一种鹿脾提取物提取方法及在提高免疫力药物中的应用

摘要

本发明公开一种鹿脾提取物提取方法及在提高免疫力药物中的应用，采用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及5’-磷酸二酯酶制成的复合酶对鹿脾进行酶解，具有协同作用，相比于单个酶提取多肽提取率提高了90%，核酸提取率提高了75%。具有工业化生产价值。

说明书

技术领域：

本发明公开一种鹿脾提取物提取方法，本发明还进一步提供了鹿脾提取物在提高免疫力药物中的应用，属于生物制药技术领域。

技术背景：

鹿脾是鹿科动物梅花鹿或马鹿的脾。中国历代医学家认为，鹿尾仙兽，纯阳多寿之物，全身皆益于人。鹿制品均具有极高的药用价值和保健功效。从脾中提取多肽或核酸等小分子，又名转移因子，具有减轻或消除癌症人化疗、放疗引起的毒副作用等功能，主要应用于生物医药领域。

转移因子是由T淋巴细胞所释放的一类可透析的小分子多肽和核苷酸复合物，具有增强淋巴细胞转化，从而提高机体免疫功能的作用。目前，转移因子的提取方法多为匀浆、冻融、透析等物理方法提取转移因子，但物理方法的提取率非常低。

随着生物技术的发展，转移因子的提取方法逐渐改进，有专利《一种鹿脾提取物制剂及其制备方法》专利号ZL201210171730.9，对鹿脾提取通过加入胃蛋白酶、胰蛋白酶或中性蛋白酶进行酶解，提取物中核酸的提取率仍然极低，由于其选用的蛋白酶仅能酶解鹿脾中部分蛋白，酶解的能力有限，提取的有效多肽提取率也较低。

5’-磷酸二酯酶是一种能将单链DNA和RNA水解为5’-核苷酸的磷酸二酯酶，一般用于分析主基因组、双链环形DNA质粒或类质粒结构等分子生物学领域，或者用于5’-核苷酸生产；本发明首次将其应用在生物鹿脾的提取工艺，其与木瓜蛋白酶和中性蛋白酶具有协同作用，可以同时提高多肽和核糖的提取率。

发明内容

本发明公开了鹿脾提取物在提高免疫力药物中的用途，可用于制备提高免疫力作用的药物和保健食品，在剂型方面可采用各种剂型，如口服液、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊等剂型或缓释制剂。

本发明进一步公开了一种鹿脾提取物的制备方法，为一种新的制备方法，提高了多肽和核糖的提取率。

本发明公开的一种鹿脾提取物的制备方法，包括以下步骤：

1）称取鹿脾200份，去除表面结缔组织；

2）加入2:1~5:1倍重量的去离子水或生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨2~10min；

3）将鹿脾混悬液升温至65~70℃，调pH值至5~6，加入2~7%重量的复合酶酶解，保温2~3h；

4）将混悬液用4000g离心力下离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。

所述的复合酶为木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶：5’-磷酸二酯酶的质量比为1~2.5：1~2：2~5；

所述的木瓜蛋白酶活力为800U/g，菠萝蛋白酶活力为50000U/g，5’-磷酸二酯酶酶活力为800U/g。

所述的鹿脾提取物中含 15~30重量份多肽、1.0~2.7 重量份核酸。

本发明的积极效果在于：采用木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶：5’-磷酸二酯酶制成的复合酶对鹿脾进行酶解，具有协同作用，相比于单个酶提取多肽提取率提高了90%，核酸提取率提高了75%；相比于专利ZL201210171730.9提取方法，多肽和核酸提取率有显著提高。同时采用本发明方法得到的鹿脾提取物的增强免疫力作用显著高于专利ZL201210171730.9的鹿脾提取物。

具体实施方式：

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围，对照例1和2再现专利ZL201210171730.9提取工艺。

实施例1：

. 称取鹿脾200g，去除表面结缔组织；

. 加入400ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨5min；

. 将鹿脾混悬液升温至70℃，调pH值至6.0，加入4.8g木瓜蛋白酶，2.4g菠萝蛋白酶和5.0g 5'-磷酸二酯酶酶解保温2h；

. 将混悬液用4000g离心力下离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12.67%，核酸提取率为1.79%。

实施例2：

. 称取鹿脾200g，去除表面结缔组织；

. 加入600ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨2min；

. 将鹿脾混悬液升温至65℃，调pH值至5.5，加入2.5g木瓜蛋白酶，2.5g菠萝蛋白酶和5.0g 5'-磷酸二酯酶酶解保温2h；

. 将混悬液用4000g离心力下离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12.32%，核酸提取率为1.57%。

实施例3：

. 称取鹿脾200g，去除表面结缔组织；

. 加入650ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨3min；

. 将鹿脾混悬液升温至65℃，调pH值至5，加入2.7g木瓜蛋白酶，2.1g菠萝蛋白酶和5.1g 5'-磷酸二酯酶酶解保温3h；

. 将混悬液用4000g离心力下离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12.13%，核酸提取率为1.68%。

实施例4：

. 称取鹿脾200g，去除表面结缔组织；

. 加入1000ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨5min；

. 将鹿脾混悬液升温至69℃，调pH值至5.5，加入4.6g木瓜蛋白酶，2.2g菠萝蛋白酶和5.3g 5'-磷酸二酯酶酶解保温3h；

. 将混悬液用4000g离心力下离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12.24%，核酸提取率为1.87%。

实施例5：

. 称取鹿脾200g，去除表面结缔组织；

. 加入600ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨5min；

. 将鹿脾混悬液升温至70℃，调pH值至6，加入4.1g木瓜蛋白酶，3.9g菠萝蛋白酶和4.6g 5'-磷酸二酯酶酶解保温2h；

. 将混悬液用4000g离心力下离心10min取上清，用10KD超滤膜进行超滤得超滤液，喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12.26%，核酸提取率为1.47%。

对照例1，再现专利号：ZL201210171730.9提取工艺：

取200 g 鹿脾，去离子洗净，去血，将筋膜去掉，剪碎后加入5倍的去离子水，放入胶体磨中搅碎，3000 rpm，时间为10 min。将搅碎后混悬液PH 至2.4，然后加入500 U/g 的胃蛋白酶，在37℃下水解4 h 。然后将水解后混悬液离心，3000 rpm 离心10 min，收集上清，旋转蒸发浓缩，喷雾干燥既得鹿脾提取物干燥粉末。该提取多肽提取率为7.15%，核酸提取率为0.56%。

对照例2，再现专利号：ZL201210171730.9提取工艺：

取200 g 鹿脾，去离子洗净，去血，将筋膜去掉，剪碎后加入5倍的生理盐水，放入胶体磨中搅碎，3000 rpm，时间为10 min。将搅碎后混悬液PH 至8.5，然后加入756 U/g 的胰蛋白酶，在37℃下水解4 h 。然后将水解后混悬液离心，5000 rpm 离心10 min，收集上清，旋转蒸发浓缩，喷雾干燥既得鹿脾提取物干燥粉末。该提取多肽提取率为6.53%，核酸提取率为0.49%。

以下试验表明本发明工艺采用复合酶的协同作用，提高了核酸、多肽各有效成分的提取率。

表1 各种提取方法的提取结果

 多肽提取率（%）核酸提取率（%）实施例112.671.79实施例212.321.57木瓜蛋白酶6.380.24菠萝蛋白酶5.460.375'-磷酸二酯酶5.730.89对照例17.150.26对照例26.530.29

结论：从表1可看出，实施例1和实施例2相比于单独使用木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶提取多肽提取率明显提高，提高了90%以上；实施例1和实施例2相比于5'-磷酸二酯酶核酸酶提取核酸提取率提高了75%以上。实施例1和实施例2采用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、5'-磷酸二酯酶三种酶组合使用，多肽提取率和核酸提取率均都有显著的提高，三种酶提取鹿脾中多肽与核酸具有协同作用。同时从表1中也可以得出，实施例1和实施例2与对照例1和2相比，显著提高了多肽与核酸的提取率，多肽和核酸提取率分别提高了72%和4倍。

【提高免疫力实验】

1、动物分组及给药方法

BW小鼠的重量为18-20g，将BW小鼠分为A、B、C大组，每大组60只小鼠。每大组60只小鼠随机分为空白对照组、实施例1鹿脾提取物、实施例2鹿脾提取物、实施例3鹿脾提取物、对照例1鹿脾提取物、对照例2鹿脾提取物。每只小鼠灌胃20mg/kg,连续灌胃一周。A大组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验，B大组测定迟发型变态反应DTH，C大组进行抗体生成细胞检测和血清溶血素测定。

2、细胞免疫功能测定

ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

小鼠末次灌胃1h后，将脾细胞悬浮于完全培养液中，调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。将细胞悬液分别加入24孔培养板的2孔中，每孔1mL，试验孔孔加75μl ConA 液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5％CO₂，37℃CO₂孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50μl /孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。

3、迟发型变态反应实验

每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约 3cm×3cm、用 DNFB 溶液50μl均匀涂抹致敏。5天后，用 DNFB 溶液 10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。

4、体液免疫功能测定

4.1免疫动物  压积SRBC以生理盐水制成2%（v/v）的细胞悬液（约1×10⁸个SRBC），每只鼠腹腔注射0.2mL。

4.2血清溶血素测定

4.2.1血清收集

小鼠用SRBC免疫5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。

4.2.2凝集反应 

用生理盐水将血清100倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl  0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。

4.2.3抗体生成细胞检测

4.2.3.1脾细胞悬液制备  将SRBC免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾脏，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液，200目筛网过滤，1000rpm/min，10min，去上清，Hank's液洗2遍，以完全培养基RPMI 1640制备成5×10⁶～1×10⁷个细胞/mL的脾细胞悬液。

4.2.3.2空斑的测定

底层培养基制备 0.5g琼脂糖加入100mL灭菌生理盐水中，加热溶解，待温度于50℃左右时，以1mL/孔的量加至六孔培养板中，琼脂凝固后备用。

顶层培养基制备  0.5g琼脂糖加入100mL Hank's液中（PH7.2-7.4）,加热溶解，以0.5mL/试管的量加至46-50℃恒温的试管中。

铺板： 50μl 20%SRBC（生理盐水配制，v/v）、200μl 脾细胞悬液先后加入含有0.5mL顶层的试管中，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液，每个样本做两个平行孔。

空斑测定：已制备好培养板放入37℃、5% CO2培养箱中孵育1h，然后每孔加入500μl以完全培养基稀释的补体（v/v，1：10），继续孵育2h，自动图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数的平均值为样本的溶血空斑数值，以空斑数/10⁶脾细胞表示。

【实验结果】

1、各组小鼠脾淋巴细胞转化能力比较

由表1可得，鹿脾提取物可提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化指数，本发明方法（实施例1、实施例2、实施例3）提取的三组鹿脾提取物与空白对照组比较，小鼠淋巴细胞转化指数有显著提高（P＜0.01），且高于对照例1和对照例2提取物（专利号：ZL201210171730.9在小鼠淋巴细胞转化指数上的效果。

表2 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验结果（x±s）

组别OD差值空白对照组0.075±0.005实施例1鹿脾提取物0.128±0.013^**实施例2鹿脾提取物0.121±0.009^**实施例3鹿脾提取物0.118±0.011^**对照例1鹿脾提取物0.094±0.015^*对照例2鹿脾提取物0.095±0.019^*

与空白对照组比较：*p<0.05 **p<0.01 

2、迟发性变态试验

由表2可得出，鹿脾提取物灌胃的小鼠左右耳肿胀度差均高于对照组，本发明方法（实施例1、实施例2、实施例3）提取的三组鹿脾提取物与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01），而对照例1和对照例2（专利号：ZL201210171730.9）小鼠左右耳肿胀效果不如本发明组的效果明显。

表3 受试物迟发性变态反应实验DTH测定结果（x±s）

组别左右耳肿胀度差（mg）空白对照组18.3±1.4实施例1鹿脾提取物23.6±2.5^**实施例2鹿脾提取物23.4±1.9^**实施例3鹿脾提取物23.4±2.1^**对照例1鹿脾提取物20.3±1.1^*对照例2鹿脾提取物20.8±1.4^*

与空白对照组比较：*p<0.05 **p<0.01 

3、血清溶血素测定

溶血素水平反映体液免疫能力，体液免疫是由B细胞介导的特异性免疫应答，通过抗体发挥效应，其目标主要是清除细胞外的病原菌及其产生的毒素等抗原异物。由表3得出，鹿脾提取物可提高SRBC致敏小鼠的血清溶血素含量，本发明给药组效果较空白对照组均有明显差异（P＜0.01），对照例1和对照例2（专利号：ZL201210171730.9）较空白组均具有差异性，但本发明给药组的效果更好。

表4 受试物体液免疫功能实验血清血溶素实验结果（x±s）

组别血清溶血素HC50空白对照组120.81±16.67实施例1鹿脾提取物163.29±27.21^**实施例2鹿脾提取物158.29±23.56^**实施例3鹿脾提取物161.76±28.31^**对照例1鹿脾提取物139.34±21.89^*对照例2鹿脾提取物142.19±20.59^*

与空白对照组比较：*p<0.05 **p<0.01

4、抗体生成细胞检测

由表4得出，本发明方法（实施例1、实施例2、实施例3）提取的三组鹿脾提取物与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01），对照例1和对照例2（专利号：ZL201210171730.9）的抗体生成细胞检测结果较空白组有差异性（p＜0.05），没有本发明组效果好，可见本发明的改进方法，相较于目前的鹿脾提取方法具有明显的优势。

表5 受试物体液免疫实验抗体生成细胞检测实验结果（x±s）

组别溶血空斑数（×10³个/全脾）空白对照组2.26±0.35实施例1鹿脾提取物6.28±0.23^**实施例2鹿脾提取物6.19±0.29^**实施例3鹿脾提取物6.06±0.18^**对照例1鹿脾提取物4.12±0.31^*对照例2鹿脾提取物4.15±0.22^*

与空白对照组比较：*p<0.05 **p<0.01

综上所述，本发明方法（实施例1、实施例2、实施例3）提取的三组鹿脾提取物在小鼠脾淋巴细胞转化能力、小鼠左右耳肿胀度差、溶血素水平和抗体生成，效果均高于专利ZL201210171730.9的对照例。表明本发明方法可以在增强免疫力的应用上有显著的增强。