产生纤维素酶的新真菌株以及用其进行糖化的方法

摘要

本发明涉及新真菌株黄伞(Pholiota adiposa)SKU714；用于从所述真菌株生产纤维素酶的方法；以及使用所产生的纤维素酶用于糖化纤维素的方法。由本发明的真菌株产生的纤维素酶显示出比现有的糖化酶更好的糖化产量，因此所述纤维素酶可用在各种应用中，包括生物能源生产、纺织工业、造纸工业、洗涤剂工业、动物饲料工业和食品工业。

说明书

技术领域

本发明涉及新菌株黄伞(Pholiota adiposa)SKU714，用于从所述 菌株产生纤维素酶的方法，以及使用所产生的纤维素酶用于糖化纤维 素的方法。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的有机物质。它是可再生资源，因而无需 担心像石油或煤一样枯竭。然而，纤维素多数作为农林废弃物被丢弃， 这被视为是环境污染的主要原因。每年在世界范围内产生超过三十亿 吨的农林废弃物，仅在亚洲就产生多于8亿吨。

因为农林废弃物主要由纤维素和半纤维素组成，如果它们可以通 过糖化被转化为包括葡萄糖在内的单糖，这可能对于解决食品、燃料 和环境问题有极大的帮助。

作为从农林废弃物中回收单糖的普通方法，已知加入硫酸并在高 温高压下进行糖化的方法。然而，这种方法的问题在于：必须使用能 够耐受强酸和高压的昂贵的设备；因为产生各种副产品而难以分离和 回收单糖；因需要处理副产品而生产成本高以及相关的过程是环境不 友好的。因为普通糖化方法被限制用于商业应用，所以已经在可以取 代普通糖化方法的更加环境友好的纤维素糖化方法上进行了研究。在 这方面，已经开发出各种糖化酶并将其商业化用于各种工业领域。此 外，正在积极研究其应用。作为糖化酶，纤维素酶广泛用于纺织、造 纸、洗涤剂和饲料工业。另外，其用于低热量食品的生产、食品废物 的发酵等。

植物的细胞壁是由诸如纤维素(不溶性β-1,4-葡聚糖纤维)、半纤 维素(非纤维素基的多糖)和木质素(复合多酚多糖)的聚合物所组 成。在这些成分中，纤维素以最高量存在，其次是半纤维素和木聚糖 作为主要组份。两种成分占总的植物生物量的50％以上。纤维素是由 β-1,4键连接的葡萄糖单元的均聚物。为将其分解为单糖，三种类型的 酶是必要的，即内切β-1,4-葡聚糖酶(内切β-1,4-)[EC 3.2.1.4]、外切 β-1,4-葡聚糖酶[EC 3.2.1.91]和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶随机地从内 侧切割β-1,4葡萄糖键，以及外切葡聚糖酶在非还原端进行切割将葡聚 糖分解成二糖纤维二糖。纤维二糖最终通过β-葡糖苷酶分解为葡萄糖。

纤维素酶大多数使用霉菌(真菌)生产。具体地，使用曲霉属 (Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)进行工业化生产纤维素酶。虽 然里氏木霉ZU-02(Trichoderma reesei ATCC 56764)已作为代表性的 产生纤维素酶的菌株被深入地研究，其酶浓度和活性都不足以充分满 足工业需求。例如，虽然从生物质来生产乙醇的过程在资源的回收利 用、生产燃料的环境友好等方面具有许多优势，从木质纤维素物质生 产乙醇与汽油生产相比更加昂贵。在乙醇生产过程中，产生糖化酶的 成本占了总生产成本的大约60％。

因此，对纤维素的有效糖化过程存在强烈的需求，特别是对使用 新菌株的环境友好的纤维素糖化过程。

发明内容

技术问题

为解决上述现有技术的问题进行本发明。

本发明针对提供显示高活性的产生纤维素酶的新菌株。

本发明还针对提供使用所述菌株来产生纤维素酶的方法。

本发明还针对提供使用所述纤维素酶用于糖化纤维素的方法。

技术方案

在一方面，本发明提供产生纤维素酶的黄伞SKU714(登记号 KCCM 11187P)菌株。

另一方面，本发明提供用于产生纤维素酶的方法，包括培养黄伞 SKU714(登记号KCCM 11187P)。

在根据本发明的用于产生纤维素酶的方法中，可使用含有玉米浆 粉(5～10g/L)、酵母提取物(1～5g/L)、磷酸二氢钾(3～7g/L)、 磷酸氢钾(3～7g/L)、七水硫酸酶(1～5g/L)、盐酸硫胺素(0.01～0.03 g/L)和碳源(10～30g/L)的pH 4.5～5.5的介质来进行培养。

在根据本发明的用于产生纤维素酶的方法中，碳源可选自纤维素、 纤维二糖、稻草和微晶纤维素。

在根据本发明的用于产生纤维素酶的方法中，可在100-200rpm的 搅拌速率、0.8～1.2vvm的通气速率和25至30℃的培养温度的条件下 进行培养。

在另一方面，本发明提供使用由黄伞SKU714菌株产生的纤维素 酶来糖化纤维素的方法。

在根据本发明的用于糖化纤维素的方法中，可在5～25wt％的基质 浓度、1～45FPU/g基质的纤维素酶浓度、pH 4～7和50～80℃的温度的 条件下进行糖化。

在根据本发明的用于糖化纤维素的方法中，白杨、稻草或其混合 物可用作纤维素源或基质。

有益效果

根据本发明的新菌株黄伞SKU714，其从伞菌中分离出，产生高活 性的纤维素酶。

因为由根据本发明的新菌株所产生的纤维素酶显示出比现有的糖 化酶更好的糖化产量，其可用在各种应用中，包括生物能源生产、纺 织工业、造纸工业、洗涤剂工业、饲料工业、食品工业、低热量食品 的生产、食品废物的发酵等。

附图说明

图1显示对本发明菌株的ITS-5.8S rDNA序列和类似物种之间的 遗传关系进行分析的结果。

图2a显示随着培养时间推移，通过每单位酶量的黄伞SKU714菌 株分解滤纸来测量β-葡糖苷酶活性(-●-)、纤维二糖水解酶活性(-○-)、 内切葡聚糖酶活性(-▲-)和葡萄糖产量(-Δ-)的结果。

图2b显示随着培养时间推移，测量黄伞SKU714菌株的木聚糖酶 活性(-●-)、漆酶活性(-○-)、甘露聚糖酶活性(-▲-)和木质素过氧 化物酶活性(-Δ-)的结果。

图3a显示黄伞SKU714菌株产生的β-葡糖苷酶的活性依赖于pH。

图3b显示由黄伞SKU714菌株产生的β-葡糖苷酶的活性依赖于温 度。

具体实施方式

本发明通过实施例得以更详细地描述。然而，本发明的范围不为 实施例限制。

实施例1：筛选产生纤维素酶的菌株

为筛选产生纤维素酶的菌株，将10μL的伞菌培养物悬浮在10mL 的生理盐水中。将10μL的所得悬浮物(1x10⁴cfu mL^-1)平铺在含2％ 的羧甲基纤维素的马铃薯葡萄糖琼脂，并在27℃孵育3天。在固体琼 脂培养基上形成菌落后，使用0.1％的刚果红将平皿染色，然后用1M 氯化钠进行脱色。然后，通过选择具有由水解纤维素而在菌落周围产 生晕圈的菌落来筛选生产纤维素酶的伞菌菌株。

通过这种方法来筛选初步菌株(S1-S6)。使用现有的生产菌株里 氏木霉ZU-02作为对照(C)，在含有羧甲基纤维素的固体琼脂培养基 上进行测试之后，从筛选出菌株中选择出显示最好纤维素降解能力的 S4菌株。

实施例2：鉴定菌株

为鉴定在实施例1中筛选出的S4菌株，由韩国微生物培养中心对 ITS-5.8S rDNA序列进行分析。S4菌株的ITS-5.8S rDNA序列命名为 SEQ ID NO：1。

作为分析S4菌株的ITS-5.8S rDNA序列与类似物种之间遗传关系 的结果，所述S4菌株鉴定为黄伞(图1)。

所述S4菌株命名为“黄伞SKU714(Pholiota adiposa SKU714)” 并在布达佩斯条约下于2011年4月20日以登记号KCCM 11187P保藏 在韩国微生物培养中心。

实施例3：介质的最优化以生产纤维素酶

(1)纤维素酶的活性依赖于碳源

在7-L发酵罐中测试黄伞SKU714菌株产生纤维素酶的活性依赖 于碳源。纤维素、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、羧甲基纤维素、 蔗糖、木聚糖、稻秆和微晶纤维素用作碳源。

将黄伞SKU714菌株接种在含有50mL全培养介质(马铃薯淀粉 4g/L、右旋糖20g/L)的50mL烧瓶中后，将菌株在摇床中以150rpm 在25℃培养5天。将50mL培养物接种在含有生长介质(玉米浆粉为 8g/L、酵母提取物2g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢钾5g/L、七水硫 酸镁3g/L、盐酸硫胺素0.02g/L和碳源为20g/L、pH5)的50ml的烧 瓶中，在150rpm、25℃和pH5中培养7天。

对每种碳源测量黄伞SKU714菌株的β-葡糖苷酶活性和葡萄糖生 产的结果示于表1中。

表1

从表1可见，当纤维素、纤维二糖、稻秆和微晶纤维素用作碳源 时取得优异的纤维素酶活性。当纤维素用作碳源时取得最大的纤维素 酶活性。

(2)纤维素酶活性依赖于氮源

在7-L发酵罐中测试黄伞SKU714菌株产生纤维素酶的活性依赖 于氮源。酵母提取物、蛋白胨、玉米浆粉、尿素、硫酸铵、硝酸钾、 硝酸钠和胰蛋白胨用作氮源。

对在5g/L浓度的每种碳源测量黄伞SKU714菌株的β-葡糖苷酶活 性和葡萄糖生产的结果显示在表2中。

表2

如从表2可见，当酵母提取物、玉米浆粉和胰蛋白胨用作氮源时， 取得优异的纤维素酶活性。当酵母提取物用作氮源时，取得最大的纤 维素酶活性。

实施例4：最优化培养条件用于产生高活性的酶

(1)当白杨被用作基质时培养条件的最优化

使用含有玉米浆粉(8g/L)、酵母提取物(2g/L)、磷酸二氢钾 (5g/L)、磷酸氢钾(5g/L)、七水硫酸镁(3g/L)、盐酸硫胺素(0.02 g/L)和白杨(20g/L)的介质在7L发酵罐中，最优化培养条件。在 pH由3变化至7以及培养温度从20变化至35℃时比较纤维素酶活性。 在pH 5和25-30℃时取得最大的纤维素酶活性。

此外，在最优化的培养条件下(pH5，25℃)中在含有白杨基质的 介质中测量随着培养时间推移的每种纤维素酶的活性(图2a和2b)。 图2a显示，通过随着培养时间推移，测量通过每单位酶量分解滤纸的 β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的活性和葡萄糖生产的结 果。图2b显示，随着培养时间推移，测量木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖 酶和木质素过氧化物酶中活性变化的结果。

(2)当稻草用作基质时纤维素酶生产和活性的最优化

使用含有玉米浆粉(8g/L)、酵母提取物(2g/L)、磷酸二氢钾 (5g/L)、磷酸氢钾(5g/L)、七水硫酸镁(3g/L)、盐酸硫胺素(0.02 g/L)和稻草(20g/L)的介质在7L发酵罐中对培养条件进行最优化。 在pH由3改变至7以及培养温度从20改变至35℃时比较纤维素酶生 产。在pH 5和25～30℃时取得最大的纤维素酶生产。

此外，在pH由3变化至7.5和温度从40改变至85℃时比较β-1,4- 葡糖苷酶活性。结果显示在图3a和3b中。由图3a和3b可见，在pH 5 和65℃取得最大纤维素酶的活性。

实施例5：糖化产量的分析

一般而言，包含在植物中的木质纤维素仅使用酶促水解不可能以 高产量被糖化。出于这个原因，为增加通过纤维素酶的纤维素水解效 率，在酶促水解之前通过预处理方法将木质素和半纤维素片段化。在 实施例5中，对于预处理，将10g稻草加入到含有40ml的2wt％的氢 氧化钠溶液的烧瓶中，在85℃下反应1小时。然后，通过0.45uM的 过滤器将稻草过滤，在65℃干燥。

为了找到最优化的糖化条件，在改变酶浓度、基质浓度、反应温 度和反应pH时进行实验。

首先，将在各种浓度经预处理的稻草和各种浓度的纤维素酶加入 到20mL的0.1M的醋酸钠缓冲液(pH5.0)中。在15-55℃中以150rpm 反应72小时后，将反应混合物在100℃煮沸3分钟以除去变性的酶， 然后将其冷却至室温，在4000rpm下离心15分钟。从上清液中通过还 原糖法测量酶活性。

通过测量在105℃干燥24小时后每克稻草的重量减少，根据式1 来确定糖化产量。

【式1】

糖化产量(％)＝[(产生的还原糖的重量/g基质)x0.9/稻草中碳 水化合物的重量]x100

(1)糖化产量依赖于酶浓度

当改变酶浓度时，在65℃和pH 6时使用黄伞SKU714菌株进行 糖化。结果显示在表3中。

表3

酶浓度(FPU/g基质) 糖化产量(％) 1 9.7

5 23.9 17.5 83.0 30 81.2 42.5 80.6

由表3可见，在酶浓度为15-45FPU/g基质时取得最佳糖化产量。

(2)糖化产量依赖于基质浓度

对基质浓度在由黄伞SKU714菌株产生的糖化酶进行的白杨糖化 上的效果进行调查。当白杨基质的初始浓度从1变化至27wt％时测量 糖化产量。结果显示在表4中。

表4

基质浓度(wt％) 糖化产量(％) 1 43.0 2 63.5 11 81.2 20 83.1 27 51.0

由表4可见，当白杨基质的初始浓度是10～25wt％时取得优异的 糖化产量。当白杨浓度是20wt％时取得最佳糖化产量。

(3)糖化产量依赖于温度

对温度在通过由黄伞SKU714菌株产生的糖化酶进行的白杨糖化 上的效果进行调查。在20、35、50、65和80℃的不同反应温度下测量 糖化产量。结果显示在表5中。

表5

反应温度(℃) 糖化产量(％) 20 33.2 35 45.0 50 75.8 65 82.1 80 71.2

由表5可见，当糖化温度是50～80℃时取得优异的糖化产量。在 65℃时取得最佳糖化产量。

(4)糖化产量依赖于pH

对pH在由黄伞SKU714菌株产生的糖化酶进行的白杨糖化上的效 果进行调查。在1、3、5、7和9的不同反应pH处测量糖化产量。结 果显示在表6中。

表6

pH 糖化产量(％) 1 20.0 3 62.6 5 81.4 7 84.0 9 39.4

由表6可见，在pH 4～7时取得优异的糖化产量。在pH 7时取得 最佳糖化产量。

实施例6：在最优化的条件下糖化

(1)使用黄伞纤维素酶进行的白杨糖化

使用由黄伞SKU714菌株产生的纤维素酶在最优化条件下进行白 杨的糖化。在基质浓度10wt％、酶浓度25FPU/g基质、pH6和温度 65℃的条件下进行糖化。由黄伞SKU714菌株产生的纤维素酶的糖化 产量与源自里氏木霉的诺维信纤维素酶(Celluclast 1.5L)的糖化产量 在表7中进行比较。

表7

纤维素酶 糖生产(mg/g白杨) 糖化产量(％) 黄伞SKU714 672 84 Celluclast 1.5L 242 35

(2)使用黄伞纤维素酶的稻草糖化

使用由黄伞SKU714菌株产生的纤维素酶在最优化的条件下进行 稻草的糖化。在基质浓度10wt％、酶浓度16FPU/g基质、pH6和温度 65℃的条件下进行糖化24小时。由黄伞SKU714菌株产生的纤维素酶 的糖化产量与源自里氏木霉的诺维信纤维素酶(Celluclast 1.5L)的糖 化产量以及源自滑菇(Pholiota nameko)KTCC26163菌株的纤维素酶 的糖化产量在表8中进行比较。

表8

纤维素酶 糖生产(mg/g稻草) 糖化产量(％) 黄伞SKU714 690 88 里氏木霉 582 76 滑菇 420 56

虽然滑菇和黄伞菌株属于相同伞菌属(Pholiotasp.)，它们显示出完 全不同的纤维素糖化效果。然而由于低蛋白生产力和低酶活性，对于 用作糖化酶，滑菇菌株则受到限制，由于生产各种生物质降解酶包括 纤维素酶、高蛋白质生产力、高酶活性和良好的热稳定性，根据本发 明的黄伞菌株适用于商业应用。

【登记号】

保藏机构：韩国微生物培养中心(国外)

登记号:KCCM 11187P

等级日期:20110420

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

保藏机构证明

遵照细则7.1

致：李正杰

地址：韩国，首尔143-701，华阳洞，广津区，化学工程部门

BP/4(KCTC表格17)