快速高效提取卡柏林类生物碱的方法

摘要

一种从植物药材中提取卡柏林类生物碱的方法，包括(1)选取的药材用乙醇浸泡，渗漉提取，减压浓缩后得乙醇浸膏，所得到的乙醇浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取处理；(2)将乙酸乙酯萃取层和/或正丁醇萃取层用硅胶柱层析进行粗提取，洗脱剂选自氯仿-甲醇体系、石油醚-丙酮体系和石油醚-乙酸乙酯体系，以TLC薄层色谱法进行追踪；(3)将粗提取物以MCI gel CHP-20P柱层析分离，以TLC薄层色谱法进行追踪；(4)将(3)的提取物以Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析分离，以甲醇-氯仿溶液为洗脱剂；及(5)将(4)的提取物以HPLC纯化得到卡柏林类生物碱产物，色谱柱为反相柱，流动相为甲醇-水溶液。本发明方法可以纯化得到纯度很高(99％以上)的生物碱，提取收率远高于现有方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可用于快速、高效提取植物中卡柏林类生物碱的方法。

背景技术

中药是人类几千年以来在与疾病和伤痛作斗争的过程中，通过不断认知、不断实践，积累得到的宝贵财富，是凝聚着人类上千年智慧的结晶。中药一般主要来自植物、动物等，种类较多。明代的伟大医学家李时珍在《证类本草》的基础上进行修订，编成了符合时代发展需要的巨著—《本草纲目》，此书收录中草药1892种，附方11000多个，《本草纲目拾遗》又补充了1021种中草药。根据相关调查数据显示，世界上的20000多种高等植物中，曾进行过活性研究或者活性筛选的不到15％。因此，天然产物研究工作的潜力是巨大的。

在古代，由于受到当时科技水平的制约，许多中草药的药效及其作用机制均不明确。而近年来，随着人们对自身健康的重视程度逐步加深，回归自然的呼声越来越高，以及科学技术的飞速发展，中草药和中成药等天然产物的药效研究在全世界都得到了高度的重视。各国的新药研究开发工作也紧紧围绕着天然产物有条不紊地进行。

寻找天然产物的活性成分，并进一步揭示其药效及其作用机制是天然产物化学研究领域的核心问题，而此问题的关键点在于探寻先进有效的分离提纯分析方法。换言之，天然产物中的物质的有效分离及结构鉴定是天然产物活性研究的基础，是天然产物化学研究领域中的重点部分。

生物碱是存在于自然界(主要为植物，但有的也存在于动物)中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质，所以过去又称为赝碱。大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。生物碱具环状结构，难溶于水，与酸可以形成盐，有一定的旋光性和吸收光谱，大多有苦味。呈无色结晶状，少数为液体。生物碱有几千种，由不同的氨基酸或其直接衍生物合成而来，是次级代谢物之一，对生物机体有毒性或强烈的生理作用。

天然产物化学中传统的分离方法有：溶剂提取法、萃取、沉淀、结晶以及过滤。随着天然产物化学以及分离技术的不断发展，高效新颖的分离技术在国内外天然产物化学研究中得到了广泛的应用，其中包括：色谱分离技术、超临界流体萃取技术、膜分离技术、大孔树脂吸附分离技术、分子蒸馏技术等。

卡柏林类生物碱的结构特征为，其母体结构为C6-N1-C5的基本骨架，其侧链可以有多种变化，整个化合物的极性随着侧链所连基团的极性而变化。

传统的卡柏林提取方法，依赖于硅胶柱层析或者重结晶的方法。但此法主要针对于极性中等或者极性偏小的化合物，如若化合物的极性较大，硅胶柱层析这种分离提取方法的效果和效率则不佳；而如若选择重结晶方法，如何选择到合适的溶剂是较难解决的问题。此外，运用硅胶柱层析分离提取得到的卡柏林生物碱，其纯度也不是很好。

发明内容

本发明在于克服现有分离技术对于卡柏林系列生物碱进行分离时的不足，在传统分离技术的基础上，根据卡柏林系列生物碱的特征提出一种新的分离提取纯化方法。

本发明提供一种从植物药材中提取卡柏林类生物碱的方法，包括步骤：(1)选取的药材用乙醇浸泡，渗漉提取，减压浓缩后得乙醇浸膏，所得到的乙醇浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取处理；(2)将(1)中的乙酸乙酯萃取层和/或正丁醇萃取层用硅胶柱层析进行粗提取，洗脱剂选自氯仿-甲醇体系、石油醚-丙酮体系和石油醚-乙酸乙酯体系，以TLC薄层色谱法进行追踪；(3)将(2)中的粗提取物以MCI gel CHP-20P柱层析分离，以甲醇-水溶液为洗脱剂，以TLC薄层色谱法进行追踪；(4)将(3)中得到的提取物以Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析分离，以甲醇-氯仿溶液为洗脱剂，以TLC薄层色谱法进行追踪；及(5)将(4)中得到的提取物以HPLC高效液相纯化得到卡柏林类生物碱产物，其中色谱柱为反相柱，流动相为甲醇-水溶液。

根据本发明具体实施例的方法，其中所述药材为白刺果、白刺秆、越南叶下珠、虎皮楠或白饭树。

根据本发明具体实施例的方法，经所述步骤(5)纯化，一一对应于所述白刺果、白刺秆、越南叶下珠、虎皮楠及白饭树，分别得到如下结构式的卡柏林类生物碱：

根据本发明具体实施例的方法，其中步骤(2)中的洗脱剂选自100:1～3:1的氯仿-甲醇体系、5:1～1:1的石油醚-丙酮体系和4:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯体系其中步骤(3)中以3:1～1:3的甲醇-水溶液为洗脱剂；步骤(4)中以1:1～1:3的甲醇-氯仿溶液为洗脱剂；步骤(5)中的流动相为1:4～4:1的甲醇-水溶液体系，所述反相柱为C18-ODS-A柱。

根据本发明方法，可以纯化得到纯度很高(99％以上)的生物碱，而且提取收率远高于现有方法。

附图说明

图1是实施例1得到卡柏林类生物碱的核磁共振谱图；及

图2是实施例1得到卡柏林类生物碱的LC-ESI-MS谱图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明进行进一步的详述。以下实施方式只是较佳的实施方式中的一种，并非对本发明的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。未作特殊说明的实验试剂和方法，均指常规试剂和方法。

具体地通过实施例1-5及比较例1-2，示例性说明本发明方法的特点和优点。

实施例1：

β-卡柏林-4-甲氧基-2-乙烯酸甲酯的提取与纯化：

(一)、前期处理步骤：4.1公斤白刺果(采自青海柴达木盆地)。

用25L 95％乙醇浸泡三天，室温渗漉提取，再重复两次，提取液合并，减压浓缩将乙醇全部蒸发，得乙醇浸膏230g。将浸膏用去离子水溶解(约3L)后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇(各3L×3)萃取。然后，把乙酸乙酯和正丁醇提取液分别减压浓缩，分别得到乙酸乙酯浸膏68.3g，正丁醇浸膏153.2g。

乙酸乙酯萃取部分浓缩后得到的浸膏，用150mL氯仿溶解，拌入120g的100～200目粗硅胶，自然挥发除去溶剂，制成黄色的浸膏硅胶粉。称取2Kg100～200目粗硅胶，湿法装柱，上样，用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统。梯度洗脱，洗脱剂浓度范围为：纯石油醚，石油醚：乙酸乙酯＝3:1，纯丙酮，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并成十个组段。

每个组段再使用硅胶柱层析。洗脱体系是石油醚-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯。

(二)、MCI gel CHP-20P柱层析：前期处理之后根据TLC薄层色谱追踪的结果，将卡柏林类生物碱所在的组分筛选出。然后用MCI gel CHP-20P柱层析分离，以50％的甲醇水溶液为洗脱剂，除去大极性的物质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并。

(三)、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析：将经过MCI gel CHP-20P柱层析纯化之后的组分，用氯仿：甲醇＝1:1的溶液溶解，并且以氯仿：甲醇＝1:1的溶液的为洗脱剂，使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析进行分离。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱柱体积为100ml，则洗脱体积即为400ml。

使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱除去与生物碱性质相差较大的杂质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并，并减压浓缩，蒸去溶剂。

(四)、HPLC高效液相纯化：将经过以上处理的样品500mg，用甲醇溶解。

使用HPLC高效液相纯化，其具体的纯化条件为：流动相选择为45％的甲醇水溶液，色谱柱为C18-ODS-A(50μm)反相柱，室温条件为25℃，保留时间16min处的化合物即为所要的目标化合物，最终得到目标化合物350mg，提取率为0.5％，纯度为99.9％。

传统的提取方法，单纯使用硅胶柱层析这一方法，提取率约为0.07％(详情参见DuanJ A等Tetrahedron Letters.1999,40(13):2593-2596)。本方法远超传统方法的提取率。

以下为产物的图谱参数。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.19(1H,s,H/D exchangeable),8.71(1H,d,J＝16.0Hz),8.61(1H,d,J＝4.9Hz),8.55(1H,d,J＝4.9Hz),8.35(1H,d,J＝8.0Hz),7.83(1H,d,J＝8.3Hz),7.63(1H,ddd,J1＝8.2Hz,J2＝7.1Hz,J3＝1.1Hz),7.35(1H,ddd,J1＝8.0Hz,J2＝7.2Hz,J3＝1.2Hz),6.95(1H,d,J＝16.0Hz),3.82(3H,s)；LC-ESI-MS:m/z＝281.1[M+H]+(positive).

实施例2：

(3S,4R)-1-β-卡柏林-3,4,5-三羟基酮的提取与纯化

(一)、前期处理步骤：3.6公斤白刺秆(采自青海柴达木盆地)用25L 95％乙醇浸泡三天，室温渗漉提取，再重复两次，提取液合并，减压浓缩后得乙醇浸膏。将浸膏用去离子水溶解(约3L)后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇(各3L×3)萃取。然后，把乙酸乙酯和正丁醇提取液分别减压浓缩，分别得到乙酸乙酯浸膏43.8g，正丁醇浸膏103.2g。之后正丁醇浸膏的处理步骤与实施例1中步骤(一)相同。

(二)、MCI gel CHP-20P柱层析：之后根据TLC薄层色谱追踪的结果，将卡柏林类生物碱所在的组分筛选出。然后用MCI gel CHP-20P柱层析分离，以45％的甲醇水溶液为洗脱剂，除去大极性的物质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并。

(三)、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析：将经过MCI gel CHP-20P柱层析纯化之后的组分，用氯仿：甲醇＝1:1的溶液溶解，并且以氯仿：甲醇＝1:1的溶液的为洗脱剂，使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析进行分离，根据组分的量选择合适的柱体积，而洗脱体积的选择与实施例1中的方法相同。本步骤中，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱柱体积为120ml，则洗脱体积即为480ml。使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱除去与生物碱性质相差较大的杂质，使用TLC薄层层析跟踪监测，后续处理方法与实施例1中相同。

(四)、HPLC高效液相纯化：将经过以上处理的样品600mg，用甲醇溶解，使用HPLC高效液相纯化，使用HPLC高效液相纯化，其具体的纯化条件为：流动相选择为43％的甲醇水溶液，色谱柱为C18-ODS-A(50μm)反相柱，室温条件为25℃，保留时间14.8min处的化合物即为所要的目标化合物，最终得到目标化合物380mg，提取率为0.37％，纯度为99.9％。传统的提取方法，一般只是单纯使用硅胶柱层析这一方法，提取率约为0.09％，本方法超出传统方法的提取率。

产物图谱数据如下

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.50(1H,d,J＝4.9Hz),8.43(1H,d,J＝4.9Hz),8.30(1H,d,J＝7.8Hz),7.81(1H,d,J＝8.2Hz),7.59(1H,t,J＝4.3Hz),7.30(1H,t,J＝4.9Hz),4.72(1H,m),4.46(1H,s),4.14(1H,m),3.56(2H,dd,J1＝15.6Hz,J2＝9.0Hz),3.27(3H,dd,J1＝15.5Hz,J2＝3.4Hz),3.16(1H,d,J＝4.8Hz),1.23(1H,s)；LC-ESI-MS:m/z＝301.1[M+H]+(positive).

实施例3：

O-乙酰基白刺碱的提取与纯化：

(一)、前期处理步骤：7.6公斤越南叶下珠(采自广西南宁)用25L 95％乙醇浸泡三天，室温渗漉提取，再重复两次，提取液合并，减压浓缩后得乙醇浸膏。将浸膏用去离子水溶解(约3L)后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇(各3L×3)萃取。然后，把乙酸乙酯和正丁醇提取液分别减压浓缩，分别得到乙酸乙酯浸膏83.8g，正丁醇浸膏183.7g。之后乙酸乙酯浸膏的处理步骤与实施例1中步骤(一)相同。

(二)、MCI gel CHP-20P柱层析：之后根据TLC薄层色谱追踪的结果，将卡柏林类生物碱所在的组分筛选出。然后用MCI gel CHP-20P柱层析分离，以50％的甲醇水溶液为洗脱剂，除去大极性的物质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并。

(三)、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析：将经过MCI gel CHP-20P柱层析纯化之后的组分，用甲醇溶解，并且以纯甲醇为洗脱剂，使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析进行分离，根据组分的量选择合适的柱体积，而洗脱体积的选择与实施例1中的方法相同。本步骤中，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱柱体积为150ml，则洗脱体积即为600ml或750ml。使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱除去与生物碱性质相差较大的杂质，使用TLC薄层层析跟踪监测，后续处理方法与实施例1中相同。

(四)、HPLC高效液相纯化：将经过以上处理的样品750mg，用甲醇溶解，使用HPLC高效液相纯化，其具体的纯化条件为：流动相选择为41％的甲醇水溶液，色谱柱为C18-ODS-A(50μm)反相柱，室温条件为25℃，保留时间15.4min处化合物即为所要的目标化合物，最终得到目标化合物580mg，提取率为0.69％，纯度为99.9％。

传统的提取方法，只是单纯使用硅胶柱层析这一方法，提取率约为0.36％，详情参见T.S.Tulyaganov等Tetrahedron Letters.1999,40(13):2593-2596Chemistry of NaturalCompounds.2005,41(5):578-579.本方法超出传统方法的提取率。

以下为产物图谱数据。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.65(1H,d,J＝4.9Hz),8.53(1H,d,J＝4.9Hz),8.40(1H,d,J＝7.8Hz),7.87(1H,d,J＝8.2Hz),7.69(1H,t,J＝4.3Hz),7.40(1H,t,J＝4.9Hz),4.92(1H,m),4.64(1H,s),4.34(1H,m),3.76(2H,dd,J1＝15.6Hz,J2＝9.0Hz),3.67(3H,dd,J1＝15.5Hz,J2＝3.4Hz),3.46(1H,d,J＝4.8Hz),1.53(1H,s)；LC-ESI-MS:m/z＝309.2[M+H]+(positive).

实施例4：

乙酰基科马卡柏林的提取与纯化：

(一)、前期处理步骤：9.3公斤虎皮楠(采自福建)用25L 95％乙醇浸泡三天，室温渗漉提取，再重复两次，提取液合并，减压浓缩后得乙醇浸膏。将浸膏用去离子水溶解(约3L)后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇(各3L×3)萃取。然后，把乙酸乙酯和正丁醇提取液分别减压浓缩，分别得到乙酸乙酯浸膏106.3g，正丁醇浸膏197.1g。之后乙酸乙酯浸膏的处理步骤与实施例1中步骤(一)相同。

(二)、MCI gel CHP-20P柱层析：之后根据TLC薄层色谱追踪的结果，将卡柏林类生物碱所在的组分筛选出。然后用MCI gel CHP-20P柱层析分离，以40％的甲醇水溶液为洗脱剂，除去大极性的物质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并。

(三)、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析：将经过MCI gel CHP-20P柱层析纯化之后的组分，用甲醇溶解，并且以甲醇为洗脱剂，使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析进行分离，根据组分的量选择合适的柱体积，而洗脱体积的选择与实施例1中的方法相同。本步骤中，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱柱体积为180ml，则洗脱体积即为720ml或900ml。使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱除去与生物碱性质相差较大的杂质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并，后续处理方法与实施例1中相同。

(四)、HPLC高效液相纯化：将经过以上处理的样品750mg，用甲醇溶解，使用HPLC高效液相纯化，其具体的纯化条件为：流动相选择为40％的甲醇水溶液，色谱柱为C18-ODS-A(50μm)反相柱，室温条件为25℃，保留时间16.3min处的化合物即为所要的目标化合物，最终得到目标化合物530mg，提取率为0.49％，纯度为99.9％。传统的提取方法，提取率为0.39％，本方法超出传统方法的提取率。

以下为产物图谱数据。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.30-1.80(8H,m),2.21(3H,s),2.77(2H,t,J＝6.0Hz),2.85-3.12(2H,m),3.72(2H,t,J＝6.0Hz),7.08(2H,m),7.23(1H,m),7.42(1H,m),8.26(1H,brs)；LC-ESI-MS:m/z＝283.3[M+H]+(positive).

实施例5：

四氢胺白刺碱的提取与纯化：

(一)、前期处理步骤：7.3公斤白饭树(采自广西南宁)用25L 95％乙醇浸泡三天，室温渗漉提取，再重复两次，提取液合并，减压浓缩后得乙醇浸膏。将浸膏用去离子水溶解(约3L)后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇(各3L×3)萃取。然后，把乙酸乙酯和正丁醇提取液分别减压浓缩，分别得到乙酸乙酯浸膏86.3g，正丁醇浸膏127.1g。之后乙酸乙酯浸膏的处理步骤与实施例1中步骤(一)相同。

(二)、MCI gel CHP-20P柱层析：之后根据TLC薄层色谱追踪的结果，将卡柏林类生物碱所在的组分筛选出。然后用MCI gel CHP-20P柱层析分离，以50％的甲醇水溶液为洗脱剂，除去大极性的物质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并。

(三)、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析：将经过MCI gel CHP-20P柱层析纯化之后的组分，用甲醇溶解，并且以甲醇为洗脱剂，使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析进行分离，根据组分的量选择合适的柱体积，而洗脱体积的选择与实施例1中的方法相同。本步骤中，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱柱体积为200ml，则洗脱体积即为800ml或1000ml。使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱除去与生物碱性质相差较大的杂质，使用TLC薄层层析跟踪监测，根据监测结果把相关馏分合并。

(四)、HPLC高效液相纯化：将经过以上处理的样品700mg，用甲醇溶解，使用HPLC高效液相纯化，其具体的纯化条件为：流动相选择为35％的甲醇水溶液，色谱柱为C18-ODS-A(50μm)反相柱，室温条件为25℃，保留时间15.1min处的化合物即为所要的目标化合物，最终得到目标化合物550mg，提取率为0.64％，纯度为99.9％。传统的提取方法，提取率为0.27％，本方法超出传统方法的提取率超出传统方法的提取率。

以下为产物图谱结果。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.30(2H,m),7.48(3H,m),7.52(1H,m),7.62(1H,m),7.94(1H,dd,J1＝8Hz，J2＝2Hz),8.10(1H,d,J＝6Hz),8.19(1H,dd,J1＝9Hz，J2＝2Hz),8.51(1H,d,J＝7Hz),8.67(1H,d,J＝5Hz).LC-ESI-MS:m/z＝300.3[M+H]+(positive).

比较例1

原料：与实施例1中原料相同，均是采自柴达木盆地的白刺果，重量为4.5公斤。

实验过程：前期处理步骤与实施例1中相同，得到乙酸乙酯浸膏70g。然后运用传统的提取方法，即用氯仿-甲醇溶液为洗脱剂，洗脱剂浓度比例为氯仿：甲醇＝10:1，仅仅使用硅胶柱层析的方法，反复分离，期间并不使用本发明中的MCI gel CHP-20P柱层析和HPLC高效液相。

提取结果：得到目标化合物54.6mg，提取率为0.078％。

比较例2

原料：与实施例2中原料相同，均是采自柴达木盆地的白刺果，重量为4公斤。

实验过程：前期处理步骤与实施例1中相同，得到正丁醇浸膏105.3g。然后运用传统的提取方法，即用氯仿-甲醇溶液为洗脱剂，洗脱剂浓度比例为氯仿：甲醇＝8:1，仅仅使用硅胶柱层析的方法，反复分离，期间并不使用本发明中的MCI gel CHP-20P柱层析和HPLC高效液相。

提取结果：得到目标化合物4.6mg，提取率为0.0044％。

结论：实施例与比较例的对比可以看出，传统提取方法手段单一，基本是通过硅胶柱层析这一种方法进行提取，而一旦遇到极性较大的化合物，则提取率会大幅度降低(如对比例2)。而本发明的方法，结合多种分离提取方法，尤其是MCI gel CHP-20P柱层析和HPLC高效液相的使用，使得面对一般极性的化合物是，能够快速高效地分离；而面对极性偏大的化合物时，MCI gel CHP-20P柱层析和HPLC高效液相能够针对性地分离，从而依然能够较好地达到分离效果。此外，HPLC高效液相中的紫外检测，可以直观地看到分离纯化的化合物的纯度如何。本发明所提供的方法可以广泛运用于卡柏林类生物碱的分离工作中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制。其他任何不脱离本发明之精神和原理下所作的变形，均应认为是本发明的保护范围。