一种用于水稻品种鉴定的SNP芯片、制备方法及用途

摘要

本发明提供了一种用于水稻品种鉴定的SNP芯片，该芯片包含3072个分子标记，3072个SNP分子标记是SEQIDNO.0001~SEQIDNO.3072；本发明还提供一种上述SNP芯片的制备方法，包括步骤：从水稻栽培品种重测序数据获得SNP分子标记、对SNP分子标记进行筛选和采用筛选后的分子标记设计探针制作SNP芯片；本发明还提供上述SNP芯片在水稻品种真实性和身份鉴定中的应用。本发明提供的3072个SNP分子标记组合的应用将极大提高检测准确度、缩短检测时间、大幅提升我国水稻品种鉴定技术水平。

说明书

技术领域

本发明涉及一种SNP分子标记组成的芯片产品、制备方法及其在水稻品种鉴定中的应 用。

背景技术

水稻是我国最主要的农作物，对保障国家粮食安全起到举足轻重的作用。而种子则是粮 食生产的源头，种子分子特征是区别农作物品种的关键因素。随着分子标记技术的发展， DNA标记鉴别农作物品种，是开展品种鉴定、解决品种争议和授予新品种权的依据，也将 是促进种业有序竞争的有效手段。

品种分子鉴定是种业健康发展的必然要求：我国目前种子经营主体数量多，假冒伪劣种 子禁而不绝，套牌侵权问题突出，种子市场秩序比较混乱，严重侵害了农民和合法经营企业 的权益。种子鉴定是种子市场监管和品种审定准入的主要内容。2011年，《国务院关于加快 推进现代农作物种业发展的意见》明确提出，建立手段先进、监管有力的种子管理体系，严 厉打击套牌侵权、生产经营假劣种子行为，切实维护公平竞争的市场秩序。分子检测技术为 解决这一问题提供了有效的途径，可以破解管理技术瓶颈。加快分子检测技术的研发和应用， 是当前种子质量管理工作的一项重要而迫切的任务。

SNP鉴定技术是品种鉴定的发展趋势：品种分子检测技术主要有基于RAPD、AFLP、 SSR等标记技术。目前最成熟的快速鉴定方法是利用第二代分子标记SSR检测，2007年已 经颁布了农业行业标准(NY/T1433-2007)，并建立了一套基于SSR标记的水稻DNA指纹 检测技术体系和包含水稻授权品种及部分水稻审定品种的DNA指纹图谱数据库。但该方法 在实践过程中也暴露出检测的通量低、较难实现数据整合共享的缺陷，不适应今后品种快速 鉴定工作的需要。SNP(Single Nucleotide Polymorphism)指在基因组上单个核苷酸的变异 所形成的核酸序列多态性，是目前认为最具有研发潜力的检测技术，与SSR标记相比具有 以下优势：一是在基因组中分布密度更高更均匀；二是易实现数据整合比较；三是通量高， 检测位点数可达几百万个；四是部分标记与功能基因甚至植物表型相关。

国际植物新品种保护联盟(UPOV)于2010年发布了DNA分子标记选择和数据库构建 指南(简称BMT指南)，认为SSR和SNP标记是特别适用于品种鉴定的技术。近年来SNP 标记被研究者青睐，已成为国内外研究的热点。Illumina、Affymetrix等公司相继推出了SNP 基因分型高通量检测平台，为自动化和低成本的SNP芯片检测技术研发与应用提供了良好 的技术保障。SNP分子标记检测技术近年来被广泛应用于甜瓜、菜豆、甜椒等蔬菜分子辅 助育种及品种鉴定研究。杜邦先锋种子公司的种子检测从2007年开始已淘汰其他技术，完 全采用SNP检测技术，取得了良好成效。在国内，主要关注的是全基因组精细图谱的构建 以及关联分析和复杂性状研究等方面，而利用SNP标记对水稻品种进行分子鉴定方面正处 于初始研究阶段。建立基于SNP标记技术的水稻品种鉴定方法，可以进一步提高我国水稻 品种鉴定技术的规范化和标准化水平，填补国内关于此方面研究的空白。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于水稻品种鉴定的SNP芯片，能通过芯片上的分子 标记对水稻品种进行检测。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：所述SNP芯片包含3072个SNP分子 标记，所述3072个SNP分子标记是基于950份水稻栽培品种的序列比对筛选得到的，所述 3072个SNP分子标记是序列表中的SEQ ID NO.0001～SEQ ID NO.3072。

本发明所提供的SNP芯片命名为RiceID3072，本发明的芯片RiceID3072上的SNP位 点是指序列表中SEQ ID NO.0001～SEQ ID NO.3072所示的序列中方括号([])中的核苷酸。

本发明的另一个目的在于提供上述SNP芯片的制备方法。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：SNP芯片RiceID3072的制备方法，包含 以下步骤：

(1)通过基于950份水稻栽培品种重测序的数据获得800,000个SNP分子标记，所述 重测序的数据来源于网址www.ncgr.ac.cn/ricehap2；

(2)利用生物信息学软件Haploview对步骤(1)所获得的800,000个SNP分子标记根 据连锁不平衡筛选具有标记性的SNP(tagsnp)，得到10,000个SNP分子标记；

(3)根据步骤(2)所得到的10,000个SNP分子标记的缺失率、位点评分估值、多态 值和基因分布等，从中筛选了3072个分子标记用于制备水稻芯片；

(4)根据步骤(3)筛选的3072个分子标记设计探针制作SNP芯片。

本发明所提供的方案中，所述3072个SNP分子标记的物理位置是基于950份水稻栽培 品种的序列比对确定的，网址见www.ncgr.ac.cn/ricehap2；所述3072个SNP分子标记的序 列是SEQ ID NO.0001～SEQ ID NO.3072。

本发明还提供了上述SNP芯片在鉴定水稻品种真实性和鉴定水稻品种身份中的应用。

鉴定水稻品种的真实性时，利用所述SNP芯片检测并获得任意两个待测水稻样品基因 组DNA的3072个SNP分子标记基因型，进行比较从而鉴定待测和对照水稻样品为同一品 种或不同品种；鉴定水稻品种的身份时，利用所述SNP芯片检测并获得待测水稻样品基因 组DNA的3072个SNP分子标记基因型，与已知品种进行比较从而鉴定所述待测水稻样品 为哪个水稻品种；所述3072个分子标记的基因序列是序列表中的SEQ ID NO.0001～SEQ ID  NO.3072。

具体的比较方法通过如下方案来实现的：将不同水稻样品的3072个分子标记的基因型 进行比较后，根据公式(1)计算不同水稻样品的遗传相似度，若两个水稻样品在所述3072 个SNP分子标记的遗传相似度＞95％，则这两个样品属于同一品种；若所述遗传相似度≤ 95％，则这两个样品存在显著差异，不属于同一品种。所述95％为采用本发明的SNP芯片 进行水稻品种鉴定时，优选的遗传相似度阈值。

遗传相似度GS＝2Nij/(Ni+Nj)    公式(1)(Nei1979)

其中Nij为两个水稻样品共有的多态基因条带数，Ni为其中一个水稻样品的基因条带 数，Nj为另一个水稻样品的基因条带数。

本发明的有益效果是：本发明所提供的基于3072个SNP分子标记新组合基础上的SNP 芯片——RiceID3072可应用于水稻真实性检测及品种鉴定中；而且这3072分子标记组合的 应用可极大提高检测准确度、缩短检测时间、提高检测水平。这将为分子检测提供更有效、 可靠的技术手段；并将为水稻品种鉴定提供重要的技术支撑。

附加说明

图1为SNP位点(SEQ ID NO.0016)检测效果示意图；

图2为SNP位点(SEQ ID NO.0027)检测效果示意图；

图3为需剔除的SNP位点的检测效果示意图；

图4为需剔除的SNP位点的检测效果示意图；

图5为RiceID3072芯片上所有位点在全基因组上分布示意图；参照基因组为水稻第6 版本基因组序列(http://rice.plantbiology.msu.edu)，染色体上的每一条短线表示1个SNP位 点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：RiceID3072芯片的制备。

通过基于950份水稻栽培品种重测序的数据(见网址www.ncgr.ac.cn/ricehap2)获得 800,000个SNP分子标记；利用生物信息学软件(Haploview)根据连锁不平衡筛选具有标 记性的SNP(tagsnp)得到10,000个SNP分子标记；然后对每个位点根据以下特征进行进 一步筛选评估：(1)位点评估分值是否在0.6以上；(2)重复性是否在99％以上；(3)缺失 率是否低于3％；(4)是否为单拷贝；(5)不在转座子、重复区域等中；(6)位点上下60bp 以内不存在其他SNP；(7)基因组均匀分布。最终筛选了3072个分子标记，按照Illumina  Infinium iSelectHD要求设计探针制作芯片。所述3072个SNP分子标记的序列表如表1所示：

表1：

实施例2：RiceID3072芯片的使用

1、DNA提取

选取100份具有较强代表性的水稻品种的种子为实验材料，如表1所示，采用QIAGEN 的植物基因组抽提试剂盒按照标准流程抽提。

2、DNA质量检测

用核酸浓度测定仪和琼脂糖电泳分别检测所提取DNA的质量，保证提取的基因组DNA 均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；核酸浓度测 定仪检测A260/280介于1.8-2.0之间；A260/230介于1.8-2.0之间；DNA浓度＞50ng/μl；芯 片检测DNA用量200ng/每样品。将DNA浓度稀释到工作浓度50ng//μl。

3、芯片检测

按照Illumina Infinium基因芯片检测标准流程操作(Infinium HD Assay Ultra Protocol  Guide)。芯片扫描使用Illumina iScan芯片扫描仪。

4、数据分析

Illumina iScan扫描结果用GenomeStudio软件(http://www.illuina.com/)分析基因型， 得到100份水稻品种的3072个分子标记的基因条带。

表1100个水稻品种

实施例3：RiceID3072在水稻品种鉴定中的应用

一、RiceID3072检测水稻品种鉴定的判定标准的确定。

利用RiceID3072检测实施例2中的100份水稻品种中两两之间所述3072个SNP分子 标记的基因型，得到100份水稻品种各自具备的3072个基因条带，设定该100份水稻品种 中的任一个为待测样品，另一个为对照样品，比较待测样品和对照样品的所有基因条带，得 到待测样品和对照样品所共有的基因条带数。

利用公式(1)计算待测样品和对照样品之间的遗传相似度：

遗传相似度GS＝2Nij/(Ni+Nj)    公式(1)(Nei1979)

其中Nij为待测品种和对照样品共有的条带数，Ni为待测品种的条带数，Nj为对照品 种的条带数。举例说明：假如待测品种和对照样品的比较总位点数为3072个，差异的条带 数为100个，则所述待测品种和对照样品的遗传相似度为GS＝2(3072*2-100)/(3072*2+ 3072*2)＝98.37％。

经过上述比较和计算结果发现，这100份水稻品种中两两之间的遗传相似度均低于 95％，并且嘉育253和甬优12的100个单株的品种内遗传相似度均高于95％，因此可将95％ 作为水稻品种真实性鉴定的判断标准。

因此利用本专利进行水稻品种真实性检测或品种鉴定具体判断标准如下：

获得待测样品和对照样品在3072个SNP位点的基因型数据，并进行样品间数据比较， 得到遗传相似度。

(1)待测样品和对照样品间遗传相似度＞95％，结论为未检测到明显差异；

(2)待测样品和对照样品间遗传相似度≤95％，结论为未检测到明显差异。

二、利用RiceID3072进行品种真实性鉴定

以下将举例如何利用实施例1制备的SNP芯片来鉴别待测样品是否为已知对照水稻品 种南京3678。具体DNA提取和质量检测、芯片检测同实施例2，结果为，待测样品和作为 对照水稻品种南京3678的样品比较总位点数为3072个，差异的多态条带数为1682个，根 据公式(1)遗传相似度计算方法，两者的遗传相似度为：GS＝2(3072*2-1682)/(3072*2+ 3072*2)＝72.62％。

根据步骤一中的判断标准，鉴定待测水稻样品不是对照水稻品种南京3678。

采用目前我国正在使用的48个SSR标记进行品种鉴定的行业标准进行检测，进一步也 证实待测品种不是对照水稻品种南京3678。

三、利用RiceID3072进行品种身份鉴定

以下将举例如何利用实施例1制备的SNP芯片通过比对所述3072个SNP分子标记来 鉴别待测样品是否是某一已知水稻品种。具体DNA提取和质量检测、芯片检测同实施例2， 结果为，待测样品与已知所述3072个SNP分子标记水稻品种扬两优6号的遗传相似度最高， 为99.52％，根据步骤一中的判断标准，鉴定该待测样品为水稻品种扬两优6号。采用目前 我国正在使用的48个SSR标记进行品种鉴定的行业标准(NY/T 1433-2014)《水稻品种鉴 定SSR标记法》进行检测，进一步也证实待测品种是扬两优6号。

本发明所提供的基于3072个SNP分子标记新组合基础上的SNP芯片——RiceID3072 可应用于水稻品种鉴定；这3072个SNP分子标记组合的应用将极大提高检测准确度、缩短 检测时间、提高检测水平，为水稻品种推广、种子市场检测提供强有力的技术支撑，维护农 民权益，确保农业生产安全。