抑制抗坏血酸的影响的方法

摘要

本发明提供抑制抗坏血酸在含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定中的影响的方法。一种抑制抗坏血酸在试样中的糖化血红蛋白的测定中的影响的方法，其特征在于，在通过使蛋白质分解酶作用于含有糖化血红蛋白的试样后使生成的糖化肽与糖化肽氧化酶反应并对生成的过氧化氢进行测定而测定试样中的糖化血红蛋白的方法中，在卤素氧化物以及选自由通式(I)(式中，R

说明书

技术领域

本发明涉及抑制抗坏血酸在糖化血红蛋白的测定中的影响的方法 及糖化血红蛋白的测定用试剂。

背景技术

糖化血红蛋白是在血红蛋白上结合葡萄糖而成的糖化物。血红蛋 白具有由α链、β链构成的四聚体的结构，β链的N末端糖化后的血红 蛋白被称为血红蛋白A1c，血糖值越高其越增加，因此作为糖尿病标志 物而在临床检查中进行测定。

作为糖化血红蛋白的测定方法，已知HPLC法等色谱法、电泳法、 胶乳免疫凝聚法等利用抗体的免疫测定法、使用作用于糖化蛋白的酶 和作用于糖化肽和/或糖化氨基酸的酶的酶测定法等。

作为糖化血红蛋白的酶测定法，已知如下方法(吸光度法)等：首先， 利用变性剂使含有血红蛋白的试样中的血红蛋白变性，使蛋白质分解 酶作用于变性后的血红蛋白，接着使糖化肽氧化酶作用于生成的糖化 肽，使生成的过氧化氢在过氧化物酶等过氧化活性物质存在下与氧化 显色型色原体反应而生成色素，由生成的色素的吸光度测定糖化血红 蛋白。

但是，利用该吸光度法的糖化血红蛋白的测定中，存在于试样中 的抗坏血酸的影响成为问题。以往，在使用过氧化氢测定体系测定试 样中的测定对象物的方法中，抗坏血酸的影响成为问题，针对抑制抗 坏血酸的影响的技术问题，已知例如：使用抗坏血酸氧化酶的方法(参 考专利文献1)；使用铁、钴、硒、铜、汞、镍等的有机络合物的方法(参 考专利文献2～4)；使用碘酸盐的方法(参考专利文献5)；使用碘酸盐 并且使用选自磷酸化合物、硼酸化合物、柠檬酸化合物、苹果酸化合 物、酒石酸化合物和草酸化合物中的至少一种化合物作为碘酸盐的辅 助剂的方法(专利文献6)等，但抑制抗坏血酸在糖化血红蛋白的测定中 的影响的效果并不充分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特公昭56-39198号公报

专利文献2：日本特公平1-41223号公报

专利文献3：日本特公昭63-67139号公报

专利文献4：日本特公昭63-39871号公报

专利文献5：日本特开昭56-151358号公报

专利文献6：日本特开平8-271504号公报

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的在于提供抑制抗坏血酸在含有糖化血红蛋白的试样 中的糖化血红蛋白的测定中的影响的方法及糖化血红蛋白测定用试 剂。

用于解决技术问题的方法

本发明人对该技术问题进行了深入研究，结果发现如下见解：在 使蛋白质分解酶作用于含有糖化血红蛋白的试样后使生成的糖化肽与 糖化肽氧化酶反应并对生成的过氧化氢进行测定而测定试样中的糖化 血红蛋白的方法中，在卤素氧化物以及含有氮原子和硫原子的特定的 五元环杂环化合物的存在下进行糖化肽与糖化肽氧化酶的反应，由此， 能够抑制试样中的抗坏血酸的影响，从而完成了本发明。即，本发明 涉及以下的[1]～[7]。

[1]一种抑制抗坏血酸在试样中的糖化血红蛋白的测定中的影响的 方法，其特征在于，在通过使蛋白质分解酶作用于含有糖化血红蛋白 的试样后使生成的糖化肽与糖化肽氧化酶反应并对生成的过氧化氢进 行测定而测定试样中的糖化血红蛋白的方法中，在卤素氧化物以及选 自由通式(I)所示的物质和通式(II)所示的物质组成的组中的物质的存在 下进行糖化肽与糖化肽氧化酶的反应，

(式中，R¹表示取代或未取代的烷基)

(式中，R²表示取代或未取代的烷基，表示单键或双键)。

[2]如[1]所述的方法，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐和溴 酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，糖化血红蛋白为血红蛋白A1c。

[4]一种试样中的糖化血红蛋白的测定用试剂，其含有蛋白质分解 酶、糖化肽氧化酶、卤素氧化物、选自由通式(I)所示的物质和通式(II) 所示的物质组成的组中的物质以及过氧化氢测定用试剂，

(式中，R¹表示取代或未取代的烷基)

(式中，R²表示取代或未取代的烷基，表示单键或双键)。

[5]如[4]所述的试剂，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐和溴 酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。

[6]如[4]或[5]所述的试剂，其中，糖化血红蛋白为血红蛋白A1c。

[7]如[4]～[6]中任一项所述的试剂，其用于抑制抗坏血酸在试样中 的糖化血红蛋白的测定中的影响。

发明效果

根据本发明，可以提供抑制抗坏血酸在糖化血红蛋白的测定中的 影响的方法及糖化血红蛋白测定用试剂。

具体实施方式

(1)抑制抗坏血酸在试样中的糖化血红蛋白的测定中的影响的方法

本发明的抑制抗坏血酸在含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红 蛋白的测定中的影响的方法的特征在于，在通过使蛋白质分解酶作用 于含有糖化血红蛋白的试样后使生成的糖化肽与糖化肽氧化酶反应并 对生成的过氧化氢进行测定而测定试样中的糖化血红蛋白的方法中， 在卤素氧化物以及选自由通式(I)所示的物质[以下记作化合物(I)]和通 式(II)所示的物质[以下记作化合物(II)]组成的组中的物质的存在下进行 糖化肽与糖化肽氧化酶的反应。卤素氧化物以及选自由化合物(I)和化 合物(II)组成的组中的物质可以在含有糖化血红蛋白的试样与蛋白质分 解酶的反应中共存。

(式中，R¹表示取代或未取代的烷基)

(式中，R²表示取代或未取代的烷基，表示单键或双键)

本发明的测定方法中的含有糖化血红蛋白的试样只要是含有糖化 血红蛋白和血红蛋白且能够应用本发明的抑制抗坏血酸的影响的方法 的试样则没有特别限制，可以列举例如：全血、血球、在血球中混合 有血浆的试样、对这些试样进行溶血处理而得到的试样等。作为溶血 处理，只要是使全血、血球、在血球中混合有血浆的试样发生溶血的 处理则没有特别限制，可以列举例如：物理方法、化学方法、生物学 方法等。作为物理方法，可以列举例如：使用蒸馏水等低张液的方法、 使用超声波的方法等。作为化学方法，可以列举例如：使用甲醇、乙 醇、丙酮等有机溶剂的方法；使用聚氧乙烯类表面活性剂的方法等。 作为生物学方法，可以列举例如使用抗体、补体的方法等。

本发明中的糖化血红蛋白是在血红蛋白上结合葡萄糖等糖而生成 的血红蛋白，可以列举血红蛋白A1a、血红蛋白A1b、血红蛋白A1c 等，优选血红蛋白A1c。

作为本发明中的卤素氧化物，只要是能够实现本发明的抑制抗坏 血酸的影响的方法的卤素氧化物则没有特别限制，可以列举例如碘酸 或其盐、溴酸或其盐、高碘酸或其盐等，优选碘酸或其盐、溴酸或其 盐。作为盐，可以列举例如锂盐、钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐等。

作为卤素氧化物的具体例(产品)，可以列举例如碘酸、碘酸钠、碘 酸钾、溴酸、溴酸钠、溴酸钾、高碘酸、高碘酸钠、高碘酸钾等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中，作为卤素氧化物在反应液 中的浓度，只要是能够实现本发明的糖化血红蛋白的测定方法的浓度 则没有特别限制，通常为0.005～20mmol/L，优选为0.01～10mmol/L。

本发明中的化合物(I)中的R¹表示取代或未取代的烷基。作为取代 或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数1～20的直链烷基、 碳原子数3～20的支链烷基等。作为碳原子数1～20的直链烷基，可 以列举例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、 壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉 豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、 十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数3～20的支链烷基，可以列举 例如：异丙基、异丁基、异戊基、异己基、异庚基、异辛基、异壬基、 异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十 五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二 十烷基、辛基十二烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如 苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为卤素原子，可以列举例 如氯原子、溴原子、碘原子等。

作为化合物(I)的具体例(产品)，可以列举例如2-辛基-4-异噻唑啉 -3-酮(东京化成公司制造，ケミクレア公司制造)、2-甲基-4-异噻唑啉-3- 酮(シグマアルドリッチ公司制造)等。

本发明中的化合物(II)中的R²表示取代或未取代的烷基。作为取 代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数1～20的直链烷 基、碳原子数3～20的支链烷基等。作为碳原子数1～20的直链烷基， 可以列举例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、 壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉 豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、 十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数3～20的支链烷基，可以列举 例如：异丙基、异丁基、异戊基、异己基、异庚基、异辛基、异壬基、 异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十 五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二 十烷基、辛基十二烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如 苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为卤素原子，可以列举例 如氯原子、溴原子、碘原子等。

作为化合物(II)的具体例(产品)，可以列举例如2-甲基噻唑啉(东京 化成公司制造)、2-甲基噻唑(东京化成公司制造)、2-乙基噻唑(东京化 成公司制造)、2-丙基噻唑(东京化成公司制造)、2-异丁基噻唑(东京化 成公司制造)等。

在本发明的抑制抗坏血酸的影响的方法中，作为化合物(I)和化合 物(II)在反应液中的浓度，只要是能够实现本发明的糖化血红蛋白的测 定方法的浓度则没有特别限制，通常为0.005～20mmol/L，优选为 0.01～10mmol/L。

对于使蛋白质分解酶作用于含有糖化血红蛋白的试样而生成糖化 肽的反应而言，只要是能够生成糖化肽的条件则可以在任何条件下进 行。该反应、即含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质 分解酶的反应优选在水性介质中进行。作为水性介质，可以列举后述 的水性介质等。另外，该反应还可以在含有糖化血红蛋白的试样中的 糖化血红蛋白的变性剂的存在下进行。糖化血红蛋白通过该变性剂形 成能够与蛋白质分解酶反应的状态，因此，糖化血红蛋白与蛋白质分 解酶的反应优选在变性剂的存在下进行。作为变性剂，只要是能够形 成可以使糖化血红蛋白与蛋白质分解酶反应的状态的变性剂则没有特 别限制，可以列举例如阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、 两性表面活性剂、非离子型表面活性剂等。

作为阳离子型表面活性剂，可以列举例如季铵盐、吡啶盐等。

作为季铵盐，优选具有至少一个碳原子数8～20的直链烷基的季 铵盐。作为碳原子数8～20的直链烷基，可以列举例如：辛基、壬基、 癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、 十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷 基、二十烷基等。

作为季铵盐的具体例(产品)，可以列举例如：癸基三甲基氯化铵、 癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、 十四烷基三甲基溴化铵(以下记作C14TMA)、十六烷基三甲基氯化铵、 十六烷基三甲基溴化铵、二癸基二甲基氯化铵、二癸基二甲基溴化铵、 双(十二烷基)二甲基氯化铵、双(十二烷基)二甲基溴化铵(均为东京化成 公司制造)等。

作为吡啶盐，可以举出N-烷基吡啶盐、N-烯基吡啶盐等。 作为烷基，可以列举例如碳原子数1～20的直链烷基、碳原子数3～20 的支链烷基等。作为碳原子数1～20的直链烷基，可以列举例如甲基、 乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷 基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、 十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷 基等。作为碳原子数3～20的支链烷基，可以列举例如异丙基、异丁 基、异戊基、异己基、异庚基、异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷 基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷 基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二 烷基等。

作为烯基，可以列举例如碳原子数2～20的烯基等。作为碳原子 数2～20的烯基，可以列举例如：乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、 戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十 二烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、油 烯基、十九烯基、二十烯基等。

另外，作为烷基，也可以使用取代烷基，作为烯基，也可以使用 取代烯基。作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如苯基、 羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为卤素原子，可以列举例如氯原 子、溴原子、碘原子等。

此外，还可以使用在吡啶环上的2～6位上具有取代基的N-烷基 吡啶盐、N-烯基吡啶盐。作为吡啶环上的2～6位的取代基，可以 列举例如碳原子数1～20的直链烷基、碳原子数3～20的支链烷基、 碳原子数2～20的烯基等。作为碳原子数1～20的直链烷基，可以列 举例如上述的碳原子数1～20的直链烷基等。作为碳原子数3～20的 支链烷基，可以列举例如上述的碳原子数3～20的支链烷基等。作为 碳原子数2～20的烯基，可以列举例如上述的碳原子数2～20的直链 烯基等。

作为吡啶盐的具体例(产品)，可以列举例如：氯化1-十二烷基吡 啶(以下记作C12py；东京化成公司制造)、氯化1-鲸蜡基吡啶(东京化 成公司制造)、氯化1-鲸蜡基-4-甲基吡啶(东京化成公司制造)、溴化N- 十八烷基-4-苯乙烯基吡啶(东京化成公司制造)等。

作为阴离子型表面活性剂，可以列举例如：硫酸酯盐、羧酸盐、 磺酸盐、磷酸酯盐、磺基琥珀酸盐、N-甲基牛磺酸盐、N-烷酰基-N-甲 基牛磺酸盐等。

作为两性表面活性剂，可以列举例如：叔胺氧化物、烷基羧基甜 菜碱等。

作为非离子型表面活性剂，可以列举例如：聚氧乙烯烷基胺、聚 氧乙烯烯基胺、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯烷基苯 基醚、乙二胺四聚氧乙烯、聚甘油脂肪酸酯等，优选聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烷基醚。

作为聚氧乙烯烷基胺中的烷基，可以列举例如碳原子数8～20的 烷基等。作为碳原子数8～20的烷基，可以列举例如：辛基、壬基、 癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、 十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷 基、二十烷基等。

作为聚氧乙烯烯基胺中的烯基，可以列举例如碳原子数8～20的 烯基等。作为碳原子数8～20的烯基，可以列举例如：辛烯基、壬烯 基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、 十七烯基、十八烯基、油烯基、十九烯基、二十烯基等。

作为聚氧乙烯烷基醚中的烷基，可以列举例如碳原子数8～20的 烷基等。作为碳原子数8～20的烷基，可以列举例如上述的碳原子数8～ 20的烷基等。

作为聚氧乙烯烯基醚中的烯基，可以列举例如碳原子数8～20的 烯基等。作为碳原子数8～20的烯基，可以列举例如上述的碳原子数8～ 20的烯基等。

作为聚氧乙烯烷基苯基醚中的烷基，可以列举例如碳原子数8～ 20的烷基等。作为碳原子数8～20的烷基，可以列举例如上述的碳原 子数8～20的烷基等。

含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反 应中的反应温度通常为10～50℃，优选为20～40℃，反应时间通常为 1分钟～3小时，优选为2.5分钟～1小时。作为蛋白质分解酶的浓度， 只要是使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反 应进行的浓度则没有特别限制，通常为50～25000kU/L，优选为250～ 10000kU/L。

作为蛋白质分解酶，只要是作用于含有血红蛋白的试样中的糖化 血红蛋白而使糖化血红蛋白生成糖化肽的酶，则没有特别限制，可以 列举例如：丝氨酸蛋白酶(糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等)、半胱氨酸蛋 白酶(木瓜蛋白酶、半胱天冬酶等)、天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶、组织 蛋白酶D等)、金属蛋白酶(嗜热菌蛋白酶等)、N-末端苏氨酸蛋白酶、 谷氨酸蛋白酶等。本发明中，也可以使用市售的蛋白质分解酶，作为 市售品，可以列举例如：蛋白酶P“アマノ”3G、蛋白酶K“アマ ノ”(以上为天野エンザイム公司制造)、链霉蛋白酶AS、链霉蛋白酶 E(以上为科研ファルマ公司制造)、嗜热菌蛋白酶(大和化成公司制造)、 スミチームMP(新日本化学工业公司制造)等。

作为使上述蛋白质分解酶进行作用的反应中的变性剂的浓度，只 要是使含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶反 应进行的浓度，则没有特别限制，通常为0.0001～10％，优选为0.0005～ 5％。

通过含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶 的反应，生成糖化肽。所生成的糖化肽与糖化肽氧化酶反应，生成过 氧化氢。糖化肽与糖化肽氧化酶的反应优选在水性介质中进行。作为 水性介质，可以列举后述的水性介质等。

糖化肽与糖化肽氧化酶的反应中的反应温度通常为10～50℃，优 选为20～40℃，反应时间通常为1分钟～3小时，优选为2.5分钟～1 小时。作为糖化肽氧化酶的浓度，只要是使果糖基血红蛋白与糖化肽 氧化酶的反应进行的浓度，则没有特别限制，通常为0.1～30kU/L，优 选为0.2～15kU/L。

作为糖化肽氧化酶，只要是作用于糖化肽而生成过氧化氢的酶， 则没有特别限制，可以列举例如来自丝状菌的糖化肽氧化酶、来自酵 母的糖化肽氧化酶、来自放线菌的糖化肽氧化酶、来自细菌的糖化肽 氧化酶、来自古细菌的糖化肽氧化酶等。本发明中，也可以使用市售 的糖化肽氧化酶，作为市售品，可以列举例如FPOX-CE(キッコーマン 公司制造)、FPOX-EE(キッコーマン公司制造)、FPOX-CET(キッコー マン公司制造)等。

作为生成的过氧化氢的测定方法，可以列举例如使用电极的方法、 使用过氧化氢测定用试剂的方法等，优选使用过氧化氢测定用试剂的 方法。过氧化氢测定用试剂是用于将过氧化氢转变为能够检测的物质 的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如色素、光(发光)、荧光等， 优选色素。

在能够检测的物质为色素的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列 举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和氧化显色型色原体的试剂等。 作为氧化显色型色原体，可以列举氧化耦合型色原体、无色型色原体 等，优选无色型色原体。作为无色型色原体，可以列举例如：吩噻嗪 类色原体、三苯基甲烷类色原体、二苯胺类色原体、邻苯二胺、羟基 丙酸、二氨基联苯胺、四甲基联苯胺等，优选吩噻嗪类色原体。作为 吩噻嗪类色原体，可以列举例如：10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲 氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨 基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨 基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)等。吩噻嗪类色原体中，特别优选10-N-(羧 甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)。作为三苯基 甲烷类色原体，可以列举例如N,N,N’,N’,N”,N”-六(3-磺丙基)-4,4’,4”- 三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)等。作为二苯胺类色原体，可以列举例如 N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、4,4’-双(二 甲氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。

在能够检测的物质为光(发光)的情况下，过氧化氢测定用试剂可以 列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和化学发光物质的试剂等。作 为化学发光物质，可以列举例如：鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶 酯等。

在能够检测的物质为荧光的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列 举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和荧光物质的试剂等。作为荧光 物质，可以列举例如：4-羟基苯乙酸、3-(4-羟基苯基)丙酸、香豆素等。

本发明中的含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方 法还包含以含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量相对于总血 红蛋白量的比例的方式进行计算的方法。

总血红蛋白量可以通过公知的方法、例如氰化高铁血红蛋白法、 氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法等来确定。通过应用氰化高铁血红 蛋白法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法，不仅可以确定含有糖化 血红蛋白的试样本身的总血红蛋白量，而且还可以确定在含有糖化血 红蛋白的试样中添加卤素氧化物以及选自由化合物(I)和化合物(II)组成 的组中的物质而得到的试样、在含有糖化血红蛋白的试样中添加卤素 氧化物、选自由化合物(I)和化合物(II)组成的组中的物质以及蛋白质分 解酶而得到的试样的总血红蛋白量。

(2)含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定试剂

本发明的含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定试剂 是含有蛋白质分解酶、糖化肽氧化酶、卤素氧化物、选自由化合物(I) 和化合物(II)组成的组中的物质以及过氧化氢测定用试剂的试剂。本发 明的糖化血红蛋白测定试剂在本发明的抑制抗坏血酸的影响的方法中 使用。

作为本发明的测定试剂中的蛋白质分解酶、糖化肽氧化酶、卤素 氧化物、化合物(I)、化合物(II)和过氧化氢测定试剂，可以分别列举例 如上述的蛋白质分解酶、糖化肽氧化酶、卤素氧化物、化合物(I)、化 合物(II)和过氧化氢测定试剂等。

本发明的测定试剂中的蛋白质分解酶的浓度通常为50～ 25000kU/L，优选为250～10000kU/L。本发明的测定试剂中的糖化肽 氧化酶的浓度通常为0.1～30kU/L，优选为0.2～15kU/L。

本发明的测定试剂中的卤素氧化物的浓度通常为0.005～ 20mmol/L，优选为0.01～10mmol/L。

本发明的测定试剂中的化合物(I)的浓度通常为0.005～20mmol/L， 优选为0.01～10mmol/L。

本发明的测定试剂中的化合物(II)的浓度通常为0.005～ 20mmol/L，优选为0.01～10mmol/L。

本发明的测定试剂中，可以根据需要含有水性介质、变性剂、稳 定剂、防腐剂、盐类、干扰物质的影响抑制剂、增溶剂、有机溶剂等。

作为水性介质，可以列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优 选缓冲液。

水性介质的pH例如为pH4～10。在使用缓冲液作为水性介质的情 况下，优选使用与设定的pH相适应的缓冲剂。作为缓冲液中使用的缓 冲剂，可以列举例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓 冲剂、Good’s缓冲剂等。

作为Good’s缓冲剂，可以列举例如：2-吗啉代乙烷磺酸(MES)、 双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二 乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨 基乙烷磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟 乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-吗啉代丙烷磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲 基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸 (HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、N-[三(羟 甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙烷 磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙烷磺酸(HEPPSO)、 3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨 酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨 基丙烷磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙烷磺酸(CHES)、N-环己基-3- 氨基-2-羟基丙烷磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)等。

缓冲液的浓度通常为0.001～2.0mol/L，优选为0.005～1.0mol/L。

作为变性剂，可以列举例如上述的变性剂等。本发明的测定试剂 中的变性剂的浓度通常为0.0001～10％，优选0.0005～5％。

作为稳定剂，可以列举例如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、 乙酸钙、硝酸钙、亚铁氰化钾、牛血清白蛋白(BSA)等。作为防腐剂， 可以列举例如叠氮化钠、抗生素等。作为盐类，可以列举例如氯化钠、 硝酸钠、硫酸钠、碳酸钠、氯化钾、硝酸钾、硫酸钾、碳酸钾等。作 为干扰物质的影响抑制剂，可以列举例如用于抑制过氧化物的影响的 丙酮酸等。作为增溶剂，可以列举例如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷 基苯基醚等非离子型表面活性剂等。作为有机溶剂，可以列举例如用 于辅助无色型色原体在水性介质中溶解的二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚 砜(DMSO)、二氧杂环己烷、丙酮、甲醇、乙醇等。

本发明的糖化血红蛋白测定试剂可以采取试剂盒的形式。作为糖 化血红蛋白测定试剂盒，可以列举例如双试剂型试剂盒、三试剂型试 剂盒等。糖化血红蛋白测定试剂盒为双试剂型试剂盒时，对于蛋白质 分解酶、糖化肽氧化酶、卤素氧化物、选自由化合物(I)和化合物(II)组 成的组中的物质以及过氧化氢测定用试剂的各要素的配置而言，从试 剂盒的保存稳定性的观点出发，本领域技术人员可以适当选择，优选 蛋白质分解酶和糖化肽氧化酶包含在不同试剂中的试剂盒。

以下，通过实施例对本发明更详细地进行说明，但这些实施例不 对本发明的范围进行任何限定。另外，在本实施例中，使用下述制造 商的试剂和酶。

Bis-Tris(同仁化学研究所公司制造)、MOPS(同仁化学研究所公司 制造)、氯化钙二水合物(关东化学公司制造)、丙酮酸钠(关东化学公司 制造)、DMSO(ナカライテスク公司制造)、DA-67(和光纯药工业公司 制造)、トリトンX-405(非离子型表面活性剂；シグマアルドリッチ公 司制造)、氯化1-十二烷基吡啶(C12py)(变性剂；东京化成公司制造)、 十四烷基三甲基溴化铵(C14TMA)(变性剂；东京化成公司制造)、碘酸 钾(卤素氧化物；东京化成公司制造)、溴酸钾(卤素氧化物；东京化成 公司制造)、2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮[化合物(I)；ケミクレア公司制造]、 プロクリン950{2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮[化合物(I)]的9.5％水溶液；シ グマアルドリッチ公司制造}、2-甲基噻唑啉[化合物(II)；东京化成公 司制造]、链霉蛋白酶E(蛋白质分解酶；科研制药公司制造)、 FPOX-CET(糖化肽氧化酶；キッコーマン公司制造)、过氧化物酶(东洋 纺织公司制造)。

实施例1

制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的、表1中所示的HbA1c 测定试剂盒(试剂盒1～3；试剂盒a～e)。

第一试剂

第二试剂

[表1]

试剂盒 卤素氧化物 化合物(I)或化合物(II) 试剂盒1 碘酸钾(2.8mmol/L) 2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(2.3mmol/L) 试剂盒2 碘酸钾(2.8mmol/L) 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(4.1mmol/L) 试剂盒3 碘酸钾(2.8mmol/L) 2-甲基噻唑啉(4.9mmol/L) 试剂盒a 碘酸钾(2.8mmol/L) - 试剂盒b - 2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(2.3mmol/L) 试剂盒c - 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(4.1mmol/L) 试剂盒d - 2-甲基噻唑啉(4.9mmol/L) 试剂盒e - -

实施例2

制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的、表2中所示的HbA1c 测定试剂盒(试剂盒4～6；试剂盒f～i)。

第一试剂

第二试剂

[表2]

试剂盒 卤素氧化物 化合物(I)或化合物(II) 试剂盒4 碘酸钾(2.8mmol/L) 2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(2.3mmol/L) 试剂盒5 碘酸钾(2.8mmol/L) 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(4.1mmol/L) 试剂盒6 碘酸钾(2.8mmol/L) 2-甲基噻唑啉(4.9mmol/L) 试剂盒f 碘酸钾(2.8mmol/L) - 试剂盒g - 2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(2.3mmol/L) 试剂盒h - 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(4.1mmol/L) 试剂盒i - 2-甲基噻唑啉(4.9mmol/L) 试剂盒j - -

实施例3

制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的、表3中所示的HbA1c 测定试剂盒(试剂盒7～8；试剂盒k、g～j)。

第一试剂

第二试剂

[表3]

试剂盒 卤素氧化物 化介物(I)或化合物(II) 试剂盒7 溴酸钾(0.6mmol/L) 2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(2.3mmol/L) 试剂盒8 溴酸钾(0.6mmol/L) 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(4.1mmol/L) 试剂盒k 溴酸钾(0.6mmol/L) - 试剂盒g - 2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(2.3mmol/L) 试剂盒h - 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(4.1mmol/L) 试剂盒i - 2-甲基噻唑啉(4.9mmol/L) 试剂盒j - -

实施例4

使用实施例1的试剂盒1作为HbA1c测定试剂盒，使用来源于疑 似患有糖尿病的16名受试者的全血作为试样，按照以下步骤确定各试 样中的HbA1c浓度(量)相对于总血红蛋白浓度(量)的比例[HbA1c(％)]。

(1)用于确定总血红蛋白浓度的标准曲线的制作

使用作为总血红蛋白测定用试剂盒的ネスコートヘモ试剂盒 -N(氰化正铁血红蛋白法)(アルフレッサファーマ公司制造)作为测定试 剂盒，使用ネスコートヘモ试剂盒-N附带的标准液(血红蛋白浓度： 15.3g/dL)作为样本，制作表示血红蛋白浓度与吸光度的关系的标准曲 线。

(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作

由胶乳免疫凝聚法和血球级分(血球画分)的总血红蛋白值，对于 HbA1c浓度值为2.97μmol/L、7.80μmol/L的两个血球级分，使用实施 例1的试剂盒1进行测定，测定对各血球级分的吸光度。使用生理盐 水代替该血球级分，测定相对于生理盐水的HbA1c浓度。将从对该血 球级分的各吸光度中减去对生理盐水的吸光度而算出的值作为对该血 球级分的空白校正吸光度。根据对该血球级分的空白校正吸光度和对 生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)，制作表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸 光度之间的关系的标准曲线。

(3)各血球级分中的血红蛋白浓度的确定

对于各试样，在25℃下以3000rpm进行5分钟离心分离，得到血 球级分。对于各血球级分，使用ネスコートヘモ试剂盒-N进行测定， 由所得到的测定值和(1)的标准曲线确定各血球级分中的血红蛋白浓度 (μmol/L)。

(4)各血球级分中的HbA1c浓度的确定

对于各血球级分，使用实施例1的试剂盒1进行测定，由所得到 的测定值和(2)的标准曲线确定各血球级分中的HbA1c浓度(μmol/L)。

(5)HbA1c(％)(＝HbA1c浓度相对于血红蛋白浓度的比例)的确定

通过下式由上述(3)中确定的各血球级分中的血红蛋白浓度 (μmol/L)和上述(4)中确定的各血球级分中的HbA1c浓度(μmol/L)计算 出日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS)值的HbA1c(％)。

HbA1c(％)＝[HbA1c浓度(μmol/L)]/[血红蛋白浓度(μmol/L)]× 0.0963+1.62

(6)相同血球级分中的HbA1c(％)的通过免疫测定法的确定

使用与上述(5)中的HbA1c(％)的确定中使用的血球级分相同的血 球级分，通过使用デタミナーL HbA1c(协和梅迪克斯公司制造)的免疫 测定法，按照デタミナーL HbA1c的附带资料中记载的方法确定各血 球级分中的HbA1c(％)。

(7)使用本发明的测定试剂盒的测定方法与免疫测定法的相关性

根据通过使用本发明的测定试剂盒的测定方法而由上述(5)确定的 HbA1c(％)和使用免疫测定法而由上述(6)确定的HbA1c(％)，验证本发 明的测定方法与免疫测定法之间的相关关系，确定相关系数。

同样地，使用实施例1的试剂盒2～3、试剂盒a～e、实施例2的 试剂盒4～6、试剂盒f～j、实施例3的试剂盒7～8、试剂盒k各试剂 盒代替实施例1的试剂盒1，确定与使用デタミナーL HbA1c(协和梅迪 克斯公司制造)的测定之间的相关系数。将其结果示于表4中。

[表4]

试剂盒 相关系数 试剂盒1 0.9972 试剂盒2 0.9969 试剂盒3 0.9970 试剂盒a 0.9985 试剂盒b 0.9972 试剂盒c 0.9962 试剂盒d 0.9957 试剂盒e 0.9869 试剂盒4 0.9919 试剂盒5 0.9889 试剂盒6 0.9853 试剂盒f 0.9987 试剂盒g 0.9973 试剂盒h 0.9931 试剂盒i 0.9914 试剂盒j 0.9917 试剂盒7 0.9919 试剂盒8 0.9889 试剂盒k 0.9935

如表4所示，在使用实施例1～3的各试剂盒的HbA1c的测定方 法与免疫测定法之间确认到良好的相关关系。因此确认，通过使用实 施例1～3的各试剂盒，能够准确地测定试样中的HbA1c。

实施例5

使用实施例1的试剂盒1作为HbA1c测定试剂盒，使用通过以下 的方法制备的抗坏血酸的影响确认用试样作为试样，通过以下步骤确 定各试样中的HbA1c浓度(μmol/L)。

(1)抗坏血酸的影响确认用试样的制备

对于通过将人血液离心分离而得到的血球级分，使用作为总血红 蛋白测定用试剂盒的ネスコートヘモ试剂盒-N(氰化正铁血红蛋白 法)(アルフレッサファーマ公司制造)确定血红蛋白浓度后，在利用纯 化水将该血球级分稀释的同时使其溶血，制备血红蛋白浓度为 6.4mg/mL的血红蛋白溶液。

向所制备的该血红蛋白溶液中添加抗坏血酸，制备抗坏血酸浓度 为0.5mg/dL、1mg/dL、2mg/dL和5mg/dL的各血红蛋白溶液，作为抗 坏血酸的影响确认用试样。另外，将所制备的该血红蛋白溶液本身作 为抗坏血酸浓度为0mg/mL的抗坏血酸的影响确认用试样。

(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作

通过实施例4的(2)的方法，制作表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸光 度之间的关系的标准曲线。

(3)抗坏血酸的影响确认用试样中的HbA1c浓度的确定

对于上述(1)中制备的抗坏血酸的影响确认用试样的各试样，使用 实施例1的试剂盒1进行测定，由所得到的测定值和(2)的标准曲线确 定各试样中的HbA1c浓度(μmol/L)。将抗坏血酸浓度为0mg/dL的抗坏 血酸的影响确认用试样中的HbA1c浓度(μmol/L)设为100时，确定抗 坏血酸浓度为0.5mg/dL、1mg/dL、2mg/dL的抗坏血酸的影响确认用试 样的各试样中的HbA1c浓度(μmol/L)的相对值。

使用实施例1的试剂盒2～3、试剂盒a～e各试剂盒代替实施例1 的试剂盒1，通过同样的步骤进行测定，确定各试样中的HbA1c浓度 (μmol/L)的相对值。将所确定的相对值示于表5中。相对值越接近100， 表示越不易受到抗坏血酸的影响。

[表5]

由表5可知，对于含有碘酸钾以及化合物(I)或化合物(II)的试剂盒 1～3而言，与不含有碘酸钾、以及化合物(I)或化合物(II)中的至少一种 的试剂盒(试剂盒a～e)相比，HbA1c浓度的相对值接近100，不易受到 抗坏血酸的影响。

实施例6

使用实施例2的试剂盒4～6、试剂盒f～j各试剂盒代替实施例1 的试剂盒1，除此以外，通过与实施例5相同的方法确定抗坏血酸的影 响确认用试样的各试样中的HbA1c浓度(μmol/L)的相对值。将确定的 HbA1c浓度(μmol/L)的相对值示于表6中。

[表6]

由表6可知，对于含有碘酸钾以及化合物(I)或化合物(II)的试剂盒 4～6而言，与不含有碘酸钾、以及化合物(I)或化合物(II)中的任意一种 或两种的试剂盒(试剂盒f～j)相比，HbA1c浓度的相对值接近100，不 易受到抗坏血酸的影响。

实施例7

使用实施例3的试剂盒7～8、试剂盒k、g～j各试剂盒代替实施 例1的试剂盒1，除此以外，通过与实施例5相同的方法确定抗坏血酸 的影响确认用试样的各试样中的HbA1c浓度(μmol/L)的相对值。将确 定的HbA1c浓度(μmol/L)的相对值示于表7中。

[表7]

由表7可知，对于含有溴酸钾以及化合物(I)或化合物(II)的试剂盒 7～8而言，与不含有溴酸钾、以及化合物(I)或化合物(II)中的任意一种 或两种的试剂盒(试剂盒k、g～j)相比，HbA1c浓度的相对值接近100， 不易受到抗坏血酸的影响。

因此可知，在使用含有卤素氧化物以及化合物(I)或化合物(II)的试 剂盒的HbA1c的测定中，抗坏血酸的影响被显著抑制。

产业上的可利用性

根据本发明，能够提供抑制抗坏血酸在含有糖化血红蛋白的试样 中的糖化血红蛋白的测定中的影响的方法、含有糖化血红蛋白的试样 中的糖化血红蛋白测定用试剂。本发明的抑制抗坏血酸的影响的方法 和糖化血红蛋白测定用试剂对于糖尿病的诊断等是有用的。