用于预防或治疗认知功能障碍的包含斯皮诺素的药物组合物

摘要

包含斯皮诺素(spinosin)或含斯皮诺素草本提取物的本发明的药物组合物是用于预防和治疗认知功能障碍的组合物，并且能够有效地改善记忆和学习能力，并且有效地治疗和预防认知功能障碍如痴呆和遗忘症。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预防和治疗认知损伤(认知障碍，congnitive  impairments)的包含斯皮诺素(spinosin)的药物组合物。更特别地，本发明 涉及这样的药物组合物，其能够改善记忆和学习能力，因此有效地预防 和治疗疾病如痴呆(dementia)和遗忘症(amnesia)。

背景技术

随着医学技术的发展和生活标准的提高，在过去的半个世纪人的平 均寿命已经几乎翻倍，并且因此老年人口在总人口中的比例快速增加。 随着老龄化社会的发展，老年痴呆已经成为二十一世纪需要解决的主要 健康问题之一。因此，对开发能够预防和治疗包括痴呆在内的认知损伤 的功能材料、食品等的需求增加。

痴呆，作为一种典型的认知损伤疾病，是需要与正常衰老区分开并 且被归类到阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)，血管性痴呆(vascular  dementia)，以及其他由酒精中毒、外伤、帕金森病(Parkinson′s disease)后 遗症等导致的痴呆的病理状态。

已经报道，阿尔茨海默病是一种慢性精神病，包括高级大脑功能的 障碍如记忆丧失，受损的意识，时空混沌(spatiotemporal chaos)，思维能 力，运算能力，判断，常识等。此外，已经报道，阿尔茨海默病也出现 在相对年轻的人中并且最经常发生在老年人中，在65岁到85岁的范围 内，每增加5岁，发病率增加两倍。虽然阿尔茨海默病的发病机理并不 是清楚知晓，但是中枢神经系统中乙酰胆碱功能的减少最普遍发生，并 且因此已经使用了这样的治疗方法：施用乙酰胆碱前体或抑制乙酰胆碱 降解的药物以增加乙酰胆碱在脑中的浓度。因此，乙酰胆碱酯酶(下文中， “AChE”)抑制剂已经被单独使用或与现有的胆碱酯酶抑制剂结合使用， 并且这样的药物的实例包括他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利斯 的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)等。虽然这些药物是乙酰胆碱 酯酶抑制剂，但它们仅减慢疾病的进展，而对治疗效果很小并且在疾病 开始时具有有限的治疗潜力，并且因此已经努力来开发治疗阿尔茨海默 病的潜在病因的药物(Terry和Buccafusco，2003；Kar等，2004； Akhondzadeh等，2008；Cummings等，2008；Voss等，2008)。

血管性痴呆主要是由由于对脑特定部分的供血缺乏(由大脑动脉硬 化引起)所致的对脑细胞的损伤导致的。血管性痴呆和阿尔茨海默病的 病因是不同的，但是它们的相同之处在于它们引起对记忆和学习能力的 损害。

因此，本发明的发明人研究并开发了用于预防或治疗认知损伤如痴 呆的有效药物，并且找到了可以有效地改善记忆和学习能力的草本提取 物(药草浸液，herbal extract)及其活性成分，由此完成了本发明。

现有技术文献

专利文献

KR 10-2010-0034779；

KR 10-2004-0083414；

KR 10-2003-0062963。

非专利文献

2009Alzheimer′s disease facts and figures(2009年阿尔茨海默病事实 和数据)，Alzheimer’s Dement(2009)5(3)：p.234-70；

Whitehouse，P.J.，Price，D.L.，Struble，R.G.，Clark，A. W.，Coyle，J.T.，和Delong，M.R.(1982)Alzheimer′s disease and  senile dementia：loss of neurons in the basal forebrain(阿尔茨海默病和老年 痴呆：基底前脑中的神经元损失).Science 215，1237-12392；

Hyman，B.T.，Van Hoesen，G.W.，Damasio，A.R.，和 Barnes，C.L.(1984)Alzheimer′s disease：cell-specific pathology isolates  the hippocampal formation(阿尔茨海默病：细胞特异性病理学分离海马形 成).Science225，1168-11703。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供用于预防或治疗认知损伤的药物组合物，所述 药物组合物包含斯皮诺素。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗认知损伤的药物组合 物，所述药物组合物包含含斯皮诺素的草本提取物(spinosin-containing  herbal extract)。

本发明的另一个目的是提供用于预防或改善认知损伤的食品组合 物，所述食品组合物包含斯皮诺素。

本发明的另一个目的是提供用于预防或改善认知损伤的食品组合 物，所述食品组合物包含含斯皮诺素的草本提取物。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗脑退行性疾病 (degenerative brain disease)的药物组合物，所述药物组合物包含斯皮诺素。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗脑退行性脑疾病的药物 组合物，所述组合物包含含斯皮诺素的草本提取物。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗认知损伤或脑退行性脑 疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用包含斯皮诺素的组合 物。

技术方案

本发明涉及用于预防或治疗认知损伤的药物组合物，所述药物组合 物包含斯皮诺素。

斯皮诺素(6-(2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)-5-羟基-2-(4-羟 基苯基)-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)是由下式1表示的化合物：

由上式1表示的斯皮诺素可以预防或治疗认知损伤。更特别地，由 上式1表示的斯皮诺素可以改善记忆和学习能力，因此有效地预防和治 疗认知损伤。

本发明的包含斯皮诺素的药物组合物可以显著提高具有由东莨菪碱 (scopolamine)引发的记忆受损的动物模型的学习能力、空间感知能力和记 忆，并因此在预防或治疗认知损伤中展示优异的活性并且尤其可用于改 善痴呆和遗忘症。

由上式1表示的斯皮诺素可以从多种类型的草本药物获得。例如， 由上式1表示的斯皮诺素可以获自无刺枣(Zizyphus jujuba Mill var. inermis)，Zizyphus jujuba Mill var.hoonensis，酸枣(Zizyphus jujuba Mill var. spinosa)，黄果西番莲(Passiflora edulis flavicarpa)，Cayaponia tayuya，南 美山蚂蝗(Desmodium tortuosum)，Wilbrandia ebracteata，宿萼木 (Strophioblachia fimbricalyx)，Clutia abyssinica，刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa)，或其混合物，并且可以优选地获自酸枣仁(酸 枣的种子)。

由上式1表示的斯皮诺素可以获自上述草本药物或其混合物的提取 物，并且由上式1表示的斯皮诺素可以优选地获自上述草本药物或其混 合物的水、甲醇、乙醇、丁醇或己烷提取物。例如，由上式1表示的斯 皮诺素可以获自酸枣仁(酸枣的种子)的提取物。

优选地，由上式1表示的斯皮诺素可以获自酸枣仁(酸枣的种子)的乙 醇提取物的提取物。

另外的，由上式1表示的斯皮诺素可以是商购获得的。

根据本发明，认知损伤是指由受损的功能如记忆、空间感知能力、 判断、执行功能、语言能力等引起的疾病，并且可以包括，例如，阿尔 茨海默病，血管性痴呆，其他由多种因素酒精中毒、外伤、帕金森病后 遗症等引起的痴呆，或遗忘症。优选地，认知损伤可以是阿尔茨海默病。

本发明的包含斯皮诺素的药物组合物甚至以小的量就可以有效地抑 制小鼠中的东莨菪碱引发的记忆损伤。

斯皮诺素是包含在上述草本药物中的成分并且可以有效地预防或治 疗认知损伤而没有副作用。

在根据本发明的用于预防或治疗认知损伤的包含斯皮诺素的药物组 合物中，对于成人，斯皮诺素可以以约1mg至120mg的日剂量、优选地 以30mg至120mg的日剂量施用一次或若干次。然而，斯皮诺素的剂量 可以根据患者的状态如患者的严重度、年龄、性别、重量等以及制剂、施 用途径和施用周期被合适地调整。

本发明涉及用于预防和治疗认知损伤的药物组合物，其包含由上式1 表示的斯皮诺素以及无刺枣(Zizyphus jujuba Mill var.inermis)、Zizyphus  jujuba Mill var.hoonensis、酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa)、黄果西 番莲(Passiflora edulis flavicarpa)、Cayaponia tayuya，南美山蚂蝗 (Desmodium tortuosum)、Wilbrandia ebracteata、宿萼木(Strophioblachia  fimbricalyx)、Clutia abyssinica、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)或 其混合物的提取物。

上述无刺枣(Zizyphus jujuba Mill var.inermis)、Zizyphus jujuba Mill var. hoonensis、酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa)、黄果西番莲(Passiflora  edulis flavicarpa)、Cayaponia tayuya，南美山蚂蝗(Desmodium tortuosum)、 Wilbrandia ebracteata、宿萼木(Strophioblachia fimbricalyx)、Clutia  abyssinica和刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)包含由上式1表示的 斯皮诺素。因此，与斯皮诺素一样，包含上述草本药物的提取物的组合物 可以预防或治疗认知损伤，并且没有副作用，因为其是草本提取物。

本发明的药物组合物可以包含酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa) 的提取物，优选地酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa)的种子的水、己烷、 乙醇、甲醇、丁醇或其混合物提取物，更优选地乙醇提取物。

含斯皮诺素的草本提取物可以有效地预防或治疗认知损伤而没有副 作用。

本发明的草本提取物包含斯皮诺素并因此可以显著改善具有由东莨 菪碱引发的记忆损伤的动物模型的学习能力、空间感知能力和记忆，并因 此在预防或治疗认知损伤中展示优异活性并且尤其可用于改善痴呆和遗 忘症。

本发明的药物组合物可以相对于该组合物的总重量包含0.1至50重 量％的量的草本提取物。然而，对该含量不必需限制，而是可以根据患者 的状态以及疾病的类型和进展来变化。

在根据本发明的用于预防或治疗认知损伤的包含草本提取物的药物 组合物中，对于成人，草本提取物可以约10mg至1200mg的日剂量、优 选地以300mg至1200mg的日剂量施用一次或多次。然而，草本提取物 的剂量可以根据患者的状态如患者的严重度、年龄、性别、重量等以及制 剂、施用途径和施用周期被合适地调整。

包含由上式1表示的斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取物的药物组合 物没有毒性和副作用，并因此可以放心使用，即使是在为了预防或治疗目 的而长期服用时。

本发明涉及用于预防或治疗认知损伤或脑退行性脑疾病的药物组合 物，所述组合物包含斯皮诺素的药用盐。术语“药用盐”是指制药工业中常 用的盐，如与钾，钠，镁等形成的无机离子盐，与盐酸，硝酸，磷酸，溴 酸，碘酸，高氯酸，酒石酸，硫酸等形成的无机酸盐，与乙酸，三氟乙酸， 柠檬酸，马来酸，琥珀酸，草酸，苯甲酸，酒石酸，富马酸，扁桃酸，丙 酸，乳酸，羟基乙酸，葡糖酸，半乳糖醛酸，谷氨酸，戊二酸，葡糖醛酸， 天冬氨酸，抗坏血酸，碳酸，香草酸，氢碘酸等形成的有机酸盐，与甲磺 酸，乙磺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，萘磺酸等形成的磺酸盐，与甘氨酸， 精氨酸，赖氨酸等形成的氨基酸盐，以及与三甲胺，三乙胺，氨，吡啶， 皮考啉等形成的胺盐，但是用于本发明的盐的类型不限于上述盐。

认知损伤可以是痴呆或遗忘症，并且脑退行性脑疾病可以是帕金森 病，卒中，卒中，或亨廷顿病(Huntington’s disease)。

在不损害本发明的效果的范围内，本发明的药物组合物还可以包含药 用添加剂如稀释剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，pH调节剂，抗氧化剂和 增溶剂。

稀释剂可以包括糖，淀粉，微晶纤维素，乳糖(乳糖水合物)，葡萄糖， D-甘露醇，藻酸盐，碱土金属盐，粘土，聚乙二醇，无水磷酸氢钙及其混 合物；而粘合剂可以包括淀粉，微晶纤维素，高分散二氧化硅，甘露醇， D-甘露醇，蔗糖，乳糖水合物，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮 (povidone))，聚乙烯吡咯烷酮共聚物(共聚维酮(copovidone))，羟丙甲纤维 素，羟丙基纤维素，天然树胶，合成树胶，共聚维酮(copovidone)，明胶及 它们的混合物。

崩解剂可以包括淀粉或改性淀粉如羟基乙酸淀粉钠，玉米淀粉，马铃 薯淀粉，预胶凝淀粉(pregelatinized starch)等；粘土如膨润土，蒙脱土，维 格姆(veegum)等；纤维素如微晶纤维素，羟丙基纤维素，羧甲基纤维素等； 藻酸类如藻酸钠，藻酸等；交联纤维素如交联羧甲基纤维素钠等；树胶如 瓜尔胶，黄原胶等；交联聚合物如交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮 (crospovidone))等；泡腾剂(effervescent agents)如碳酸氢钠，柠檬酸等；及 它们的混合物。

润滑剂可以包括滑石，硬脂酸，硬脂酸镁，硬脂酸钙，十二烷基硫酸 钠，氢化植物油，苯甲酸钠，硬脂酰富马酸钠，山嵛酸甘油酯，单酸甘油 酯(glyceryl monorate)，单硬脂酸甘油酯，棕榈酰硬脂酸甘油酯，胶体二氧 化硅及它们的混合物。

pH调节剂可以包括酸化剂如乙酸，己二酸，抗坏血酸，抗坏血酸钠， 钠乙醚络合物(sodium etherate)，苹果酸，琥珀酸，酒石酸，富马酸，和柠 檬酸，以及碱化剂如沉淀碳酸钙，氨水，葡甲胺(meglumine)，碳酸钠，氧 化镁，碳酸镁，柠檬酸钠，和磷酸三钙。

抗氧化剂可以包括二丁基羟基甲苯，丁基羟基苯甲醚，乙酸生育酚， 生育酚，没食子酸丙酯，亚硫酸氢钠，和焦亚硫酸钠。可以用于本发明的 之前释放室(prior-release compartment)的增溶剂可以包括十二烷基硫酸钠， 聚氧化乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯如聚山梨醇酯，多库脂钠(docusate  sodium)，泊洛沙姆(poloxamer)等。

对于口服施用，根据本发明的包含斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取 物的药物组合物可以被制成固体剂型如片剂，丸剂，粉剂，粒剂，胶囊等， 并且这些固体剂型可以通过将斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取物与一 种或多种赋形剂如淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等混合来制备。此外， 除了简单的赋形剂外还可以使用润滑剂如硬脂酸镁，滑石等。此外，所述 药物组合物可以被制成液体剂型如混悬剂，内用液体，乳剂，糖浆等，并 且除了水和液体石蜡以外，多种赋形剂如保湿剂，增甜剂，芳香剂，防腐 剂等可以用于液体剂型的配制。

对于肠胃外施用，根据本发明的包含斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提 取物的药物组合物可以包括无菌水溶液，非水溶剂，混悬剂，乳剂，冻干 制剂，和栓剂。合适的非水溶液和混悬剂可以包括丙二醇，聚乙二醇，植 物油如橄榄油，和可注射酯类如油酸乙酯。用于栓剂的基质可以包括 Witepsol，聚乙二醇(macrogol)，Tween 61，可可油脂(cacao butter)，月桂 精油脂(laurin butter)，甘油明胶等。

当在本文中使用时，术语“施用”是指将根据本发明的用于预防和治疗 认知损伤的组合物以任何适当的方式引入到患者，并且根据本发明的用于 预防和治疗认知损伤的组合物可以经由任何常规施用途径施用，只要所述 组合物可以到达靶组织。例如，组合物可以口服施用，腹膜内施用，静脉 内施用，肌肉内施用，皮下施用，皮内施用，鼻内施用，肺内施用，直肠 施用，腔内施用，腹膜内施用，或硬膜内施用，但不限于此。例如，组合 物可以通过经口，直肠，或静脉内，肌肉内，皮下，子宫内膜，或脑室内 注射施用。

根据本发明的药物组合物可以以规则间隔时间每天施用一次或多次。

根据本发明的药物组合物还可以包含有效治疗认知损伤的其他活性 成分。

根据本发明的药物组合物可以单独用于预防或治疗认知损伤，或可以 与多种方法如激素疗法，药物疗法等联合用于预防或治疗认知损伤。

本发明涉及用于预防或改善认知损伤的食品组合物，所述组合物包含 由上式1表示的斯皮诺素，其药用盐，或含斯皮诺素的草本提取物。

根据本发明的食品组合物还可以包含常用于食品组合物，保健功能食 品或饮料的添加剂。

例如，本发明的食品组合物可以包含增甜剂如白糖，晶体果糖，葡萄 糖，D-山梨醇，甘露醇，异麦芽低聚糖，甜菊苷(stevioside)，阿斯帕坦 (aspartame)，丁磺氨钾(acesulfame potassium)，半乳蔗糖等，酸化剂如 无水柠檬酸，DL-苹果酸，琥珀酸，及其盐，防腐剂如苯甲酸及其衍生物， 多种营养物，维生素，矿物质(电解质)，调味剂如合成的和天然的调味剂， 着色剂和填充剂(干酪，巧克力等)，果胶酸及其盐，藻酸及其盐，有机酸， 保护性胶体增稠剂，pH调节剂，稳定剂，防腐剂，甘油，醇，用于碳酸 饮料的碳酸化剂(carbonators)等。此外，本发明的食品组合物可以包含 果浆以用于制备天然果汁和蔬菜汁。该添加剂可以相对于100重量份的食 品组合物以小于约20重量份的量使用。

当本发明的食品组合物是饮料时，其还可以包含调味剂或天然碳水化 合物。合适的天然碳水化合物可以包括单糖如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽 糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及糖醇如木糖醇，山梨糖醇，和赤藻 糖醇。此外，合适的调味剂可以包括天然调味剂如索马甜(thaumatin)和甜 叶菊提取物(甜菊苷A(rebaudioside A)，甘草甜素等)和合成的调味剂如糖 精和阿斯帕坦。当食品组合物是饮料时，天然碳水化合物可以相对于100 mL的组合物以约1至20g、优选地约5至12g的量被包含。

根据本发明的包含斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取物的食品组合 物可以被制成粉剂，粒剂，片剂，胶囊或饮料的形式并且用作食品，饮料， 香口胶，茶，复合维生素，保健食品等。

根据本发明的包含斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取物的组合物可 以被添加至药物，食品，饮料等用于预防和治疗认知损伤。例如，根据本 发明的包含斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取物的组合物可以被添加到 食品，饮料，香口胶，茶，复合维生素，保健食品等。

根据本发明的包含斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取物的食品组合 物可以被加入到食品或饮料中以用于预防或改善认知损伤。本发明的组合 物可以相对于食品的总重量以1至5重量％的量添加并且可以相对于100 mL的饮料以0.02至10g、优选地0.3g至1g的量添加。

本发明提供用于预防或治疗脑退行性脑疾病的药物组合物，所述组合 物包含斯皮诺素。由上式1表示的斯皮诺素可以有效地预防或治疗脑梗死 (cerebral infarction)，卒中，帕金森病，或亨廷顿病。

本发明提供用于预防或治疗脑退行性脑疾病的药物组合物，所述组合 物包含含斯皮诺素的草本提取物。含斯皮诺素的草本提取物可以有效地预 防或治疗脑梗死，卒中，帕金森病，或亨廷顿病。草本提取物可以获自无 刺枣(Zizyphus jujuba Mill var.inermis)、Zizyphus jujuba Mill var.hoonensis、 酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa)、黄果西番莲(Passiflora edulis  flavicarpa)、Cayaponia tayuya，南美山蚂蝗(Desmodium tortuosum)、 Wilbrandia ebracteata、宿萼木(Strophioblachia fimbricalyx)、Clutia  abyssinica、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)，或其混合物，并且可 以优选地获自酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa)的种子。

本发明提供用于预防或治疗认知损伤或脑退行性脑疾病的方法，所述 方法包括向有此需要的对象施用包含斯皮诺素或其药用盐的组合物。认知 损伤可以是痴呆或遗忘症，并且脑退行性脑疾病可以是脑梗死，卒中，帕 金森病，或亨廷顿病。

本发明提供用于预防或治疗认知损伤或脑退行性脑疾病的方法，所述 方法包括向有此需要的对象施用包含含斯皮诺素的草本提取物的组合物。 草本提取物可以获自无刺枣(Zizyphus jujuba Mill var.inermis)、Zizyphus  jujuba Mill var.hoonensis、酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa)、黄果西 番莲(Passiflora edulis flavicarpa)、Cayaponia tayuya，南美山蚂蝗 (Desmodium tortuosum)、Wilbrandia ebracteata、宿萼木(Strophioblachia  fimbricalyx)、Clutia abyssinica、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)， 或其混合物，并且可以优选地获得自酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spinosa) 的种子。

有益效果

根据本发明的包含斯皮诺素或含斯皮诺素的草本提取物的药物组合 物可以有效地预防或治疗认知损伤。具体地，根据本发明的包含斯皮诺素 或含斯皮诺素的草本提取物的药物组合物可以显著改善记忆和学习能力， 并因此有效地预防或治疗痴呆。

附图说明

图1显示根据本发明的包含斯皮诺素的药物组合物对改善记忆和学 习能力的效果。

图2至5显示根据本发明的包含含斯皮诺素的酸枣仁提取物的药物 组合物对改善记忆和学习能力的效果。

具体实施方式

下文中，将参考以下实施例和实验实施例详细地描述本发明。然而， 以下实施例和实验实施例仅是举例说明本发明并且本发明不受以下实施 例和实验实施例的限制。

此外，除非另外说明，以下提及的所有试剂和溶剂购自Sigma，并 且使用JASCO P-1020偏光计测量旋光。UV谱用Hitachi JP/U3010测量， IR谱用JASCO FT/IR-5300测量，NMR谱用Bruker Avance 400(400MHz) 测量，而FAB质谱用JEOL JMS-700质谱仪测量。

实施例1：制备含斯皮诺素的酸枣仁提取物

将12kg的酸枣仁(酸枣(Zizyphus jujuba Mill var.spmosa)的种子，Huex  H.F.Chou)用破碎机碾碎并且将其分布到提取瓶中，将正己烷加入到碾碎 的酸枣仁中直至其覆盖碾碎的酸枣仁的表面，并且使混合物在室温静置3 天，然后过滤。当在将相同的方法重复四次后己烷溶液透明时，将己烷提 取物合并并浓缩。

在移除己烷提取物后，将70％乙醇加入到剩余的酸枣仁中直至其覆盖 酸枣仁的表面，并且使混合物在室温静置3天，然后在减压下过滤和浓缩。 将70％(v/v)乙醇加入到残余物中，然后在水浴中提取，之后过滤和浓缩。 通过添加70％(V/v)乙醇然后在水浴中提取并且过滤的方法进行6次提取， 并且将全部提取物合并并在减压下浓缩，得到酸枣仁的70％(v/v)乙醇软浸 膏(soft ext.)。

实施例2：分离和纯化斯皮诺素

将正己烷、甲醇和水以10∶9∶1的体积比加入到以上实施例1中制备的 酸枣仁的乙醇软浸膏中，将混合物摇动并且使其静置过夜以除去己烷可溶 性级分，然后将90％甲醇级分在减压下浓缩。将蒸馏水加入到浓缩的90％ (v/v)甲醇级分，加入与蒸馏水等量的乙酸乙酯，然后移除乙酸乙酯级分。 将等量的正丁醇加入到水层，然后将正丁醇级分在减压下浓缩。

将通过在减压下浓缩获得的正丁醇级分加载到硅胶柱上并利用体积 比为7∶1∶0.5、7∶1.5∶0.5和7∶2∶0.5的二氯甲烷、甲醇和水的溶液作为洗脱剂 进行层析(7∶1∶0.5→7∶1.5∶0.5→7∶2∶0.5→MeOH)而获得三十个小级分，并 且通过进行TLC由该三十个小级分获得含有斯皮诺素的第25个小级分。

将第25个小级分加载到硅胶柱上并利用体积比为100∶8∶6、100∶10∶7.5、 100∶12∶9的乙酸乙酯、甲醇和水的溶液作为洗脱剂进行层析(100∶8∶6→ 100∶10∶7.5→100∶12∶9)而获得小级分，并且通过进行TLC由该小级分获得 含有斯皮诺素的第3个小级分。

利用甲醇使第3个小级分重结晶，从而得到斯皮诺素(3.2g)，为浅黄 色非晶体粉末(产率：0.027％)。

斯皮诺素的物化性质如下：

TLC Rf：0.27(吸收剂：硅胶GF₂₅₄，显影溶剂：氯仿/甲醇/水 (520∶280∶80)，显色剂：20％硫酸溶液)

熔点：237-240℃

[α]_D²⁴＝-47.5°(c＝0.01，MeOH)

UV，λ_max(logε)(MeOH)216(sh，4.74)，272(4.46)，334(4.52)nm

IR，υ_max3141(OH)，1649，1603，1484，1453，1347，1196， 1054，1020，841cm^-1

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆+D₂O)δ：2.56(1H，dt，J＝9.0Hz， H-5″′)，2.74(1H，dt，J＝9.4Hz，H-5″′)，2.83(2H，t，J＝8.3，H-2″′)， 2.93(2H，br d，9.4Hz，H-6″′)，2.94，2.99(1H各自，t，J＝8.5Hz， H-4″′)，3.39(2H，br d，J＝12.1Hz，H-6″)，3.70(2H，t，J＝9.0Hz， H-3″′)，3.88(6H，s，OCH₃)，4.15(2H，d，J＝7.8，H-1″′)，4.28，4.45 (1H各自，t，J＝9.3Hz，H-2″)，4.68(2H，d，J＝9.8Hz，H-1″)，6.77， 6.79(1H各自，s，H-8)，6.80(2H，s，H-3)，6.94(4H，d，J＝8.6Hz， H-3′，5′)，7.95(4H，d，J＝8.6Hz，H-2′，6′)，13.5，13.6(1H各自，s， 5-OH)

¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆+D₂O)δ：56.5，56.9(OCH₃)，60.2， 60.8(C-6″′)，61.6(C-6″)，69.3，69.6(C-4″′)，70.6(C-4″)，71.1，71.4 (C-1″)，74.7，74.8(C-2″′)，76.4(C-3″′)，76.6，76.8(C-5″′)，78.4，78.7 (C-3″)，80.9，81.3(C-2″)，81.7，82.0(C-5″)，90.8，91.3(C-8)，103.4， 103.5(C-3)，104.5，104.7(C-10)，105.4，105.6(C-1″′)，108.8(C-6)， 116.4(C-3′，5′)，121.4，121.5(C-1′)，128.9(C-2′，6′)，157.4，157.5 (C-9)，159.6，160.5(C-5)，161.4(C-4′)，164.2(C-2)，164.3，165.4 (C-7)，182.3，182.6(C-4)

正FAB-MSm/z609[M+H]⁺

实验实施例：确定对痴呆治疗的效果

使用具有由东莨菪碱引发的记忆损伤的模型进行实验以确定实施例1 和2中制备的斯皮诺素和含有斯皮诺素作为活性成分的酸枣仁提取物的效 果，并且详细的实验方法如下：

1)制备实验动物

使重约26至28g的6周龄ICR小鼠(Orient Bio Inc.，Korea)在温度为 约23±2℃、湿度为约55±10％并且亮暗周期为12小时的环境(韩国庆照 大学(Kyung Hee university)药学院的动物实验室)中用可自由获得的水和食 物饲养5天，并且将其用于实验中。

2)统计分析

所有实验数据的统计分析使用单因素方差分析(ANOVA)进行，并且在 统计学显著性被确认时，使用Student-Newman-Keuls测试以P＜0.05评估 显著性。

3)实验实施例1：被动回避试验(passive avoidance test)1

制备被动回避试验设备用于实验。将被动回避试验设备分为第一空间 和第二空间，闸门(guillotine door)被放置在两个空间之间，并且第一和第 二空间通过该门连接。使用照明保持第一空间是亮的，而保持第二空间是 暗的。保持暗的第二空间的地板设置有网格，并且当实验动物移动到暗空 间时通过地板上的网格施加0.5mA的电击达3秒。

将以上部分1)中准备的小鼠分为7组，包括施用斯皮诺素的给药组1 至4，以及对照组1至3(每组10只小鼠)。将实施例2的斯皮诺素溶解在 10％Tween 80(聚氧化乙烯脱水山梨醇单油酸酯：Sigma，U.S.A.)中并且以 2.5mg/Kg，5mg/Kg，10mg/Kg和20mg/Kg的剂量施用到给药组1至4。 同时，将多奈哌齐(donepezil)(Sigma-Aldrich Chemistry Co.)以5mg/Kg的 剂量施用到对照组1，并且将10％Tween 80以0.15mL的剂量施用到对照 组2和3。

在约30分钟后，将溶解在蒸馏水中的东莨菪碱(Sigma-Aldrich  Chemistry Co.)以1mg/Kg的剂量经腹膜内施用到给药组1至4和对照组1 和2(Ebert，U.等，Eur.J.Clin.Invest.，28，pp944-949，1998)，并且将0.9％盐 水溶液经腹膜内施用到对照组3。在30分钟后，分别对给药组1至4和对 照组1至3中的小鼠进行对被动回避试验设备的学习。具体地，将小鼠置 于保持亮的第一空间中，并且在约20秒的寻道时间后，打开闸门，并且 测量小鼠移动到保持暗的第二空间所需的等待时间。

直到闸门打开后过去60秒才移动到保持暗的第二空间的小鼠从实验 中排除。

在自从学习完成起24小时后，分别对给药组1至4和对照组1至3 进行本实验。测量从10秒的寻道时间起在闸门打开后小鼠的四只脚全部 进入暗空间所需的等待时间，直至300秒。较长的等待时间表示被动回避的学习和记忆更佳。

在学习中以及在本实验中，每组中的小鼠的平均等待时间显示在以下 表1和图1：

[表1]

实验组 学习(秒) 本实验(秒) 给药组1(2.5mg/Kg) 25.88±13.72 59.13±46.88 给药组2(5mg/Kg) 29.38±18.17 107.1±91.70 给药组3(10mg/Kg) 20.50±9.196 131.3±69.94 给药组4(20mg/Kg) 36.00±16.45 146.0±83.53 对照组1(多奈哌齐) 25.13±13.68 151.9±37.24 对照组2 26.50±18.16 41.33±18.92 对照组3 29.17±18.15 300

如由表1和图1可见，施用了实施例2中制备的斯皮诺素的给药组1 至4中的小鼠移动到第二空间所需的等待时间与仅施用东莨菪碱的对照组 2中的相比显著增加。具体地，以2.5mg/Kg的剂量施用斯皮诺素的给药 组1中的等待时间与对照组2中的相比增加约20秒，而以5mg/Kg的剂 量施用斯皮诺素的给药组2中的等待时间与对照组2中的相比增加约2.5 倍。此外，以10mg/Kg的剂量施用斯皮诺素的给药组3中的等待时间与 对照组2中的相比增加约3倍，而以20mg/Kg的剂量施用斯皮诺素的给 药组4中的等待时间与对照组2中的相比增加约3.5倍。特别地，可见， 给药组3和4中具有由东莨菪碱引发的记忆损伤的小鼠的记忆和学习能力 提高至与施用多奈哌齐的对照组1中的类似的程度。

由这些结果可见，实施例2中制备的斯皮诺素可以有效地预防或治疗 认知损伤如痴呆。

4)实验实施例2：被动回避试验2

通过与实验实施例1相同的方法对给药组1至4和对照组1至3进行 被动回避试验，不同之处在于实施例1中用70％乙醇提取的酸枣仁提取物 溶解在10％Tween 80中并且以25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg和200 mg/kg的剂量施用到给药组1至4。

实验的结果显示在以下表2和图2中：

[表2]

实验组 学习(秒) 本实验(秒) 给药组1(25mg/Kg) 25.75±15.92 49.50±46.26 给药组2(50mg/Kg) 23.25±18.17 40.00±17.51 给药组3(100mg/Kg) 32.13±18.92 173.9±77.84 给药组4(200mg/Kg) 27.75±19.00 112.8±89.67 对照组1(多奈哌齐) 17.25±5.365 140.5±25.47 对照组2 32.80±21.26 26.10±25.27 对照组3 21.00±8.380 228.7.00±50.65

如由表2和图2可见，施用了实施例1中制备的含斯皮诺素的酸枣仁 提取物的给药组1至4中的小鼠移动到第二空间所需的等待时间与仅施用 东莨菪碱的对照组2中的相比显著增加。具体地，分别以25mg/Kg和50 mg/Kg的剂量施用斯皮诺素的给药组1和2中的等待时间与对照组2中的 相比增加了约2倍。此外，以100mg/Kg的剂量施用斯皮诺素的给药组3 中的等待时间与对照组2中的相比增加了约6倍，而以200mg/Kg的剂量 施用斯皮诺素的给药组4中的等待时间与对照组2中的相比增加了约4.3 倍。特别地，可见，给药组3和4中具有由东莨菪碱引发的记忆损伤的小 鼠的记忆和学习能力提高至与施用多奈哌齐的对照组1中的类似的程度。

由这些结果可见，实施例1中制备的含斯皮诺素的酸枣仁提取物可以 有效地预防或治疗认知损伤如痴呆。

5)实验实施例3：Y迷宫试验

准备Y迷宫用于实验。Y迷宫具有三个臂部，其中每个臂部为42cm 长，3cm宽和12cm高，由三个臂部形成的角为120度，并且Y迷宫由 黑色聚乙烯树脂制成。

将以上部分1)中准备的小鼠分成5组，包括施用实施例1中制备的酸 枣仁提取物的给药组1和2，和对照组1至3(每组10只小鼠)。

将160mg的实施例1的酸枣仁提取物溶解在4mL的10％Tween 80 (聚氧化乙烯脱水山梨醇单油酸酯：Sigma，U.S.A.)并以100mg/Kg和200 mg/Kg的剂量施用到给药组1和2。同时，将多奈哌齐(Sigma-Aldrich  Chemistry Co.)以5mg/Kg的剂量施用到对照组1，并且将10％Tween 80 以0.15mL的剂量施用到对照组2和3。

在约30分钟后，将溶解在蒸馏水中的东莨菪碱(Sigma-Aldrich  Chemistry Co.)以1mg/Kg的剂量经腹膜内施用到给药组1和2和对照组1 和2(Ebert，U.等，Eur.J.Clin.Invest.，28，pp944-949，1998)，并且将0.9％盐 水溶液经腹膜内施用到对照组3。

在30分钟后，将给药组1和2以及对照组1至3中的小鼠小心地置 于分别分成A、B和C的Y迷宫的三个臂部中的一个上，并且允许其自由 移动，然后记录小鼠进入其中的臂部。此时，仅小鼠的尾巴完全进入臂部 的情况被记录为实验动物进入的臂部，而小鼠进入相同臂部的情况也被记 录。

其中小鼠相继进入三个不同臂的情形给1分(实际交替)。交替行为被 定义为小鼠进入全部三个臂部的情形并且通过以下式1转换为百分数(％) (Sarter，M.等，Psychopharmacology.，94，pp491-495，1998)。

[式1]

(最大交替：总进入-2)

通过上式1转换的交替行为显示在以下表3和图3中，各自表示进入 的总数的总进入显示在以下表4和图4中：

[表3]

[表4]

如由表3和图3可见，施用了实施例1中制备的含斯皮诺素的酸枣仁 提取物的给药组1和2中的交替行为与仅施用了东莨菪碱的对照组2中的 那些相比增加，并且类似于施用了多奈哌齐的对照组1中的那些。此外， 如由表4和图4可见，给药组1和2以及对照组1至3中的总进入都彼此 相似。因此，可见，交替行为的增加不是来自小鼠活动的变化，并因此可 见，实施例1中制备的含斯皮诺素的酸枣仁提取物显著提高了给药组1和 2中的小鼠的记忆和学习能力。

由这些结果可见，实施例1制备的含斯皮诺素的酸枣仁提取物可以有 效地预防或治疗认知损伤如痴呆。

6)实验实施例4：Morris水迷宫试验

准备Morris水迷宫试验设备用于实验。每隔一定间隔将四种标签如星 形，方形，三角形和圆形放在直径为90cm并且高度为45cm的圆形水池 上，并且将高度为29cm的平台放置在星形以下。填充水至距平台0.5cm (水温：21±1℃)并且用色素变模糊以至于从水表面看不到平台。

将以上部分1)中准备的小鼠分成5组，包括施用实施例1制备的酸枣 仁提取物的给药组1和2，以及对照组1至3(每组10只小鼠)。

将160mg的实施例1的酸枣仁提取物溶解在4mL的10％Tween 80 (聚氧化乙烯脱水山梨醇单油酸酯：Sigma，U.S.A.)中并且以100mg/Kg和 200mg/Kg的剂量施用到给药组1和2。同时，将多奈哌齐(Sigma-Aldrich  Chemistry Co.)以5mg/Kg的剂量施用到对照组1，并且将10％Tween 80 以0.15mL的剂量施用到对照组2和3。

在约30分钟后，将溶解在蒸馏水中的东莨菪碱(Sigma-Aldrich  Chemistry Co.)以1mg/Kg的剂量经腹膜内施用到给药组1和2和对照组1 和2(Ebert，U.等，Eur.J.Clin.Invest.，28，pp944-949，1998)，并将0.9％盐水 溶液经腹膜内施用到对照组3。

在30分钟后，测量给药组1和2和对照组1至3中的、在水池的一 个部分中被放下的小鼠到达平台所需的时间，持续60秒。在30分钟后， 测量被重新放置在原来的位置的小鼠到达平台所需的时间，直至60秒。 上述过程重复4次，并且获得平均值。在给药达4天的同时以与在第一天 相同的方式进行实验，不同之处在于第一次放下小鼠的位置改变。

实验结果显示在以下表5和图5中：

[表5]

如表5和图5可见，在第3天和第4天，施用实施例1中制备的含斯 皮诺素的酸枣仁提取物的给药组1和2中的小鼠到达平台所需的时间与仅 施用东莨菪碱的对照组2中的相比分别下降了超过10秒和25秒。特别地， 在给药组2的情况中，小鼠到达平台所需的时间与施用多奈哌齐的对照组 1中的相比减少，表明实施例1中制备的含斯皮诺素的酸枣仁提取物具有 优于多奈哌齐的记忆和学习能力。

制备制剂和食品组合物

制备粉剂

粉剂通过混合20mg的实施例1中制备的含斯皮诺素的酸枣仁提取 物、100mg的乳糖和10mg的滑石并且将该混合物包装在气密袋中制备。

制备片剂

片剂使用实施例1中制备的含斯皮诺素的酸枣仁提取物和以下表6 中显示的成分制备：

[表6]

成分 含量(mg) 酸枣仁提取物(实施例1) 10 玉米淀粉 100 乳糖 100 硬脂酸镁 2

片剂根据用于制备片剂的常规方法通过混合以上成分并且将该混合 物压缩成片来制备。

制备胶囊

[表7]

成分 含量(mg) 酸枣仁提取物(实施例1) 10 晶体纤维素 100 乳糖 100 硬脂酸镁 0.2

胶囊根据用于制备胶囊的常规方法通过混合以上成分并且将该混合 物填充到明胶胶囊中来制备。

制备注射剂

[表8]

成分 含量(mg) 酸枣仁提取物(实施例1) 10 甘露醇 180 注射用无菌蒸馏水 2974 Na₂HPO₄.12H₂O 26

注射剂根据用于制备注射剂的常规方法通过混合以上成分从而制备 溶液并且将该溶液填充到安瓿(2mL)中，之后灭菌来制备。

制备液体制剂

[表9]

成分 含量 酸枣仁提取物(实施例1) 20mg 异构化糖 10g 甘露醇 5g 净化水 85ml

液体制剂根据用于制备液体制剂的常规方法通过将以上成分溶解在 净化水中，添加适量的柠檬香料，向该混合物中添加净化水以制备100ml 的溶液，并且将该溶液装入到褐色瓶中，之后灭菌来制备。

制备保健食品

[表10]

成分 含量 酸枣仁提取物(实施例1) 1000mg 烟酰胺 1.7mg 叶酸 50μg 泛酸钙 0.5mg 硫酸亚铁 1.75mg 氧化锌 0.82mg 碳酸镁 25.3mg 磷酸氢二钾 15mg 磷酸二氢钙 55mg 柠檬酸钾 90mg 碳酸钙 100mg 氯化镁 24.8mg 维生素混合物 适量 矿物质混合物 适量

保健食品组合物根据常规方法，通过根据用于制备健康食品的常规方 法混合以上成分然后制备颗粒来制备。

制备保健饮料

[表11]

成分 含量 酸枣仁提取物(实施例1) 1000mg 柠檬酸 1000mg 寡糖 100g 梅(Japanese apricot)浓缩物 2g 牛磺酸 1g 净化水 总计900mL

保健饮料根据用于制备健康饮料的常规方法通过将以上成分溶解在 净化水中以制备900mL的溶液，在85℃搅拌并加热该溶液达约1小 时，过滤溶液，将溶液装入灭菌的2L瓶中，对瓶子进行密封和灭菌， 并且将瓶子保持在冷藏下。