p110δ及其抗体在特异性标记滋养层巨细胞(pTGC)中的应用

摘要

本发明公开了p110δ及其抗体在特异性标记早期滋养层巨细胞（ParietalTGC，pTGC）中的应用。所述p110δ为p110δ的片段，该片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本发明的记载，以p110δ抗体作为检测媒介，通过常规的免疫组化、免疫荧光或PCR等技术方法，可以特异性地标识pTGC，且该标记更加简便、检测时间大大缩短、易于识别，成功率更高，使用者接受度更好，更加便于应用于临床。另外，相比于原位杂交的核酸水平，本发明的观测指标在于蛋白水平，更能直接反应机体效应情况，应用范围更广。

说明书

技术领域

 本发明属于细胞检测标记技术领域。更具体地，涉及p110δ及其抗体在特异性标记滋养层巨细胞（pTGC）中的应用。

背景技术

胎盘是哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官。对于在子宫中发育的胎儿来说，胎盘具有供给、代谢、排泄、分泌和免疫等功能，胎盘异常则会引起胎儿缺氧、窘迫、营养不良、发育迟缓、智力受损、甚至胎死腹中等现象。

    滋养层细胞中的滋养层巨细胞（Parietal TGC，pTGC）为一类线性排列在植入位点及顶叶卵黄囊外侧的多核巨型细胞，根据其分化形成的不同，分为初级与次级（1°与2°），pTGC在胎盘形成与功能维持中的变化与胎盘异常的发生有密切联系。pTGC的侵入是胎盘形成中一个非常关键的过程，且受着严格的时空调控（Cross et al.,1994）。在人类，滋养层侵入不足或过度侵入都会引起妊娠的异常，导致病理性妊娠，比如先兆子痫或绒毛膜癌（Karmakar et al., 2004）。因此，pTGC的监测和标记对于胚胎以及妊娠过程的监测具有非常重要的意义。

目前，pTGC的标记方法的研究主要集中在原位杂交（in situ hybridization，ISH）检测法，相关特异性指标有Pl1、Pl2与 Plf（Simmons DG et al., Dev Biol, 2007）。ISH是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。ISH是一项可以特异的检测目的基因表达的实验技术，但是要想检测到特定的基因表达，必须具备以下条件：（1）必须专门设计的已知核酸序列的核酸片段-探针；（2）简单而又可靠的探针标记方法；（3）敏感性高且特异性强的检测方法。不仅如此，无论自探针设计、制备还是后期实验中，ISH都体现诸多不便，操作步骤繁多，耗时长达三天，虽有试剂盒的出产以提高实验成功率和便利度，但相比免疫组化（IHC）等实体结构定位标记方法，ISH的“亲民度”仍不高。但是，免疫组化方法需要合适的标记抗体，才能保证标记的特异性和标记效果，因此标记靶标及其抗体的选择对免疫组化结果是至关重要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有滋养层巨细胞（pTGC）的标记技术缺陷和不足，提供一种准确性好、特异性强、适用性广的pTGC早期标记物p110delta（p110δ）。

本发明的目的是提供p110δ及其抗体在特异性标记滋养层巨细胞（pTGC）中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了p110δ在特异性标记早期滋养层巨细胞中的应用。

所述应用是指p110δ在制备滋养层巨细胞的特异性标记物中的应用。

所述p110δ为p110δ的片段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了p110δ抗体作为滋养层巨细胞的特异性标记物的应用，所述p110δ抗体是以SEQ ID NO.1所示序列为抗原获得的抗体。

优选地，所述p110δ抗体是以SEQ ID NO.1所示的 p110δ片段为抗原获得。

所述应用的方法为：以p110δ抗体作为检测标记物，利用免疫组化、免疫荧光或PCR的方法，对滋养层巨细胞进行特异性标记。

优选地，上述滋养层巨细胞是早期的滋养层巨细胞。

SEQ ID NO.1所示序列即人源N端氨基酸363~582，具体如下：

ValSerValCysSerGluProValTrpLysGlnArgLeuGluPheAspIleAsnIleCysAspLeuProArgMetAlaArgLeuCysPheAlaLeuTyrAlaValIleGluLysAlaLysLysAlaArgSerThrLysLysLysSerLysLysAlaAspCysProIleAlaTrpAlaAsnLeuMetLeuPheAspTyrLysAspGlnLeuLysThrGlyGluArgCysLeuTyrMetTrpProSerValProAspGluLysGlyGluLeuLeuAsnProThrGlyThrValArgSerAsnProAsnThrAspSerAlaAlaAlaLeuLeuIleCysLeuProGluValAlaProHisProValTyrTyrProAlaLeuGluLysIleLeuGluLeuGlyArgHisSerGluCysValHisValThrGluGluGluGlnLeuGlnLeuArgGluIleLeuGluArgArgGlySerGlyGluLeuTyrGluHisGluLysAspLeuValTrpLysLeuArgHisGluValGlnGluHisPheProGluAlaLeuAlaArgLeuLeuLeuValThrLysTrpAsnLysHisGluAspValAlaGlnMetLeuTyrLeuLeuCysSerTrpProGluLeuProValLeuSerAlaLeuGluLeu。

p110delta（p110δ）是磷酸肌醇-3激酶（PI3K）的一种，即为p110δ型磷酸肌醇-3激酶。研究表明，p110δ同工型牵涉在与免疫-炎症性疾病相关的生物学功能中，包括来自B-细胞受体、T细胞受体的信号传导，肥大细胞和单核细胞/巨噬细胞的FcR信号传导和破骨细胞功能/RANKL信号传导。p110δ基因缺失或选择性引入p110δ的催化失活突变体导致B细胞增殖和信号传导的几乎完全缺失，还导致通过T细胞进行的信号传导受损。 

本发明研究团队长期致力于胎盘相关研究工作，在对pTGC的研究工作中，为了克服现有pTGC的标记技术存在的操作复杂，耗时等问题，通过大量的研究和探索，发现p110δ特异性在pTGC中表达，可能与流产问题相关，进一步机制研究正在进行中。但是我们已非常明确的是，将p110δ抗体作为pTGC的特异性标记物，即以p110δ作为检测媒介，通过免疫组化、免疫荧光或PCR等技术方法，可以特异性地标识pTGCs，以此可以辅助与胚胎发育相关的指标检测。并且该标记更加简便、易于识别，应用范围更广。另外，相比于原位杂交的核酸水平，本发明的观测指标在于蛋白水平，更能直接反应机体效应情况。

本发明对所涉及的实验检测方法并不做严格限制，我们强调的是通过p110 delta（p110δ）作为检测标记物，可以特异性标识pTGC。检测方法可以是常用的免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）、聚合酶链反应（PCR）、原位杂交（ISH）等等，其反应条件参数等参考任何一个可用的实验指导说明，均可获得相应的反应效果。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了p110δ及其抗体在特异性标记滋养层巨细胞（pTGC）中的应用，克服了现有pTGC的标记技术存在的操作复杂，耗时等问题，将p110δ抗体作为pTGC的特异性标记物，即以p110δ作为检测媒介，通过免疫组化、免疫荧光或PCR等技术方法，可以特异性地标识pTGCs，即可在胚胎中清晰辨别出pTGCs ，以此可以辅助与胚胎发育相关的指标检测。

本发明以p110δ作为pTGC的特异性标记物，对所涉及的实验检测方法并不做严格限制；如免疫组化（IHC）、免疫荧光方法（IF）等均是更商业化的检测方法和试剂，实验技术应用广泛，且操作更易上手，实验时间可缩短为一天（原有的ISH检测三天一周期），标记结果更易于识别，应用范围更广，这些方法均是广大实验室和临床监测中的常用特异性实体结构定位标记方法。拓展了对pTGC进行定位检测的技术手段，使得实验的完成比以往更便利，成功率更高，使用者接受度更好，更加便于应用于临床（目前IHC为临床诊断检测中一个核心检测技术）。

除了监测手段上的优化之外，在特异性的标记物方面，我们的新发现p110δ作为一个经典的PI3K信号通路中的重要成员，以其作为特异性蛋白标记物，借助常用的IHC或IF等方法，即可特异识别出p-TGCs，方便且实用，p110δ可以是已商业化的抗体，应用更简便。另外，相比于原位杂交的核酸水平，本发明的观测指标在于蛋白水平，更能直接反应机体效应情况。

附图说明

图1为小鼠妊娠第8.5天时胚胎HE染色结果。

图2为小鼠妊娠第8.5天胚胎pTGCs经p110δ IHC检测显示细胞浆的特异性强阳性表达结果。

图3为小鼠妊娠第8.5天胚胎pTGCs经CK7 IHC检测显示细胞浆的特异性强阳性表达结果。

图4为小鼠妊娠第10.5天胚胎pTGCs经p110δ IHC检测显示细胞浆的特异性弱阳性表达结果。

图5为小鼠妊娠第13.5天胚胎pTGCs经p110δ IHC检测显示细胞浆的无表达结果。

图6为小鼠妊娠第8.5天胚胎pTGCs经p110δ IF检测显示细胞浆的特异性表达结果（未共标CK7）。

图7为小鼠妊娠第8.5天胚胎pTGCs经p110δ IF检测显示细胞浆的特异性表达结果（共标CK7）。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

p110 delta（p110δ）抗体购买于Santa Cruz公司（sc-55589）。按照抗体说明书的使用范围均可使用。本发明中应用的抗体体积稀释配比为1：150，稀释液体为1%（w/v）BSA液体或pH7.2~7.6的PBS。

本发明研究发现p110δ特异性在滋养层巨细胞（pTGC）中表达，尤其是在早期的pTGC，即自胚胎植入完成至胎盘形成期间（本发明中的检测时间点为第7.5~8.5天）的pTGC特异性地阳性表达，如附图2~5所示，胚胎发育早期pTGC为强阳性表达，随着胎盘发育，pTGC迁移后，其p110δ阳性减弱。因此，p110δ可以作为早期pTGC的特异性标记物。以下实施例利用常用的免疫组化和免疫荧光技术为例，以p110δ为检测媒介，来特异性标记早期pTGC。

实施例1 免疫组化（IHC）检测pTGC

1、p110δ抗体的制备

以人源p110δ的部分片段，即SEQ ID NO.1所示氨基酸序列作为信息依据制备p110δ抗体。

所述p110δ抗体购买于圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology），商品名PI3-kinase p110δ 抗体(A-8)（sc-55589），为单克隆小鼠来源抗体，可针对小鼠及人源性标本进行实验检测。

2、获取小鼠胚胎/胎盘

分别选取妊娠第7.5~8.5天、第10.5~12.5天和第13.5~15.5天的小鼠（C57BL/6J小鼠，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2008-0002），按照以下方法获取小鼠胚胎/胎盘：

S1.将小鼠颈部脱臼处死；

S2.将小鼠仰卧，腹中间开口暴露腹腔，将肠道组织翻向外侧，暴露妊娠中子宫，用镊子夹住阴道部，子宫两侧将妊娠子宫分离出来，放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的小皿中；

S3.沿子宫系膜一侧，用精细的镊子与剪刀配合，将子宫剖开，分离出胚胎/胎盘，并将其放入专用小盒编号，后固定、脱水、包埋。

3、将上述获得的胚胎/胎盘进行切片、染色，利用IHC的方法，以p110δ抗体（一抗）进行检测。以CK7（细胞角蛋白7）作为阳性对照，CK7是滋养层细胞公认的标示物。

IHC操作流程如下：

（1）脱蜡：按照如下顺序进行处理：二甲苯I，II各处理20min，无水乙醇处理15min，再换新的无水乙醇处理10min，95%酒精处理10min，90%酒精处理10min，80%酒精处理10min，70%酒精处理10min，流水冲洗3min。

（2）蒸馏水泡2min。

（3）柠檬酸盐（PH=6.0）修复3~3min30s（先将柠檬酸盐置于高压锅中煮沸，然后放入切片，待充气后3~3min30s）。

（4）少量流水冲洗高压锅冷至室温（约20~25min）。

（5）蒸馏水泡2min。

（6）3%的H₂O₂常温30min。

（7）蒸馏水泡洗2min，PBS（pH=7.2~7.4）10min，重复3次。

（8）10% 胎牛血清（PBS稀释）室温封闭1小时。

（9）加入一抗，4℃过夜。

（10）蒸馏水泡洗2min，后PBS（PH=7.2~7.6）10min，重复3次。

（11）加二抗（羊抗小鼠IgG，购于博士德公司，1：150稀释后使用）室温放置1~2h。

（12）PBS 洗3min，重复5次。

（13）DAB显色（使用Thermo SCIENTIFIC公司的DAB浓缩液(10X)，配合Thermo SCIENTIFIC公司DAB稀释液，进行1：9稀释后，按照使用说明书进行）。

（14）自来水涮洗5~10下。

（15）苏木素复染30 s。

（16）自来水洗一下，1%盐酸分化1~2s，自来水再洗2h

（17）80%酒精处理2min，95%酒精处理2min，无水乙醇处理2min（两次），二甲苯处理2min（两次）。

（18）风干，封片剂封片。所述封片剂为中性树胶，购于国药集团化学试剂有限公司。

4、检测结果

结果分别如附图1~5所示，附图1所示为小鼠妊娠第8.5天时胚胎HE染色结果。图2为小鼠妊娠第8.5天时胚胎pTGCs经p110δIHC检测显示细胞浆的特异性强阳性表达结果。图3为小鼠妊娠第8.5天时胚胎pTGCs经CK7 IHC检测显示细胞浆的特异性强阳性表达结果。图4为小鼠妊娠第10.5天时胚胎pTGCs经p110δ IHC检测显示细胞浆的特异性弱阳性表达结果。图5为小鼠妊娠第13.5天时胚胎pTGCs经p110δ IHC检测显示细胞浆的无表达结果。

结果显示，可在早期发育胚胎中（从小鼠胚胎植入开始，至胎盘形成前）清晰辨别出pTGCs。另外本发明中分别检测了胚胎蜕膜发育前期（第7.5~8.5天）、胎盘初步形成期（第10.5~12.5天）和胎盘期（本专利检测点为胚胎发育第13.5~15.5天的胎盘）的小鼠pTGCs中p110δ的特异性表达，结果显示，仅在胎盘形成前的标本中（本发明中显示为第7.5~8.5天）的pTGC特异性地阳性表达p110δ。

综上所述，胚胎发育早期pTGC为强阳性表达，随着胎盘发育，pTGC迁移后，其p110δ阳性减弱。

实施例2 免疫荧光技术（IF）检测pTGC

1、p110δ抗体的制备以及小鼠胚胎/胎盘的获取同实施例1。

2、将上述获得的胚胎进行切片、染色，利用IF的方法，以p110δ抗体（一抗）进行检测。以CK7（细胞角蛋白7）作为阳性对照，CK7是滋养层细胞公认的标示物。

IF的操作流程如下：

（1）石蜡切片正常脱蜡至水，PBS洗5分钟，3次。

（2）抗原修复：0.01M枸橼酸盐缓冲液pH=6.0（修复液），沸水浴热修复15分钟。

（3）10% 胎牛血清（PBS稀释）室温封闭1小时

（4）一抗孵育，4℃过夜（抗体1：200倍稀释）。

（5）PBS洗5分钟，3次。

（6）二抗孵育（AlexaFluor 488标记的羊抗小鼠IgG，1：200倍稀释），37℃，60分钟。

（7）PBS洗5分钟，3次。

（8）DAPI复染5~10分钟，PBS洗5分钟，3次。

（9）防猝灭荧光封片剂封片。

（10）镜检。

其中，所述的0.01M枸橼酸盐缓冲液（Citrate buffer）的配制方法如下：

储存液：A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C₆H₈O₇·H₂O）溶于1000mL蒸馏水中。

B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸三钠（C₆H₅Na₃O₇·2H₂O）溶于1000mL蒸馏水中。

工作液：取9mL A液和41mL B液加入450mL蒸馏水中，溶液pH值应为5.9~6.1。

所述防猝灭荧光封片剂为购于北京中杉金桥生物技术有限公司的Mounting Medium。

3、检测结果

结果如附图6和附图7所示，可在胚胎中清晰辨别出pTGCs，妊娠第7.5~8.5天的小鼠胚胎pTGCs可被p110δ特异标识。胚胎发育早期时pTGC为p110δ强阳性表达。

经过以上两个实施例的验证，我们可以知道，p110δ确实特异性地在早期pTGC中表达，可以作为早期pTGC的特异性标记物。但是本发明对所涉及的实验检测方法并不做严格限制，不仅仅限制于上述IHC或IF。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广东药学院

 

<120>  p110δ及其抗体在特异性标记滋养层巨细胞（pTGC）中的应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  220

<212>  PRT

<213>  p110δ片段

 

<400>  1

 

Val Ser Val Cys Ser Glu Pro Val Trp Lys Gln Arg Leu Glu Phe Asp

1               5                   10                  15     

 

 

Ile Asn Ile Cys Asp Leu Pro Arg Met Ala Arg Leu Cys Phe Ala Leu

            20                  25                  30          

 

 

Tyr Ala Val Ile Glu Lys Ala Lys Lys Ala Arg Ser Thr Lys Lys Lys

        35                  40                  45             

 

 

Ser Lys Lys Ala Asp Cys Pro Ile Ala Trp Ala Asn Leu Met Leu Phe

    50                  55                  60                  

 

 

Asp Tyr Lys Asp Gln Leu Lys Thr Gly Glu Arg Cys Leu Tyr Met Trp

65                  70                  75                  80 

 

 

Pro Ser Val Pro Asp Glu Lys Gly Glu Leu Leu Asn Pro Thr Gly Thr

                85                  90                  95     

 

 

Val Arg Ser Asn Pro Asn Thr Asp Ser Ala Ala Ala Leu Leu Ile Cys

            100                 105                 110        

 

 

Leu Pro Glu Val Ala Pro His Pro Val Tyr Tyr Pro Ala Leu Glu Lys

        115                 120                 125            

 

 

Ile Leu Glu Leu Gly Arg His Ser Glu Cys Val His Val Thr Glu Glu

    130                 135                 140                

 

 

Glu Gln Leu Gln Leu Arg Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Tyr Glu His Glu Lys Asp Leu Val Trp Lys Leu Arg His Glu Val

                165                 170                 175    

 

 

Gln Glu His Phe Pro Glu Ala Leu Ala Arg Leu Leu Leu Val Thr Lys

            180                 185                 190        

 

 

Trp Asn Lys His Glu Asp Val Ala Gln Met Leu Tyr Leu Leu Cys Ser

        195                 200                 205            

 

 

Trp Pro Glu Leu Pro Val Leu Ser Ala Leu Glu Leu

    210                 215                 220