一种用于分离原代呼吸道上皮细胞的双材质中空套管

摘要

本发明涉及在体分离原代呼吸道上皮细胞的工具，具体涉及一种用于分离原代呼吸道上皮细胞的双材质中空套管。其特征在于由不同管径的硅胶管(管径细、强度高)和铁氟龙中空管(管径粗、强度小、韧性大)通过硅胶胶水粘合而成。

说明书

技术领域

本发明涉及医学仪器领域，具体而言，涉及一种用于分离原代呼吸道上皮细胞的双材质中空套管。

背景技术

呼吸道上皮细胞是呼吸系统与外界接触的第一道天然屏障，其结构与功能稳态是呼吸系统维持正常换 气功能和防御功能的细胞基础。呼吸道上皮细胞附着于基底膜生长，共同构成呼吸道的假复层柱状纤毛上 皮，其表面的纤毛有节律地向咽部摆动，在机体排除呼吸道刺激性异物的过程中发挥了重要作用。

实验动物的原代呼吸道上皮细胞作为人呼吸道上皮细胞的实验模型，对于临床和实验室工作具有不可 取代的借鉴作用。呼吸道上皮细胞分离培养技术的不断完善必将对以呼吸系统研究为基础的病毒学、病理 学和毒理学、生物化学、药代动力学、发育生物学，甚至临床治疗与应用产生推动作用。

目前，国内外分离实验用动物大气道原代呼吸道上皮细胞大多采用纵向剪开气管，直接浸入含链酶蛋 白酶的试管中，4℃酶解18-24小时，再离心酶解液(离心力123g)，最后收集细胞团的方法来获取原代呼 吸道上皮细胞。然而，这种方法获取的细胞数较少、活性较差，最为重要的是杂细胞过多，对呼吸道疾病 的细胞学研究产生限制。因此，我们总结实验中的经验，开发出基于气管插管的分离大气道上皮细胞的方 法。但是，在该方法的操作过程中存在以下问题：若选用的材质强度太大而弹性小，导致针头插入欠紧， 且折返、动脉夹夹持困难，容易造成链霉蛋白酶外漏；若选取的材质强度小而弹性大，又将导致手术线结 扎时，不宜扎紧，也会造成链霉蛋白酶外漏等。目前虽已有多种气管插管方法应用于动物体外实验中，但 这些方法不但技术操作复杂且需要特殊设备，而且往往因链霉蛋白酶外漏导致细胞消化不充分，从而影响 整个实验的成败。于是我们针对上述问题开发出双材质中空套管。此套管选取两种不同特性、材质的中空 管组成套管，分别满足两端不同需要，以达到防止链霉蛋白酶外漏并有效减少链霉蛋白酶用量的效果，从 而减少酶解液对游离呼吸道上皮细胞的损伤作用，在保证分离的呼吸道上皮细胞活性的基础上，大幅增加 细胞分离数量。本发明通过运用铁氟龙中空管、GA-1073硅胶管和文锦超能380硅胶胶水实现这一构想。

GA-1073硅胶管强度大(硬度70±5D)，且生物相容性较好。铁氟龙管，又叫聚四氟乙烯 (Polytetrafluoroethene，PTFE)管，是采用PTFE材料制成，具有强度小(硬度50-55D)、韧性大的特点， 可塑性强。文锦超能380硅胶胶水化学成份为氰基丙烯酸酯，目前医用氰基丙烯酸酯粘合剂已在创伤骨科 中广泛应用，无生物毒性。本套管即利用GA-1073硅胶管强度大不易变形，即在手术线结扎时不易坍陷的 特点，通过选取适当管径的GA-1073硅胶管，在减少对气管损伤的同时，更便于插入动物气管，手术线结 扎紧密；又利用铁氟龙中空管强度小和韧性大的特点，既便于连接注射器，又在后期动脉夹封闭管腔时便 于折返。文锦超能380硅胶胶水是以高分子聚合物为主体的溶剂型产品，粘接强度高、抗剪切。此双材质 中空套管不仅可以重复使用，而且在保证分离的呼吸道上皮细胞活性的基础上，大幅增加细胞分离数量。

目前，市售的原代呼吸道上皮细胞价格昂贵，且多数都已丧失纤毛定向摆动的在体生理功能，活性较 差。因此，需要更为便利且快捷的呼吸道上皮细胞分离设备。

发明内容

本发明涉及一种便于进行原代呼吸道上皮细胞分离的双材质中空套管。所述双材质套管能够保证实验 动物气管插管的成功率，并且确保由注射器、双材质中空套管和气管所组成的管道系统的通畅性和密闭性， 防止此管道系统在培养基中浸泡、酶解的过程中出现酶解液渗漏，在保证链霉蛋白酶与呼吸道上皮细胞的 接触和作用的同时，有效减少链霉蛋白酶的用量，从而降低酶解液对游离呼吸道上皮细胞的损伤。以获取 更多数目且活性更好的原代呼吸道上皮细胞。

所述的双材质中空套管由，

(1)管径细、强度高的硅胶管构成的插入气管的内层套管，和

(2)管径粗、韧性大、可对折并通过止血钳封闭的铁氟龙中空管构成的外层套管套接而成；

并且硅胶管的外径等于铁氟龙中空管的内径。

所述的套接为通过可用于外科手术的医用粘合剂粘合，所述的医用粘合剂优选为文锦超能380硅胶粘 硅胶胶水。

所述的硅胶管优选为GA-1073硅胶管，强度大不易变形，在手术线结扎时不易坍陷，通过选取适当管 径的GA-1073硅胶管，在减少对气管损伤的同时，能更便于插入动物气管，且手术线结扎时不塌陷从而保 证了链霉蛋白酶消化液的顺利流入气管腔；

所述的铁氟龙中空管强度小韧性大的，既便于连接注射器，又在后期封闭管腔时便于折叠并通过止血 钳夹紧密封。

此套管不仅可以重复使用，而且能保证实验动物气管插管的成功率，并且确保由注射器、双材质中空 套管和实验动物气管所组成的管道的通畅性和密闭性，减少链霉蛋白酶的用量，有效提升分离得到的呼吸 道上皮细胞的活性，增加呼吸道上皮细胞的分离数量。

所述的硅胶管和铁氟龙中空管的口径大小和长度可以根据实验动物模型来合理选择，以便于插管操 作。

所述的硅胶管套接与铁氟龙中空管内的长度取决于分离原代呼吸道上皮细胞的模型动物种类和两种 材质管的长度，优选为硅胶管长度的四分之一。

本发明为有关呼吸道上皮细胞的研究、教学、医学应用提供了有利的物质条件，联合应用我们已授权 的专利(ZL 201110440894.2)中所述的培养基，能有效增加分离得到的呼吸道上皮细胞的数量和活力，并 保留呼吸道上皮细胞的纤毛定向摆动的在体生理功能。

本发明使得原代呼吸道上皮细胞分离操作简单易行，可重复性强，便于推广应用，具有广泛的推广价 值。

附图说明

图1.双材质中空套管的立体图(以小鼠专用双材质中空套管为例)。(比例尺5：1)

图2.双材质中空套管的剖视图。(比例尺5：1)

图3.双材质中空套管沿线A-A’的剖视图。(比例尺50:1)

图4.双材质中空套管连接游离BALB/c小鼠气管后的实物图，1.一号手术线；2.小鼠气管；3.GA-1073 硅胶管；4.铁氟龙中空管。

图5.注入链酶蛋白前双材质中空套管连接气管实物图，1.小鼠气管；2.GA-1073硅胶管；3.铁氟龙中 空管。

图6.注入链酶蛋白后气管气球样改变的实物图，1.小鼠气管；2.GA-1073硅胶管；3.铁氟龙中空管。

图7.倒置显微镜下的小鼠原代呼吸道上皮细胞

具体实施方式

以分离小鼠呼吸道上皮细胞专用双材质中空套管为例

实施例1.双材质套管的制作

(1)取两端分别为45度斜末端和平末端，内径0.6mm，外径0.8mm的GA-1073硅胶管；

(2)取20mm和两端均为平末端，内径0.8mm，外径1.0mm的铁氟龙中空管25mm，

(3)将GA-1073硅胶管的平末端涂上10微升文锦超能380硅胶胶水插入铁氟龙中空管中，插入5mm 后固定15s即得所述双材质套管。

图1所示为本发明所述双材质中空套管的立体图(以小鼠专用双材质中空套管为例)，其中

1为铁氟龙中空管，长度：25mm

2为GA-1073硅胶管，长度：20mm

BB’为铁氟龙中空管外径：1.0mm

CC’为GA-1073硅胶管插入铁氟龙中空管长度5mm

DD’为GA-1073硅胶管内径：0.6mm

EE’为铁氟龙中空管内径，GA-1073硅胶管外径：0.8mm

实施例2.小鼠气管的分离

(1)取BALB/c小鼠经断颈处死，翘起头部，将其胸腹部酒精浸泡消毒30s，注意保护口腔和鼻道， 免受酒精刺激。将其固定于手术台上，无菌条件下延腹白线剪开皮肤，暴露腹主动脉，切开放血至流尽， 其目的在于避免分离呼吸道上皮细胞时混入过多红细胞；

(2)钝性分离气管，暴露气管后，并将其充分游离；

(3)穿双股1号手术线100mm，在气管环状软骨下方5mm处剪一小缺口，插入双材质套管GA-1073 硅胶管45度斜末端，插入气管一半约5mm深，用1号手术线在气管外侧打一紧结，将硅胶套管固定在 气管内；

(4)通过铁氟龙中空管连接1ml规格注射器，向导管内注射PBS缓冲液盥洗气管，并观察肺有无缺 损；

(5)在气管下游硅胶管未深入的分叉处用手术线再打一紧结封闭气管末端，去除气管周围多余组织 及手术线，游离气管。

实施例3.气管组织的消化和红细胞的去除

(1)通过双材质套管向套管尖端固定的气管内注入少许4℃预冷的0.05％链霉蛋白酶，灌洗气管 内壁将盥洗的PBS去除；

(2)将0.05％链霉蛋白酶注满整段气管，使气管稍呈气球样膨胀，对折的铁氟龙中空管部分后用 30mm动脉夹夹住，封闭整个气管-套管的组合；

(3)将整段气管固定浸润在加有青霉素的MEM中，消化8h；

(4)剪断下端气管，收集消化液，并用1ml注射器吸取PBS冲洗气管；

(5)收集冲洗液约1.5ml(收集液+PBS冲洗气管液体)，合并后转移至EP管内，500X g离心4min 去除上清液；

(6)添加红细胞裂解液(Sigma R7757-100ML)150μl，1min温和混匀后，PBS稀释至1.5ml，500g离 心6min；去除上清液，然后用适量完全培养基充分重悬细胞，取10μl用于细胞计数，经计数，每只小鼠 可提取细胞数目约5*10⁵个细胞。

实施例4.呼吸道上皮细胞的原代培养及鉴定

呼吸道上皮细胞培养

(1)以24孔板为例，每孔500μl完全培养基培养体系(培养基见专利CN102505005A)，加入适量细 胞(具体细胞数量根据实际实验要求确定)，注意混匀，避免细胞成堆无法展开；

(2)十字摇匀后，在实验台上放置30min后，转移至孵育箱中，每天进行换液处理(相同的体系)， 待细胞贴壁后可即可开展后续实验。

呼吸道上皮细胞形态鉴定

(1)刚分离下来的气道上皮细胞呈圆形，有些成小团或成片，一般在24h左右可见细胞贴壁并完全 展开，镜下观察，纯度约为95％，仅有少量的成纤维细胞混杂其中；

(2)培养5d后细胞融合度达到较高水平即形成典型的细胞岛(图7)，并可以看到快速的纤毛摆动， 这是呼吸道上皮细胞所独有的生物学行为。

由于分离的细胞部位来源于气管内壁，该部位唯一有节律性运动的细胞只有呼吸道上皮细胞，同时， 这种规则的摆动又是呼吸道上皮细胞的典型特征，故以此特征作为该细胞的标志，且说明细胞生长良好， 其生理功能接近在体水平。