一种离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法

摘要

本发明涉及一种离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法，该方法包括以下步骤：⑴每年5~7月份取柴达木枸杞优株上的当年生嫩枝，并将叶片去除，用流水冲洗干净后，将枝条剪段后漂洗、消毒即得无菌茎段；⑵将无菌茎段作为外植体接种在预培养基中培养，即得预培养的茎段外植体；⑶预培养的茎段外植体转接入侧芽诱导培养基中培养，即得新形成的侧芽；⑷将新形成的侧芽剪下转接入不定苗分化培养基中培养，3~4周后即得不定苗；⑸将生长至1~2cm的不定苗转入增殖培养基培养4周即可。本发明操作简单并能保持母本性状。

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法。

背景技术

枸杞(Lycium barbarum Mill.)为茄科(Solanaceae) 枸杞属(Lycium) 多年生落叶灌木，果实称枸杞子，根皮称地骨皮，均可入药，嫩茎、叶可做蔬菜。枸杞子具有明目润肺、免疫调节、抗脂肪肝、降血糖血脂、抗衰老及改善老年人器官衰退等老化疾病的功效。柴达木盆地枸杞资源丰富，是枸杞的新兴产区，所产的柴达木枸杞是青海著名的道地地产药材的原植物之一，“柴杞”也是国内最优质的枸杞之一。在柴达木盆地种植枸杞不仅可以调节农业产业结构，还可以提高柴达木盆地的植被覆盖率，改善区域小气候，防治土地沙化，对生态保护和退化生态环境的恢复具有重要作用。

在生产上枸杞主要靠无性扦插繁育，占地面积大、繁殖效率低，不利于优良品种的快速扩大。同时，枸杞病毒分布广泛、危害大，主要枸杞病毒（Lyciumvirus）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）等。病株全株发育不良，叶片变小、畸形皱缩。长期的无性扦插繁殖使病毒在植株母体中积累，通过扦插会感染种苗，不利于优质种苗繁育，后期的种植中病毒病蔓延和爆发影响枸杞的产量和品质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单并能保持母本性状的离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法，包括以下步骤：

⑴每年5~7月份取柴达木枸杞优株上的当年生嫩枝，并将叶片去除，用流水冲洗干净后，将枝条剪为长度为3~4cm的小段，然后在超净工作台上用体积浓度为70%~75%的酒精漂洗，10~30s后再用质量浓度为0.1%~0.2%的升汞消毒8~10min，最后用无菌水冲洗4~6遍，即得无菌茎段；

⑵将所述无菌茎段作为外植体按5段/瓶的接种量接种在预培养基中，在温度为20~25℃且光照条件下培养1~2周，即得预培养的茎段外植体；

⑶所述预培养的茎段外植体按5段/瓶的接种量转接入侧芽诱导培养基中，在温度为20~25℃且光照条件下培养3~4 周，侧芽形成并生长至1cm，即得新形成的侧芽；

⑷将所述新形成的侧芽剪下，按5个/瓶的接种量转接入不定苗分化培养基中，在温度为20~25℃且光照条件下进行分化培养，3~4周后即得不定苗；

⑸将生长至1~2cm的所述不定苗按5株/瓶的接种量转入增殖培养基，在温度为20~25℃且光照条件下培养4周即可。

所述步骤⑵中的预培养基是指每升 MS基本培养基中添加0.01~2.0mg生长素、20.0~60.0g蔗糖、3~8 g琼脂粉，且pH值为5~6.5的培养基。

所述步骤⑶中的侧芽诱导培养基是指每升 MS基本培养基中添加有0.05~3.0mg细胞分裂素、0.05~1.0mg生长素、200~400mg水解酪蛋白、100~300mg肌醇、1~3mg Vc、2~6mg柠檬酸钠、20.0~60.0g蔗糖、3~8g琼脂粉，且pH值为5~6.5的培养基。

所述步骤⑷中的不定苗分化培养基是指每升 MS基本培养基中添加有1.0~3.0mg细胞分裂素、0.01~0.5mg生长素、200~400mg水解酪蛋白、100~300mg肌醇、1~3mg Vc、2~6mg柠檬酸钠、20.0~60.0g蔗糖、3~8g琼脂粉，且pH值为5~6.5的培养基。

所述步骤⑸中的增殖培养基是指每升 MS基本培养基中添加有1.0~2.0mg细胞分裂素、0.05~0.2mg生长素、200~400mg水解酪蛋白、100~300mg肌醇、20.0~60.0g蔗糖、3~8g琼脂粉，且pH值为5~6.5的培养基。

所述步骤⑵、所述步骤⑶、所述步骤⑷、所述步骤⑸中的光照条件均是指光照强度为3000~10000Lux，光照时间为12~16h/天。

所述生长素为2,4-D、NAA、IAA 中的一种。

所述细胞分裂素为6-BA、KT、ZT 中的一种。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明以优良性状的柴达木枸杞植株的当年生嫩茎为外植体，通过茎段灭菌、茎段预培养、侧芽诱导、不定苗分化等各阶段建立离体条件下不定苗分化体系，为下一步柴达木枸杞优质品种的快繁体系的建立提供物质基础。

2、由于本发明中采用不同培养基对无菌茎段先进行预培养和侧芽诱导（参见图1~4），因此，能够快速诱导柴达木枸杞不定苗的分化和增殖，使得在短时间内能够获得大量不定苗。

3、由于本发明由枸杞茎段上的侧芽直接诱导形成不定苗，因此，步骤简化、操作简单，并能最大程度的保持母本优良性状。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明中枸杞茎段外植体侧芽诱导培养照片；经过预培养的茎段在侧芽诱导培养基上快速形成侧芽。

图2为本发明中枸杞茎段上侧芽剪下转入不定苗分化培养照片；在分化培养基上培养2周后侧芽基部或叶腋处不定芽开始形成。

图3为本发明中枸杞侧芽在离体条件下培养3~4周后不定苗形成并生长至1~2cm高的照片；每侧芽外植体上可分化不定苗3~8株。

图4为本发明中枸杞不定苗的增殖培养照片；不定苗转入增殖培养基中不定苗不断分化，其增殖频率可以达到1:3~10。

具体实施方式

实施例1     一种离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法，包括以下步骤：

⑴每年5月份取柴达木枸杞优株上的当年生嫩枝，并将叶片去除，用流水冲洗干净后，将枝条剪为长度为3~4cm的小段，然后在超净工作台上用体积浓度为70%的酒精漂洗， 30s后再用质量浓度为0.1%的升汞消毒10min，最后用无菌水冲洗4遍，即得无菌茎段。

⑵将无菌茎段作为外植体按5段/瓶的接种量接种在预培养基中，在温度为20℃且在光照强度为3000Lux、光照时间为16h/天的光照条件下培养1 周，即得预培养的茎段外植体。

其中：预培养基是指每升 MS基本培养基中添加有0.01mg 2,4-D、20.0g蔗糖、8g琼脂粉，且pH值为5的培养基。

⑶预培养的茎段外植体按5段/瓶的接种量转接入侧芽诱导培养基中，在温度为20℃且在光照强度为3000Lux、光照时间为16h/天的光照条件下培养3周，侧芽形成并生长至1cm，即得新形成的侧芽。

其中：侧芽诱导培养基是指每升 MS基本培养基中添加有3.0mg 6-BA、1.0mg 2,4-D、200mg水解酪蛋白、100mg肌醇、1mg Vc、2mg柠檬酸钠、20.0g蔗糖、8 g琼脂粉，且pH值为5的培养基。

⑷将新形成的侧芽剪下，按5个/瓶的接种量转接入不定苗分化培养基中，在温度为20℃且在光照强度为3000Lux、光照时间为16h/天的光照条件下进行分化培养，3周后即得不定苗。其形成频率为每外植体上3~8株。

其中：不定苗分化培养基是指每升 MS基本培养基中添加有1.0mg 6-BA、0.5 mg 2,4-D、200mg水解酪蛋白、100mg肌醇、20.0g蔗糖、8 g琼脂粉，且pH值为5的培养基。

⑸将生长至1~2cm的不定苗按5株/瓶的接种量转入增殖培养基，在温度为20℃且在光照强度为3000Lux、光照时间为16h/天的光照条件下培养4周即可。其增殖频率最高可以达到1：10。

其中：增殖培养基是指每升 MS基本培养基中添加有1.0mg 6-BA、0.05mg 2,4-D、200mg水解酪蛋白、100mg肌醇、20.0g蔗糖、8 g琼脂粉，且pH值为5的培养基。

实施例2     一种离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法，包括以下步骤：

⑴每年7月份取柴达木枸杞优株上的当年生嫩枝，并将叶片去除，用流水冲洗干净后，将枝条剪为长度为3~4cm的小段，然后在超净工作台上用体积浓度为75%的酒精漂洗，10s后再用质量浓度为0.2%的升汞消毒8min，最后用无菌水冲洗6遍，即得无菌茎段。

⑵将无菌茎段作为外植体按5段/瓶的接种量接种在预培养基中，在温度为25℃且在光照强度为10000Lux、光照时间为12h/天的光照条件下培养2 周，即得预培养的茎段外植体。

其中：预培养基是指每升 MS基本培养基中添加有2.0mg NAA、60.0g蔗糖、3 g琼脂粉，且pH值为6.5的培养基。

⑶预培养的茎段外植体按5段/瓶的接种量转接入侧芽诱导培养基中，在温度为25℃且在光照强度为10000Lux、光照时间为12h/天的光照条件下培养4周，侧芽形成并生长至1cm，即得新形成的侧芽。

其中：侧芽诱导培养基是指每升 MS基本培养基中添加有0.05mg KT、0.05mg NAA、400mg水解酪蛋白、300mg肌醇、3mg Vc、6mg柠檬酸钠、60.0g蔗糖、3g琼脂粉，且pH值为6.5的培养基。

⑷将新形成的侧芽剪下，按5个/瓶的接种量转接入不定苗分化培养基中，在温度为25℃且在光照强度为10000Lux、光照时间为12h/天的光照条件下进行分化培养，4周后即得不定苗。其形成频率为每外植体上2~8株。

其中：不定苗分化培养基是指每升 MS基本培养基中添加有3.0mg KT、0.01mg NAA、400mg水解酪蛋白、300mg肌醇、60.0g蔗糖、3g琼脂粉，且pH值为6.5的培养基。

⑸将生长至1~2cm的不定苗按5株/瓶的接种量转入增殖培养基，在温度为25℃且在光照强度为10000Lux、光照时间为12h/天的光照条件下培养4周，其增殖频率最高为1：8。

其中：增殖培养基是指每升 MS基本培养基中添加有2.0mg KT、0.2 NAA、400mg水解酪蛋白、300mg肌醇、60.0g蔗糖、3g琼脂粉，且pH值为6.5的培养基。

实施例3     一种离体条件下柴达木枸杞不定苗诱导的方法，包括以下步骤：

⑴每年6月份取柴达木枸杞优株上的当年生嫩枝，并将叶片去除，用流水冲洗干净后，将枝条剪为长度为3~4cm的小段，然后在超净工作台上用体积浓度为73%的酒精漂洗，20s后再用质量浓度为0.15%的升汞消毒9min，最后用无菌水冲洗5遍，即得无菌茎段。

⑵将无菌茎段作为外植体按5段/瓶的接种量接种在预培养基中，在温度为22℃且在光照强度为6000Lux、光照时间为14h/天的光照条件下培养1.5 周，即得预培养的茎段外植体。

其中：预培养基是指每升 MS基本培养基中添加有1.0mg IAA、40.0g蔗糖、4.5g琼脂粉，且pH值为6.0的培养基。

⑶预培养的茎段外植体按5段/瓶的接种量转接入侧芽诱导培养基中，在温度为22℃且在光照强度为6000Lux、光照时间为14h/天的光照条件下培养3.5周，侧芽形成并生长至1cm，即得新形成的侧芽。

其中：侧芽诱导培养基是指每升 MS基本培养基中添加有1.5mg ZT、0.5mg IAA、300mg水解酪蛋白、200mg肌醇、2mg Vc、4mg柠檬酸钠、40.0g蔗糖、4.5 g琼脂粉，且pH值为6.0的培养基。

⑷将新形成的侧芽剪下，按5个/瓶的接种量转接入不定苗分化培养基中，在温度为22℃且在光照强度为6000Lux、光照时间为14h/天的光照条件下进行分化培养，3.5周后即得不定苗。其形成频率为每外植体上1~6株。

其中：不定苗分化培养基是指每升 MS基本培养基中添加有2.0mg ZT、0.25mg IAA、300mg水解酪蛋白、200mg肌醇、40.0g蔗糖、4.5 g琼脂粉，且pH值为6.0的培养基。

⑸将生长至1~2cm的不定苗按5株/瓶的接种量转入增殖培养基，在温度为22℃且在光照强度为6000Lux、光照时间为14h/天的光照条件下培养4周。其增殖频率为1：6。

其中：增殖培养基是指每升 MS基本培养基中添加有1.5mg ZT、 0.1mg IAA、300mg水解酪蛋白、200mg肌醇、40.0g蔗糖、4.5 g琼脂粉，且pH值为6.0的培养基。