于96孔板中，待孵育24h后，每个孔中的培养 基被含有TNO₃化合物的DMEM培养基置换，随后分别在1h、2h、4h、8h、12h、 24h、48h、72h、96h时取出50微升的培养基。在不同时间点取出的培养基 与50微升Griess试剂反应并在540nm处检测紫外吸收。

如图4所示，化合物TNO₃在与细胞孵育96h后，释放出87.13±4.27％ 的NO，这远远高于化合物TNO₃单独在培养基中释放的NO(19.10±2.53％) 和细胞本身生命活动中释放的NO(0.56±0.96％)，说明细胞内的微环境也 有促进化合物TNO₃释放NO的作用。

3、TNO₃化合物在HepG2细胞中的NO释放情况检测

为了进一步考察TNO₃化合物的NO释放能力，我们采用硝酸甘油(GTN) 作为对照样品，采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对样品在细胞内的NO 释放情况进行监测。

(1)激光共聚焦显微镜

取洁净的φ＝13mm的圆玻片置于24孔细胞培养板中，将对数生长期的 细胞HepG2胰酶消化后以1×10⁵个/孔的细胞密度接种于24孔板中，置 37℃、5％CO₂细胞培养中过夜，当细胞生长密度长至70～80％，弃去旧培养 基，加入5μM DAF-FM DA处理40min，然后再加入500μL样品培养基溶液 (分为TNO3化合物组、GTN组及空白组)，孵育4h后，用200μL冰PBS 洗两次，加入4％多聚甲醛固定15min，再用200μL冰PBS洗两次，加入 Hoechst33258染核8min，再用200μL冰PBS洗两次，将1mL注射器的针 尖折弯，用其将盖玻片捞起，配合镊子将其取出，注意细胞面，小心倒扣 在滴有甘油(用10μL的枪头沾一小滴)的载玻片上。制备好的爬片上机 显像。

如图5所示，绿色荧光代表的是释放出的NO与荧光探针DAF-FM DA反 应后产生的荧光，说明虽然都是硝酸酯类的化合物，TNO₃化合物与GTN相比 可以更快速大量的产生NO。

(2)流式细胞仪

将对数生长期细胞HepG2用胰酶消化后接种10⁵个/mL于6孔板中，置 37℃、5％CO₂细胞培养中过夜，当细胞生长密度长至90％，弃去旧培养基，用 PBS洗2次，加入5μM DAF-FM DA处理40min，再加入含样品的培养基溶 液(分为TNO₃化合物和GTN)，另有不含药物的空白培养基作为对照。孵育 4h后，用冰PBS洗后胰酶消化，消化结束后加入PBS离心(1500rpm，5min)， 除去上清液，再加入2mLPBS重复一次。将细胞重悬于500μL的PBS中检 测。

如图6所示，流式细胞仪检测到的荧光强度也指出，TNO₃化合物释放出 了更多的NO，这可能是与癌症细胞内富含GSH、GST等可以促进NO释放的 物质有关。

(四)、TNO₃化合物体外抗癌活性检测

TNO₃化合物对肝癌细胞HepG2的细胞毒性

细胞培养：肝癌HepG2用含100mL/L灭活胎牛血清、100U/mL青霉素 和100U/mL链霉素的RPMI1640培养液，置于5％CO₂细胞培养箱，37℃恒温 恒湿培养。

细胞毒性实验：取对数生长期细胞，用0.25％的胰蛋白酶(含0.02％的 EDTA)消化后，用含10％FBS的RPMI 1640培养基稀释至5×10⁴/mL，接种 于96孔板(100μL孔)，每孔设7个复孔。待细胞贴壁后，弃去原培养基， 加入含有不同NO浓度的TNO₃化合物及GTN(10,5,1,0.1,and 0.01μM NO)， 阴性对照组加入等量的RPMI 1640培养基。孵育不同时间(24h、48h、72h) 后，吸出含药培养基，每孔加入10μL的MTT工作液(5mg/mL)，37℃培 养4h，用1mL注射器针头小心吸出每孔的培养基，再加入二甲基亚砜(DMSO) 150μL，轻微振荡5分钟使甲臜结晶彻底溶解，在酶标仪上于570nm波长 处测定每孔的吸光度OD值。

根据下述公式计算肿瘤细胞的存活率，通过Origin画图软件做出相应 的柱状图和折线图，并通过SPSS19.0统计软件计算各细胞各时间点的IC₅₀ 值(半数抑制浓度)，比较纳米粒组间及与游离多柔比星相比的抑制情况。

其中，OD_sample为实验组包括纳米粒组和阳性对照组的吸光度值，OD_control为阴性对照组的吸光度值。

参见图7，与GTN相比，TNO₃化合物表现出了不错的细胞毒性，如表2 所示，其在24h、48h和72h的IC₅₀分别为45.86±6.61、27.47±5.03和 14.38±3.41μg/mL。说明TNO₃化合物具有不错的肿瘤细胞抑制能力，促使 肿瘤细胞被显著地杀伤。

表2

^a：μg/mL.^b：μg阿霉素/mL.

实施例8

一种抗癌组合物，含有实施例1中制备的TPGS-NO₃化合物，以及阿霉 素，所述TPGS-NO₃化合物和阿霉素的质量比例为1:1。

1、所述抗癌药物的细胞摄取研究

(1)激光共聚焦显微镜

取洁净的φ＝13mm的圆玻片置于24孔细胞培养板中，将对数生长期的 细胞HepG2胰酶消化后以1×10⁵个/孔的细胞密度接种于24孔板中，置37℃、 5％CO₂细胞培养中过夜，当细胞生长密度长至70～80％，弃去旧培养基，加 入5μM DAF-FM DA处理40min，再加入含有阿霉素及所述抗癌组合物(其 中阿霉素5μg/mL)的培养基，孵育2h后，用200μL冰PBS洗两次，加入 4％多聚甲醛固定15min，再用200μL冰PBS洗两次，加入Hoechst33258 染核8min，再用200μL冰PBS洗两次，将1mL注射器的针尖折弯，用其将 盖玻片捞起，配合镊子将其取出，注意细胞面，小心倒扣在滴有甘油(用 10μL的枪头沾一小滴)的载玻片上。制备好的爬片上机显像。

参见图8，当将TNO₃化合物与所述抗癌药物与HepG2细胞进行孵育，所 述抗癌药物大幅度促进了肿瘤细胞对阿霉素的摄取。

(2)流式细胞仪

将对数生长期细胞HepG2用胰酶消化后接种10⁵个/mL于6孔板中，培 养过夜，当细胞生长密度长至90％，弃去旧培养基，用PBS洗2次，加入含 有阿霉素及所述抗癌组合物(其中阿霉素5μg/mL)的培养基，另有不含药 物的空白培养基作为对照。分别孵育2h和4h后，用冰PBS洗后胰酶消化， 消化结束后加入PBS离心(1500rpm，5min)，除去上清液，再加入2mLPBS 重复一次。最后将细胞重悬于500μL的PBS中送去检测。

参见图9，在细胞与所述抗癌组合物分别孵育2h和4h后，细胞对组合 药物中阿霉素的摄取量分别为单独使用阿霉素作为药物的2.52倍和3.42 倍，说明阿所述抗癌药物可以大幅度的促进肿瘤细胞对阿霉素的摄取。

2、所述抗癌药物的体外抗癌活性检测

组合药物的体外抗癌活性检测步骤参照上述MTT检测步骤，如图10所 示，所述抗癌组合物与阿霉素相比表现出了更显著地细胞毒性，所述抗癌 药物在24h、48h和72h时的IC₅₀分别为2.65±0.03,0.48±0.05和0.39 ±0.02μg/mL，分别为单独使用阿霉素细胞组的6.25倍、1.42倍和1.48 倍。说明所述具有抗癌活性的化合物不仅具有不错的肿瘤细胞抑制能力， 当与化疗药物组合时，能与化疗药物产生协同作用，促使肿瘤细胞被显著 地杀伤。

3、所述抗癌药物诱导肝癌细胞HepG2凋亡的检测

所述抗癌药物诱导肝癌细胞HepG2凋亡的检测

取洁净的φ＝13mm的圆玻片置于24孔细胞培养板中，将对数生长期的 细胞HepG2胰酶消化后以1×10⁵个/孔的细胞密度接种于24孔板中，置 37℃、5％CO₂细胞培养中过夜，当细胞生长密度长至70～80％，弃去旧培 养基，加入含有不同NO浓度的TNO₃化合物及GTN(10μM NO)。另外为了 验证所述抗癌药物的抗癌活性，弃去原培养基后，加入含有阿霉素及所述 抗癌组合物(其中阿霉素5μg/mL)的培养基，阴性对照组加入等量的RPMI 1640培养基。孵育24h后，用200μL冰PBS洗两次，加入4％多聚甲醛固 定15min，再用200μL冰PBS洗两次，加入Hoechst33258染核8min，再 用200μL冰PBS洗两次，将1mL注射器的针尖折弯，用其将盖玻片捞起， 配合镊子将其取出，注意细胞面，小心倒扣在滴有甘油(用10μL的枪头 沾一小滴)的载玻片上。制备好的爬片上机显像。

参见图11，相比其他化合物，阿霉素&TNO₃表现出了优秀地诱导肿瘤细 胞凋亡的能力，而且所述抗癌药物，诱导肿瘤细胞产生了更多的凋亡小体， 从而展现出了更强的诱导凋亡的效果。

4、所述抗癌药物的药代药动学研究

(1)血浆中阿霉素含量测定方法研究

色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS-3C18column(5μm,150mm×4.6mm， Agilent)；柱温：25℃；流速：1mL/min；紫外检测波长：230nm；进样量： 20μL；流动相：乙腈：水(50/50v/v)。

标准曲线：配制成浓度为150μg/mL的阿霉素溶液，精密称取阿霉素 7.5mg于50mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度线。根据配好的溶液，用甲醇 稀释，依次配制浓度为50、25、10、5、2.5、1、0.25、0.05μg/mL的标 准溶液。再取8份大鼠空白血浆100μL，加入以上配制的标准溶液100μL， 处理后，用于标准曲线的测定。

方法学实验：

A、色谱分离条件：本研究比较了血浆空白样品、阿霉素血浆标准液， 根据以上血液样品处理方法，采用HPLC，进样分析得出色谱图，考察所选 色谱分离条件的的合理性。

B、制备血浆标准曲线：如血浆样品的制备方法，分别以血浆药物浓度 依次为50、25、10、5、2.5、1、0.25、0.05μg/mL的样品建立标准曲线， 样品处理后进样分析，以血浆中阿霉素的浓度(X)为横坐标，阿霉素峰面 积(Y)为纵坐标。

(2)大鼠药代动力学研究

分组与给药方案：9只SD雄鼠(200±10g)随机分为2组，每组2只。 分别为阿霉素给药组；所述抗癌药物给药组。

给药剂量：10mg/kg。

给药方法:尾静脉注射给药。

大鼠尾静脉给药后于30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、72h取血 样。首先将EP管用肝素进行处理,取约0.25mL血浆，在1h内将血样进行 离心处理后取上清，将得到的血清置于-20℃冰箱储存，等待后续处理。

血样测定：按照上述建立的HPLC方法分析体内阿霉素，用来测定尾静 脉给予不同阿霉素制剂后血浆中阿霉素的浓度。每批样品分析时建立标准 曲线。得出不同时间的血药浓度，并根据时间和浓度的关系绘制出药时曲 线。得出的药动学数据，采用药动学软件DAS 2.1.1处理血浆中药物浓度， 并得出拟合后的参数，对其进行比较。得出静脉给药后的药时曲线下面积 AUC_(0-t)、t_1/2(消除半衰期)、Vd(表观分布容积)、CL(清除率)、MRT平 均驻留时间等参数值。

参见图12，注射所述抗癌组合物的实验组中的大鼠血药浓度明显高于 单独使用阿霉素的注射组。进一步从表3中的动力学参数可以分析得出， 所述抗癌组合物表现出了更长的血液滞留时间，具有17.3倍的曲线下面积 (AUC_0–72)、6.4倍的平均滞留时间(MRT)、14.7倍的半衰期(t1/2)和5.4％的 清除率。

表3

5、所述抗癌药物肿瘤内分布和抗癌活性研究

(1)、H22细胞的培养与荷瘤小鼠模型的建立

肝癌H22细胞在昆明雌性小鼠(20±2g)腹腔内进行培育，饲养条件 为SPF级，室温25±1℃，相对湿度50-60％，12h光照。当细胞培养达到成 熟后，在小鼠右前肢近腋下皮下接种H22细胞悬浮液1×10⁵cells/0.1mL/ 只，于动物房内饲养，建立小鼠H22细胞皮下移植瘤模型。等待肿瘤长至 50-100mm³时，进行用药。

(2)、所述抗癌药物在H22肿瘤内的分布研究

将符合要求的H22荷瘤小鼠随机分为2组，每组每个时间点3只。分 别于尾静脉注射给予阿霉素和所述抗癌组合物(其中阿霉素5mg/kg)。小鼠 分别于1、2、4、8、24、48h处死，立即剥离肿瘤组织并进行匀浆处理。 匀浆液用氯仿：甲醇＝10:1的有机溶剂萃取，萃取样品处理方法与上述药代 动力学血液样品一致，然后使用HPLC进行检测。

参见图13，在静脉注射所述抗癌组合物后，肿瘤内的阿霉素含量有明 显提高，说明TNO₃化合物产生的NO在改善了阿霉素在肿瘤组织中的穿透效 果和滞留时间。

(3)、所述抗癌组合物在H22荷瘤小鼠体内抗癌活性研究

将符合要求的荷瘤小鼠随机分为6组，每组8只。分别于1、3、5、7 天尾静脉注射给予生理盐水、GTN、TPGS、TNO₃、阿霉素和所述抗癌组合物 (其中阿霉素含量5mg/kg)。实验期间每天用游标卡尺测量皮下肿瘤最宽 处(W)和最长处(L)，根据公式V＝L×W²/2计算肿瘤的体积，绘制肿瘤平 均生长曲线。从第一天开始，每日称量荷瘤小鼠的体重，根据体重的数据， 绘制小鼠体重变化曲线。在抑瘤实验结束后，剥离各组实体瘤组织，并进 行称重，绘制各组间实体瘤平均重量柱状图。结束实验时，将各组实体瘤 组织剥离置于配制好了的多聚甲醛，用常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红 (HE)染色，酒精脱水，干燥，封片。做病理切片，显微镜下观察、摄片。 选取阿霉素和阿霉素&TNO₃实验组中肿瘤组织中心部位，制成冰冻切片后， 于激光共聚焦显微镜下观察阿霉素在肿瘤组织中的穿透效果。

参见图14，TNO₃化合物在H22荷瘤小鼠上表现出了一定的体内肿瘤抑 制能力，并且当与阿霉素组合成所述抗癌组合物后，显著地提高了药物的 抑制肿瘤的能力，使肿瘤体积和重量分别减小至阿霉素注射组的44.21％和 49.46％。再如图15所示，通过对肿瘤组织取样进行组织切片的观察，所述 抗癌组合物表现出了最好的肿瘤抑制效果。

以上实验说明TNO₃化合物是一个非常有潜力的药用辅药，不仅自身具 有不错的肿瘤抑制能力，在与化疗药物组合成组合物后，更能大幅的提升 组合物对肿瘤的抑制效果。

实施例9

一种抗癌药物，含有实施例3中制备的TPGS-NNO化合物与pH敏感型 TPGS阿霉素前药(TPGS-C＝N-DOX)，pH敏感型TPGS阿霉素前药与所述 TPGS-NNO化合物的质量比例为1:1至1：4。

将符合要求的H22荷瘤小鼠随机分为6组，每组8只。分别于1、3、5、 7天尾静脉注射给予生理盐水、DOX、TPGS-C＝N-DOX和不同质量比的组合药 物TPGS-C＝N-DOX&TPGS-NNO(1:1)、TPGS-C＝N-DOX&TPGS-NNO(1:2) 和TPGS-C＝N-DOX&TPGS-NNO(1:4)，其中折算阿霉素含量为5mg/kg。 具体测量方法见实施例1.

参见图16，TPGS-C＝N-DOX在H22荷瘤小鼠上表现出了一定的体内肿 瘤抑制能力，并且当与TPGS-NNO化合物按比例组合成TPGS-C＝N-DOX& TPGS-NNO组合药物后，显著地提高了药物的抑制肿瘤的能力，使肿瘤体积 和重量分别减小至阿霉素和TPGS-C＝N-DOX注射组的53.79％和33.70％。注 射阿霉素后的荷瘤小鼠体重呈快速下降的趋势，而在TPGS-C＝N-DOX和 TPGS-C＝N-DOX&TPGS-NNO给药组中的小鼠体重呈现上升趋势，说明前药同 组合药物同样改善了阿霉素的毒副作用。

实施例10

一种抗癌药物，含有实施例2中制备的TPGS-ONO化合物与还原敏感型 TPGS紫杉醇前药(TPGS-S-S-PTX)，还原敏感型TPGS紫杉醇前药 (TPGS-S-S-PTX)与所述TPGS-ONO的质量比例为1.5:1。

(一)、所述抗癌组合物的稳定性研究

1、溶液的制备

将TPGS-ONO化合物与TPGS-S-S-PTX按表4中的不同比例溶解在乙醇 中，缓慢滴至pH7.4的PBS中，边滴边搅拌，过夜搅拌挥干其中的乙醇。

表4

2、评价指标

(1)粒径变化

按照上述溶液制备的方法，分别制得TPGS-ONO化合物与TPGS-S-S-PTX 的组合药物胶束1～6号样品，置于粒度仪中测量水合粒径。

参见表4,1～6号混合胶束的粒径分别为132±2.1nm、110±1.2nm、 90±0.5nm、95±0.8nm、120±0.3nm和140±3.1nm，说明随着TPGS-ONO 化合物和TPGS-S-S-PTX比例的不同，混合胶束的粒径也不同，并且在 TPGS-ONO与TPGS-S-S-PTX比例为6:4时，有着最小最均一的粒径。

(二)、所述抗癌组合物胶束对肝癌HepG2细胞的细胞毒性

具体参见实施例1中细胞毒性试验。

参见表5，组合药物胶束的IC₅₀远小于TPGS-ONO化合物胶束和 TPGS-S-S-PTX前药胶束，说明TPGS-ONO化合物与TPGS-S-S-PTX前药的组 合可以显著提升对肿瘤细胞的抑制效果。

表5

编号 TPGS-ONO(mg) TPGS-PTX(mg) IC₅₀1 6 0 40.23±4.25 2 6 4 0.03±0.01 3 0 4 1.19±0.92

(三)、PTX-S-S-TPGS&TNO₃组合药物在S180荷瘤小鼠体内抗癌活性研究

将符合要求的荷瘤小鼠随机分为6组，每组8只。分别于1、3、5、7 天尾静脉注射给予生理盐水、Taxol、TPGS-S-S-PTX、TPGS-ONO和 TPGS-S-S-PTX&TPGS-ONO(1:1)、TPGS-S-S-PTX&TPGS-ONO(1:2)和 TPGS-S-S-PTX&TPGS-ONO(1:4)，其中紫杉醇含量为5mg/kg。

参见图17，TPGS-ONO化合物在S180荷瘤小鼠上表现出了一定的体内 肿瘤抑制能力，并且当与TPGS-S-S-PTX按比例组合成TPGS-S-S-PTX& TPGS-ONO组合药物后，显著地提高了药物的抑制肿瘤的能力，使肿瘤体积 减小至Taxol和TPGS-S-S-PTX注射组的33.70％。

实施例11

一种抗癌药物，含有实施例4中制备的TPGS-[N(O)NO]与阿霉素，所述 阿霉素与TPGS-[N(O)NO]的质量比例为1:4。

将符合要求的H22荷瘤小鼠随机分为6组，每组8只。分别于1、3、5、 7天尾静脉注射给予生理盐水、GTN、TPGS、TPGS-[N(O)NO]、阿霉素和所述 抗癌组合物(其中阿霉素含量为5mg/kg)。具体测量方法见实施例8。如 图18所示，所述抗癌组合物具有更好的抑制肿瘤效果。

实施例12

一种抗癌药物，含有实施例5中制备的TPGS-SNO化合物与阿霉素，阿 霉素与所述TPGS-SNO化合物的质量比例为1:4。

细胞毒性和激光共聚焦观察细胞摄取的操作步骤详见实施例8。如图 19和20所示，阿霉素与TPGS-SNO按质量比1:4联合使用后具有更好的细 胞毒性和促进细胞摄取的能力。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等 同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。