一种快速检测Ebola病毒的试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了一种快速检测Ebola病毒的试剂盒，旨在提供一种使用方法简单，可快速检测埃博拉病毒的试剂盒；其技术要点是：该试剂盒由下述步骤依次制备：1)在Nucleoprotein基因的保守区域设计逆转录、扩增引物和探针；2)在GAPDH基因的保守区域设计同时使用的逆转录引物和探针；3)制备RT-TaqMan试剂盒；属于基因检测技术领域。

说明书

技术领域

本发明公开了一种试剂盒及其使用方法，具体地说，是一种快速检测Ebola病毒的试剂盒及其使用方法，属于基因检测技术领域。 

背景技术

埃博拉病毒(EBOV)是引起人类和灵长类动物发生埃博拉出血热(EBHF)的烈性病毒，研究人员在对塞拉利昂最早的埃博拉病例基因研究后宣称，该病毒在人际传播过程中出现了超过300个基因变化，这可能令当前开发中的诊断测试和试验性治疗的效果受到影响。Nucleoprotein(NP)是埃博拉病毒的一个核蛋白基因。 

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种使用方法简单，可快速检测埃博拉病毒的试剂盒。 

为解决上述技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：该快速检测Ebola病毒的试剂盒，由下述步骤依次制备： 

1)在Nucleoprotein基因的保守区域设计逆转录引物、扩增引物和探针： 

NP_F:AGAGGAGACAACTGAAGCTAATGC； 

NP_R:CTGATTGCCAAGCTGTTGGA； 

NP-Probe：FAM-CAAGTCTATTCCTTCCGAAATTGGTAGTAG； 

2)在GAPDH基因的保守区域设计逆转录引物和探针： 

GAPDH_F：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC； 

用于逆转录引物为GAPDH_R_R:CAAGGGGTCTACATGGCAACT； 

用于扩增GAPDH_ARMS_R的引物为：GGTGGAATCATATTGGAACATGT； 

GAPDH_Prob_HEX：HEX-CTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCC； 

3)制备RT-TaqMan试剂盒 

用逆转录酶加上罗氏的热启动酶，其反应条件如下：50℃ 20分钟；40个循环：95℃ 5秒，56℃ 10秒，72℃ 30秒。 

上述的快速检测Ebola病毒的试剂盒，所述的逆转录酶与罗氏的热启动酶的用量比为1:1。 

本发明还提供了该快速检测Ebola病毒试剂盒的使用方法，该依次包括下述步骤： 

取Ebola virus病毒感染的细胞，提取RNA，用上述试剂盒检测Ebola virus病毒RNA。 

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点： 

本发明以Nucleoprotein为靶基因，设计一步逆转录加Real time PCR扩增这个基因的保守区段，针对这个扩增片段的探针用FAM标记。同时引入内参GAPDH，用ARMS的方法设计扩增GAPDH的DNA片段，针对这个扩增片段的探针用HEX标记。该试剂盒使用方法简单，可快速检测埃博拉病毒。、 

附图说明

图1是本发明提供的试剂盒检测Ebola virus病毒的结果示意图。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。 

实施例1 

本发明提供的一种快速检测Ebola病毒的试剂盒，该试剂盒以Nucleoprotein为靶基因，设计一步逆转录加Real time PCR扩增这个基因的保守区段，针对这个扩增片段的探针用FAM标记。同时引入内参GAPDH，用ARMS的方法设计扩增GAPDH的DNA片段，针对这个扩增片段的探针用HEX标记。 

该试剂盒通过下述步骤制备： 

1、逆转录、扩增Nucleoprotein靶基因的引物设计和探针设计。 

在Nucleoprotein基因的保守区域设计可以同时使用的逆转录、扩增的引物。 

NP_F:AGAGGAGACAACTGAAGCTAATGC； 

NP_R:CTGATTGCCAAGCTGTTGGA； 

NP-Probe：FAM-CAAGTCTATTCCTTCCGAAATTGGTAGTAG。 

2、逆转录、扩增人GAPDH靶基因的引物设计和探针设计。 

在GAPDH基因的保守区域设计可以同时使用的逆转录的引物。 

GAPDH_F：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC，这个引物和荧光定量PCR扩增的Forward引物一样。 

用于逆转录的引物为GAPDH_R:CAAGGGGTCTACATGGCAACT， 

用于扩增GAPDH_ARMS_R的引物为：GGTGGAATCATATTGGAACATGT， 

GAPDH_Prob_HEX：HEX-CTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCC。 

3.RT-TaqMan试剂盒反应条件。 

这个试剂盒用逆转录酶(即Superscrip reverse transcriptase)加上罗氏的热启动酶(即金牌酶)。反应条件如下：50℃ 20分钟；40个循环：95℃ 5秒，56℃ 10秒，72℃ 30秒。 

取Ebola virus病毒感染的细胞。提取RNA，用RT-TaqMan试剂(即本发明提供的试剂盒)检测Ebola virus病毒RNA，其中：FAM通道检测Ebola virus，HEX通道检测内参GAPDH。 

反应体系如下： 

RNA(50ng/ul) 2ul GAPDH_F 0.5ul GAPDH_R 0.5ul NP_F 0.5ul NP_R 0.5ul 5×Reaction buffer 4ul RNase inhibitor(20u/ul) 1ul 10mM dNTP Mix 2ul Superscrip reverse transcriptase(200u/ul) 1ul Water,nuclease-free 8ul   20ul

42℃ 60min反应之后，75℃ 5min终止反应。 

PCR反应体系如下： 

cDNA 2ul GAPDH_F 0.5ul GAPDH_ARMS_R 0.5ul GAPDH_Prob_HEX 0.2ul NP_F 0.5ul NP_R 0.5ul

[0045] 

NP-Probe 0.2ul 10×PCR buffer 2ul 10mM dNTP Mix 1ul 2mM Mgcl2 3ul 金牌酶(5u/ul) 0.5ul Water,nuclease free 9.1ul   20ul

95℃ 2min预变性，然后是95℃ 15s,60℃ 30s,40个循环。 

结果显示如图1：Ebola virus病毒和内参GAPDH能够很好的扩增出来。其中CT值比较大的是GAPDH.。