首页> 中国专利> 一种利用重组菌株转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法

一种利用重组菌株转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法

页面导航

摘要
著录项
法律信息
说明书
相似文献

摘要

一种利用重组菌株转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法，属于生物催化技术领域。本发明通过筛选获得了一株有异亮氨酸双加氧酶活性的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CCTCC NO：M2013373，克隆了其异亮氨酸双加氧酶基因ido，然后构建带有目的基因的重组菌株，通过重组菌催化转化底物L-异亮氨酸得到4-羟基-L-异亮氨酸。本发明得到了双加氧酶基因，且为4-羟基-L-异亮氨酸的获得提供了有效途径，对于今后生物催化剂的开发具有较为重要的意义。

著录项

公开/公告号CN104152505A

专利类型发明专利
公开/公告日2014-11-19

原文格式PDF
申请/专利权人江南大学;
展开▼

申请/专利号CN201410387537.8
发明设计人聂尧;徐岩;
展开▼

申请日2014-08-08
分类号C12P13/04(20060101);C12N15/53(20060101);C12N15/70(20060101);C12N1/21(20060101);C12R1/19(20060101);
代理机构无锡市大为专利商标事务所(普通合伙);
代理人时旭丹;刘品超
地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院
入库时间 2023-12-17 02:24:16

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2016-11-23

授权

授权
2014-12-17

实质审查的生效 IPC(主分类):C12P13/04 申请日:20140808

实质审查的生效
2014-11-19

公开

公开

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用重组菌株转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法，具体涉及一种微生物异亮氨酸双加氧酶及其重组菌转化合成羟基异亮氨酸的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

4-羟基-L-异亮氨酸（4-HIL）的化学结构为：

4-羟基-L-异亮氨酸是一种新型胰岛素分泌促进剂，可用于治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇，因此开发生物催化转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法的研究极有意义。

目前医药领域中用的4-羟基-L-异亮氨酸主要是从植物葫芦巴种子中提取得到的，而关于4-HIL的合成方法则有以下相关报道。

Wang等研究了一种有效的八步合成4-羟基-L-异亮氨酸的方法，其转化总产率为39%，该方法的关键步骤是利用Geotrichum>生物转化2-甲基乙酰乙酸乙酯生成(2S,3R)-2-甲基-3-羟基丁酸已酯，接着将上述反应的产物做不对称斯特雷克尔合成(是一种从α-氨基腈制备α-氨基酸的合成法)。

Rolland-Fulcrand等研究了有六个步骤完全控制立体化学酶合成4-羟基-L-异亮氨酸的方法，该方法最后一步是利用商业化应用的固定化青霉素酰化酶G酶解拆分N-苯乙酰内酯衍生物。

Smirnov等利用4-羟基-3-甲基-2-酮基-戊酸盐醛缩酶和支链氨基酸氨基转移酶的双酶偶联，经过两步反应将乙醛、α-酮基丁酸盐和L-谷氨酸转化生成4-羟基-L-异亮氨酸。

Haefele等发现在葫芦巴种子中4-羟基-L-异亮氨酸的合成过程中有双加氧酶，当有Fe²⁺、α-酮戊二酸、抗坏血酸和氧气存在时，该酶可一步催化合成4-羟基-L-异亮氨酸。

Kodera等从Bacillus>中发现了可一步催化合成4-羟基-L-异亮氨酸的L-异亮氨酸双加氧酶，即L-异亮氨酸羟基化酶，探索该酶催化合成4-羟基-L-异亮氨酸的路线，即，L-异亮氨酸双加氧酶催化底物L-异亮氨酸发生羟基化，生成4-羟基-L-异亮氨酸。

合成4-羟基-L-异亮氨酸的新型路径如下：

Ogawa等筛选得到了一株产L-异亮氨酸双加氧酶的苏云金芽孢杆菌，并对该菌中L-异亮氨酸双加氧酶的酶学性质和生物转化代谢过程进行了研究，进而将L-异亮氨酸双加氧酶基因ido克隆到E.>中进行表达，并从基因水平对表达进行了调控，最终使得L-异亮氨酸双加氧酶催化L-异亮氨酸生产4-羟基-L-异亮氨酸的产率最高达82%。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选L-异亮氨酸双加氧酶的方法，以及含L-异亮氨酸双加氧酶基因重组大肠杆菌全细胞催化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法。

本发明目的不仅仅在于筛选获得L-异亮氨酸双加氧酶，并将其基因克隆表达，构架重组大肠杆菌，该重组菌株应用于全细胞转化L-异亮氨酸制备4-羟基-L-异亮氨酸的反应中，以获得单一产物4-羟基-L-异亮氨酸。

本发明的技术方案：

一、出发菌株的获得：

酶标显色筛选方法：接种针挑取芽孢杆菌单菌落接种到含500 μL发酵培养基（可溶性淀粉4 g/L，酵母提取物4 g/L，麦芽提取物10 g/L，L-异亮氨酸2 g/L，pH 7.0）的96孔酶标板中，37℃、200 rpm振荡培养2 d，然后加入500 μL溶有15 mM氯苯的发酵培养基，用膜包住板，于37℃、200 rpm振荡培养，12h后将板离心，取上清100 μL加入到酶标板孔中，再加入100 μL 0.1 mM HCl，将酶标板于37℃静置30 min，然后分别加入20 μL 1 mM Tris-HCl(pH 8.5)和25 μL 0.4% Gibbs试剂（吉布斯试剂）的乙醇溶液，于室温下反应40 min后，用酶标仪检测在652 nm下的吸光度值。

薄层层析方法：将筛到的芽孢杆菌接种到96孔板中的1 mL发酵培养基中，28℃、200 rpm振荡培养2 d，培养液离心，取上清0.5 μL，分两次点样，进行层析。展开剂各成分体积比例是，正丁醇:醋酸:水= 4:1:0.5；显色剂为0.3%茚三酮(溶于展开剂中)。

以筛选现象最明显的菌株作为出发菌株，出发菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus>）CCTCC NO：M 2013373。

二、4-羟基-L-异亮氨酸的制备：

（1）基因ido的获得：

LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

将枯草芽孢杆菌（Bacillus>）CCTCC NO：M 2013373接种于50 mL LB培养基中于37℃、200 rpm振荡培养24 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)（碧云天公司）提取基因组。

根据已报道的L-异亮氨酸双加氧酶基因 (GenBank Accession No. KC884243.1)，在NCBI上BLAST后，根据相关基因的同源性设计了以下简并引物：引物1：5'-CATGCCATGG AAATGARTGG>STTTAGCA-3'>NcoI>SalI>

PCR反应体系：ddH₂O>

PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min。

用PCR纯化试剂盒(Bioer Technology Co. Ltd)纯化DNA片段。

DNA片段与pMD19-T连接：将外源基因与质粒pMD19-T连接，反应体系组成如下：质粒pMD19-T 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，ddH₂O将体系补足10>

连接后的产物转化至E.>JM109感受态细胞中，得到的阳性质粒pMD19-T-ido的基因测序工作由上海生工生物工程公司完成。

枯草芽孢杆菌（Bacillus>）CCTCC NO：M 2013373 L-异亮氨酸双加氧酶基因ido，其基因的核苷酸序列为：SEQ>

根据上述测序结果，设计以下表达引物：

引物3：5'-CATGCCATGG>AAATGAAAAT GAGTGG-3'，

引物4：5'-ACGCGTCGAC>TTATTTTGTC TCCTTATAAG-3'，

引物3含有NcoI>SalI>

利用质粒提取试剂盒(Omega Bio-Tek)从克隆大肠杆菌中提取质粒pMD19-T-ido。

PCR反应体系：ddH₂O>ido>

PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min。

用PCR纯化试剂盒(Bioer Technology Co. Ltd)纯化目的基因ido片段，保藏备用。

（2）重组质粒的构建：

目的基因及质粒pET28a的酶切：

按照水、缓冲液、PCR产物、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴4h，在管中加入1/10体积的Loading Buffer，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NcoI>SalI>2O将体系补足40>

目的基因与质粒pET28a的连接：

将外源基因与质粒pET28a连接，反应体系组成如下：质粒pET28a 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，ddH₂O将体系补足10>ido。

（3）重组菌株的构建：

在每管的100 μL E.> BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中，冷却2 min。每管中加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 rpm摇床温育培养1 h。培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡纳抗生素的LB平板上，37℃倒置培养。

诱导表达培养：

LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。筛选目的重组菌株E.> BL21(DE3) ( pET28a-ido)。

（4）4-羟基-L-异亮氨酸的制备：利用重组大肠杆菌E.> BL21(DE3) ( pET28a-ido)，催化反应：

LB培养基，以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，卡纳抗生素0.050，固体培养基添加琼脂粉15；

挑取重组菌E.> BL21(DE3) ( pET28a-ido)单菌落接种于3>600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.5>

培养后的重组大肠杆菌细胞10,000 rpm离心10 min并用生理盐水洗涤三次后收集细胞，用50>-1>

以L-异亮氨酸为底物，进行微生物细胞的催化转化反应：2mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 6.0~9.0中，细胞浓度为20%~50%，底物浓度为10~50 mmol/L，α-酮戊二酸的浓度为10~50 mmol/L，FeSO₄·7H₂O的浓度为0.5~2>

反应结束后，将反应混合物离心，取250 μL上清转移到5 mL离心管中，加入250 μL 0.2 M硼酸缓冲液(pH 9.2)，再加入500 μL 2倍过量的芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)乙腈溶液，待衍生化反应完成后加入500 μL与Fmoc-Cl相同浓度的2-氨基金刚烷(ADAM)的乙腈/水(1︰1，V/V)溶液，阻止过量的Fmoc-Cl水解。溶液用0.22>

转化后得到产物4-羟基-L-异亮氨酸。

本发明的有益效果：本发明成功筛选获得了一株有L-异亮氨酸双加氧酶活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus>）CCTCC NO：M 2013373，克隆了其异亮氨酸双加氧酶基因ido，该基因全长723>

将基因ido插入表达载体pET28a中并转化入相应表达宿主E.> BL21(DE3)中成功构建带有目的基因的重组菌株E.> BL21(DE3)( pET-28a-ido)。

重组菌E.> BL21(DE3)( pET-28a-ido)全细胞催化转化L-异亮氨酸在反应10>

通过优化反应体系和反应条件，在30℃过夜温育20%菌体细胞的pH7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入10 mM底物L-异亮氨酸，10 mM α-酮戊二酸，0.5mM>4·7H₂O，10>

本发明得到了双加氧酶基因，且为4-羟基-L-异亮氨酸的获得提供了有效途径，对于今后生物催化剂的开发具有较为重要的意义。

生物材料样品保藏：枯草芽孢杆菌（Bacillus>）BS-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2013373，保藏日期2013年8月8日。

具体实施方式

实施例1诱导表达培养：

LB培养基组成为：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。在培养温度30℃下进行诱导培养。

实施例2诱导表达培养：

LB培养基组成为：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG>

实施例3诱导表达培养：

LB培养基组成为：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡纳抗生素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

实施例4诱导表达培养：

LB培养基组成同实施例1。

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL卡纳抗生素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG>

实施例5诱导表达培养：

LB培养基组成同实施例1。

实施例6诱导表达培养：

LB培养基组成同实施例1。

实施例7

生物转化反应体系为质量浓度20%的菌体细胞，10>-1>-1>-1>4·7H₂O，10>-1 抗坏血酸，50>-1>

实施例8